本發(fā)明屬于環(huán)境分析化學(xué)和生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基于酶提取耦合單顆粒-電感耦合等離子體質(zhì)譜(spICP-MS)技術(shù)快速檢測(cè)植物體內(nèi)納米銀(AgNP)和銀離子(Ag⁺)的方法。

背景技術(shù)：

因具有優(yōu)良、廣譜的抗菌性能，AgNP已經(jīng)被廣泛地用于醫(yī)用噴鼻劑、紡織品、傷口處理繃帶、母嬰用品、洗衣機(jī)等消費(fèi)品中。據(jù)伍德羅·威爾遜國(guó)際學(xué)者中心統(tǒng)計(jì)，目前市場(chǎng)上大約有410種消費(fèi)品含有AgNP，占所有納米材料產(chǎn)品的25.2％(http://www.nanotechproject.org/)。AgNP在制備、使用、廢棄及循環(huán)過程中將不可避免地進(jìn)入到環(huán)境當(dāng)中。植物是陸生生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者，越來越多證據(jù)表明AgNP會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生毒性，包括抑制種子的萌發(fā)和根系伸長(zhǎng)、導(dǎo)致代謝功能紊亂，阻礙光合作用等。相較于AgNP植物毒性研究，從細(xì)胞水平上認(rèn)識(shí)AgNP的植物內(nèi)化、積累、轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)化等問題，直接制約了對(duì)AgNP毒性機(jī)理的認(rèn)識(shí)。因此，為了科學(xué)評(píng)價(jià)AgNP在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程和進(jìn)一步評(píng)價(jià)AgNP的暴露風(fēng)險(xiǎn)，需建立有效地快速測(cè)定植物體基質(zhì)中AgNP和Ag⁺的方法。

環(huán)境樣品中納米顆粒的分析通常受限于極低的環(huán)境濃度和復(fù)雜的環(huán)境基質(zhì)。近年來濁點(diǎn)萃取、場(chǎng)流分離、流體動(dòng)力色譜法、毛細(xì)管電泳與ICP-MS在線聯(lián)用已成功用于AgNP和Ag⁺的分離測(cè)定。但是相關(guān)研究需要先進(jìn)行復(fù)雜的AgNP和Ag⁺的分離操作，隨后才能在線檢測(cè)。這些操作不僅繁瑣、耗費(fèi)人力和時(shí)間，而且還可引入許多人為操作誤差。值得注意的是，這些方法未能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生物樣品中AgNP和Ag⁺的有效測(cè)定。TEM-EDS能夠從拍攝到的電鏡照片中讀取樣品中納米顆粒的粒徑信息，然而它不能適用于低濃度的環(huán)境樣品(ng L^-1-μg L^-1)且不能獲取納米顆粒的顆粒濃度信息。同步輻射相關(guān)技術(shù)(XANES和μ-XRF等)可以分析樣品中AgNP的結(jié)合形態(tài)，提供原子尺度信息，但這項(xiàng)技術(shù)同時(shí)受限于高的濃度檢測(cè)限以及需要長(zhǎng)時(shí)間的數(shù)據(jù)采集和復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理過程。因此，開發(fā)一種快速測(cè)定生物樣品中AgNP和Ag⁺的新方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種測(cè)定植物體內(nèi)納米銀和銀離子的方法，該方法基于Macerozyme R-10酶提取-單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，能夠快速測(cè)定植物樣品中AgNP和Ag⁺。

技術(shù)方案：一種測(cè)定植物體內(nèi)納米銀和銀離子的方法，步驟為：

(1)獲取銀污染植物；

(2)用弱堿TMAH或混合酶Macerozyme R-10進(jìn)行提取AgNP和Ag⁺；

(3)通過單顆粒-電感耦合等離子體質(zhì)譜(spICP-MS)測(cè)定，實(shí)現(xiàn)植物中AgNP顆粒的顆粒濃度、顆粒粒徑分布和Ag⁺的檢測(cè)。

上述TMAH提取AgNP和Ag⁺的步驟為：步驟1)稱取0.1g植物葉片，剪成小塊后置于50mL燒杯中，用80nm的AgNP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)記，使得最終溶液中AgNP的濃度為28,000NPs·mL^-1；步驟2)向標(biāo)記完成的植物葉片中加入10mL 1wt.％的TMAH，水浴超聲24h分散組織并防止AgNP團(tuán)聚，將超聲后的組織懸液移入到離心管離心后過孔徑為1μm的濾膜；步驟3)利用spICP-MS儀器檢測(cè)，型號(hào)為：NexION 300，PerkinElmer，USA；儀器測(cè)定參數(shù)為：ICP-MS操作條件：載氣流速1L min^-1；輔助氣體流速1.2L min^-1；等離子氣流速18L min^-1；ICP無線電頻率能量1600W；模擬階段電壓-2850V；脈沖階段電壓1000V；池入電壓-6V；池出電壓-6V；池桿抵消-14；采樣椎體為鎳；過濾椎體為鎳；進(jìn)樣系統(tǒng)為旋流霧室為Meinhard霧化器；spICP-MS方法參數(shù)為：分析元素Ag；密度10.5g·cm^-3；質(zhì)量106.9amu；滯留時(shí)間0.05ms；穩(wěn)定時(shí)間0ms。

上述Macerozyme R-10酶提取AgNP和Ag⁺的步驟為：步驟1)稱取0.1g植物葉片，剪成小塊后在8mL，2mmol·L^-1，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖溶液中勻漿，之后將80nm的AgNP標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)記到該植物基質(zhì)溶液中，AgNP最終濃度為28,000NPs mL^-1；步驟2)向勻漿液中加入Macerozyme R-10，Macerozyme R-10與植物葉片的質(zhì)量比為1:3，37℃水浴加熱36h進(jìn)行提取，提取結(jié)束后樣品靜置，取上清液過孔徑為1μm的濾膜；步驟3)利用spICP-MS儀器檢測(cè)，儀器型號(hào)為：NexION 300,PerkinElmer,USA；儀器測(cè)定參數(shù)為ICP-MS操作條件：載氣流速1L·min^-1；輔助氣體流速1.2L·min^-1；等離子氣流速18L·min^-1；ICP無線電頻率能量1600W；模擬階段電壓-2850V；脈沖階段電壓1000V；池入電壓-6V；池出電壓-6V；池桿抵消-14；采樣椎體為鎳；過濾椎體為鎳；進(jìn)樣系統(tǒng)為旋流霧室為Meinhard霧化器；spICP-MS方法參數(shù)為：分析元素Ag；密度10.5g·cm^-3；質(zhì)量106.9amu；滯留時(shí)間0.05ms；穩(wěn)定時(shí)間0ms。

上述AgNP粒徑為86nm。

上述植物為水稻。

技術(shù)原理：TMAH是一種水溶性強(qiáng)堿復(fù)合物，能夠穩(wěn)定溶液中的金屬離子。它可用于生物樣品中微量元素檢測(cè)的前處理。與強(qiáng)酸分解不同，TMAH不會(huì)導(dǎo)致有機(jī)物的礦化，而是能夠?qū)⒂袡C(jī)結(jié)合態(tài)金屬釋放到溶液中。在這種背景下，TMAH為實(shí)現(xiàn)從生物樣品中提取納米顆粒和對(duì)應(yīng)的金屬離子，且不對(duì)納米顆粒產(chǎn)生影響提供了可能。

植物細(xì)胞的主要組成成分是一些纖維素、果膠和多聚糖等。Macerozyme R-10是多種酶的混合物，包含纖維素酶、半纖維素酶、和果膠酶，具有消解植物組織細(xì)胞并釋放其中的納米顆粒的潛力。Macerozyme R-10在消解植物樣品過程中，不會(huì)導(dǎo)致納米顆粒的溶解和顆粒尺寸的變化(見圖1)。

spICP-MS的工作原理是：當(dāng)樣品中只有Ag⁺存在時(shí)，溶液體系均一，檢測(cè)器產(chǎn)生的信號(hào)是一個(gè)持續(xù)穩(wěn)定的信號(hào)(背景信號(hào))。而當(dāng)樣品中含有納米顆粒時(shí)，單個(gè)的納米顆粒進(jìn)入到等離子體被離子化，產(chǎn)生“離子云”；“離子云”進(jìn)入四級(jí)桿質(zhì)量分析器，檢測(cè)器檢測(cè)到離子信號(hào)，產(chǎn)生一個(gè)脈沖信號(hào)；納米顆粒越大，含有的原子數(shù)越多，產(chǎn)生的“離子云”中離子的數(shù)量也就越多，相應(yīng)產(chǎn)生的脈沖信號(hào)也就越強(qiáng)；根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度與質(zhì)量的關(guān)系，可以將得到信號(hào)換算成顆粒質(zhì)量，在顆粒形狀已知的情況下，根據(jù)質(zhì)量與體積和密度的公式(m＝ρV)以及體積和粒徑關(guān)系從而得到顆粒的粒徑。檢測(cè)出的背景信號(hào)對(duì)應(yīng)的就是溶液中Ag⁺的濃度信息。spICP-MS工作原理圖詳見圖2。

有益效果：與現(xiàn)有的AgNP和Ag⁺的分析方法相比，本方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜植物基質(zhì)中AgNP顆粒、Ag⁺的快速測(cè)定。在單臺(tái)spICP-MS，同一個(gè)樣品可以同時(shí)完成樣品的顆粒濃度、粒徑分布和溶解性金屬離子的檢測(cè)；

2)檢測(cè)限可以低至ng L^-1，成為環(huán)境樣品納米顆粒檢測(cè)的理想手段；

3)操作簡(jiǎn)單、快速，可批量分析樣品；

4)樣品測(cè)定損失量少。

附圖說明

圖1是TMAH和Macerozyme R-10對(duì)AgNP顆粒粒徑的影響圖；

圖2是spICP-MS同時(shí)完成樣品的AgNP顆粒濃度、粒徑分布和溶解性Ag⁺的檢測(cè)圖；

圖3是spICP-MS對(duì)AgNP的粒徑檢測(cè)限圖；

圖4是植物基質(zhì)中spICP-MS對(duì)AgNP檢測(cè)的原始信號(hào)圖，圖中a和b、c、d分別是植物基質(zhì)中未標(biāo)記AgNP和標(biāo)記30nm、50nm和100nm AgNP(標(biāo)記濃度50,000NPs mL^-1)的儀器信號(hào)圖。

圖5是儀器檢測(cè)到的AgNP顆粒濃度與AgNP理論顆粒濃度的關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過對(duì)比TMAH和Macerozyme R-10兩種提取劑提取植物基質(zhì)中AgNP顆粒，聯(lián)合單顆粒的等離子體質(zhì)譜檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)離析酶R-10的提取效果更為穩(wěn)定可靠。對(duì)比兩種提取方法發(fā)現(xiàn)，Macerozyme R-10提取方法對(duì)AgNP粒徑影響并不顯著，沒有溶出與團(tuán)聚現(xiàn)象發(fā)生，平均粒徑在85.5±1.1nm(圖1)，且顆粒濃度的平均回收率達(dá)到97.9±4.9％(表3)。而TMAH弱堿提取方法引起了AgNP顆粒的溶出和團(tuán)聚，平均粒徑在38.2±4.2nm(圖1)，并且顆粒濃度的平均回收率僅為60.7±8.5％(表3)，由此可見，Macerozyme R-10的提取效果更為穩(wěn)定，所測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。

本發(fā)明中提出了植物基質(zhì)中AgNP和Ag⁺的有效提取與同時(shí)在線測(cè)定，包括樣品中AgNP的提取、AgNP顆粒和Ag⁺的測(cè)定。

實(shí)施例1

TMAH提取AgNP和Ag⁺的步驟為：步驟1)稱取0.1g植物葉片，剪成小塊后置于50mL燒杯中，用80nm的AgNP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)記，使得最終溶液中AgNP的濃度為28,000NPs mL^-1；步驟2)向標(biāo)記完成的植物葉片中加入10mL 1wt.％的TMAH，水浴超聲24h分散組織并防止AgNP團(tuán)聚，將超聲后的組織懸液移入到離心管離心后過孔徑為1μm的濾膜；步驟3)利用spICP-MS儀器檢測(cè)(參數(shù)設(shè)置見表1，結(jié)果見表3和圖1)。

實(shí)施例2

Macerozyme R-10酶提取AgNP和Ag⁺的步驟為：步驟1)稱取0.1g植物葉片，剪成小塊后在8mL，2mmol·L^-1，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖溶液中勻漿，之后將80nm的AgNP標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)記到該植物基質(zhì)溶液中，使得最終溶液中AgNP最終濃度為28,000NPs mL^-1；步驟2)向勻漿液中加入Macerozyme R-10，Macerozyme R-10與植物葉片的質(zhì)量比為1:3，37℃水浴加熱36h進(jìn)行提取，提取結(jié)束后樣品靜置，取上清液過孔徑為1μm的濾膜；步驟3)利用spICP-MS儀器檢測(cè)，(參數(shù)設(shè)置見表1，結(jié)果見表3和圖1)。

實(shí)施例3

a、將0.1g植物葉片(生長(zhǎng)期為四周)切成小片(0.5×0.5cm²)，轉(zhuǎn)移到15mL塑料離心管中。在離心管中加入8mL檸檬酸緩沖液(2mM，pH 6.0)，隨后用組織勻漿機(jī)(28,000rpm，360W；DY89-1，寧波新芝生物科技股份有限公司)勻漿。

b、將上述勻漿液靜置1h后，取上清液作為植物背景基質(zhì)。將80nm AgNP顆粒和Ag⁺標(biāo)記進(jìn)植物基質(zhì)溶液中。

①標(biāo)記AgNP粒徑為80nm，顆粒濃度為80,000NPs mL^-1。

②標(biāo)記Ag⁺濃度為0.261μg L^-1。

c、Macerozyme R-10與(1)中植物樣品按照1:3(質(zhì)量比)混合，在37℃下消解植物樣品36h。

d、將(2)中消解樣品靜置1h，取上清液過孔徑為1μm的濾膜，再進(jìn)行spICP-MS的測(cè)定(參數(shù)設(shè)置見表1，結(jié)果見表4)。

實(shí)施例4

參見實(shí)施例1，區(qū)別在于步驟b中標(biāo)記AgNP條件更換為標(biāo)記30nm AgNP顆粒。標(biāo)記AgNP粒徑為30nm，顆粒濃度分別為35,000NPs mL^-1(參數(shù)設(shè)置見表1，結(jié)果見表4)。

表1儀器測(cè)定條件

表2是spICP-MS顆粒濃度檢測(cè)限的測(cè)定(以80nm AgNP為例)

表3 TMAH和Macerozyme R-10兩種提取劑對(duì)納米顆粒濃度的影響

表4是植物基質(zhì)溶液中AgNP和Ag⁺的檢測(cè)

ND：未檢出

由表4可以看出，Macerozyme R-10酶提取-單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以快速測(cè)定植物樣品中AgNP和Ag⁺。AgNP顆粒粒徑測(cè)定誤差<2nm，AgNP顆粒濃度回收率為99.6-103.7％，Ag⁺回收率為98.2±2.9％。