本發(fā)明涉及維生素檢測技術(shù)，尤其是一種可以同時檢測干血濾紙片中多種維生素的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：維生素(vitamin)是人和動物為維持正常的生理功能而必需從食物中獲得的一類有機(jī)物質(zhì)，在人體生長、代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。機(jī)體缺乏維生素將引起代謝障礙，并發(fā)生各種疾病,這類疾病統(tǒng)稱為維生素缺乏癥。目前，根據(jù)溶解性可將維生素分為脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類，水溶性維生素包括B族維生素、維生素C等；脂溶性維生素包括維生素A、D、E、K等。脂溶性維生素中，維生素A是視網(wǎng)膜中感光細(xì)胞的感光物質(zhì)的主要成分，維生素A缺乏會導(dǎo)致干眼癥，對于成人，維生素A缺乏時易導(dǎo)致夜盲癥；維生素D(VitaminD，VitD)對人類健康特別是兒童健康具有重要意義,VitD缺乏性佝僂病是我國兒童重點(diǎn)防治的四病之一，臨床發(fā)現(xiàn)VitD缺乏性佝僂病除骨骼病變外,同時可影響神經(jīng)、肌肉、造血及免疫等組織器官的功能；維生素E有抗氧化的作用，能防止不飽和脂肪酸的自身氧化，因而有保護(hù)生物膜的功能，使生物膜中的不飽和脂肪酰不致于因氧化變硬，使膜遭到破壞；維生素K對正常的血液凝結(jié)有重要作用,缺乏維生素K會出現(xiàn)血凝緩慢，甚至可導(dǎo)致大出血。水溶性維生素主要包括B族維生素和維生素C等，比如B1(硫胺素)、B2(核黃素)、B5(泛酸)、B6(吡哆醛等)、B12(鈷胺素)、煙酸(尼可酸)、生物素，葉酸等；B族維生素在生物體內(nèi)通過構(gòu)成輔酶而影響物質(zhì)代謝，如在細(xì)胞呼吸中起重要作用。維生素最早期的檢測用于一般的添加食品，如嬰兒配方食品、谷類產(chǎn)品和果汁等。EuropeanDirective2002/46EC制定了一系列關(guān)于食品添加劑標(biāo)識及檢測添加過維生素的食品中標(biāo)注的維生素含量的法規(guī)。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB5413～2010對嬰幼兒配方食品與乳品中維生素含量也有明確的規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)中涉及的方法有微生物法及高效液相色譜法。關(guān)于維生素的檢測，傳統(tǒng)方法為微生物法，其靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，但該方法有許多局限性：整個實(shí)驗(yàn)周期長，批次檢測結(jié)果重復(fù)性差，檢測結(jié)果誤差較大，并且每次只能進(jìn)行單一維生素種類的檢測；而最近，液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使得維生素的檢測進(jìn)入了一個全新的領(lǐng)域，近幾年來串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在國內(nèi)醫(yī)療市場的占有率愈來愈高，使得串聯(lián)質(zhì)譜在臨床疾病的診斷中得到普及。目前國內(nèi)只有針對人體血清的測定單一種類維生素方法，而血清在運(yùn)輸過程中為液體，需要容器裝盛、并且需要使血清穩(wěn)定在一定溫度范圍，這樣，有的容器采用玻璃，其易碎，同時，容器占用的空間較多；而維持血清在一定溫度范圍，需要采購冰箱等恒溫裝置，冰箱也會占用較大空間，由此，運(yùn)輸血清成本太大，并且每次運(yùn)輸?shù)臄?shù)量也很有限。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種可以同時檢測干血濾紙片中多種維生素的方法和試劑盒，該方法具有更高的精密度和準(zhǔn)確度，檢測效率顯著提升，并且成本更低。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種同時檢測干血濾紙片中多種維生素的方法，包括如下步驟：(1)將干血濾紙片標(biāo)本和提取液混合后振蕩孵育，然后離心，取上清液；(2)將步驟(1)所得上清液與流動相和內(nèi)標(biāo)混合液混勻后采用串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測，通過比較維生素和維生素的內(nèi)標(biāo)的離子強(qiáng)度來得出待測血清或待測血漿中維生素的含量。應(yīng)當(dāng)說明的是，本發(fā)明中的串聯(lián)質(zhì)譜法采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀。優(yōu)選地，所述步驟(1)中提取液包括以下體積百分比的組分：84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者提取液包括以下體積百分比的組分：20～79％的乙醇、20～70％的甲醇和1～10％的水。優(yōu)選地，所述步驟(1)中干血濾紙片標(biāo)本的采集方法為：將新鮮全血滴到定量濾紙片上，使血滴分布均勻，濾紙片晾干后密封保存?zhèn)溆谩?yōu)選地，所述步驟(2)中色譜條件：流動相包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；或者流動相包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；或者流動相包括以下體積百分比的組分：49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；探針洗液是體積濃度為50～80％的乙腈水溶液，或者探針洗液是體積濃度為50～80％的甲醇水溶液。應(yīng)當(dāng)說明的是，探針洗液的作用在于平衡測定前后流動相、輔助測定、清洗探針、以及避免前樣本對后樣本測定的影響。同時，本發(fā)明還提供了一種同時檢測干血濾紙片中多種維生素的試劑盒，包括：內(nèi)標(biāo)混合液、提取液、流動相和探針洗液。優(yōu)選地，所述提取液包括以下體積百分比的組分：84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者提取液包括以下體積百分比的組分：20～79％的乙醇、20～70％的甲醇和1～10％的水。優(yōu)選地，所述流動相包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；或者流動相包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；或者流動相包括以下體積百分比的組分：49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種。優(yōu)選地，所述探針洗液是體積濃度為50～80％的乙腈水溶液，或者探針洗液是體積濃度為50～80％的甲醇水溶液。優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)混合液包括維生素B1內(nèi)標(biāo)、葉酸內(nèi)標(biāo)、維生素A內(nèi)標(biāo)、25羥基維生素D2內(nèi)標(biāo)、25羥基維生素D3內(nèi)標(biāo)、維生素E內(nèi)標(biāo)和維生素K1內(nèi)標(biāo)。綜上所述，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明的方法通過電壓將維生素分子裂解成不同質(zhì)荷比的子離子，掃描不同質(zhì)荷比的子離子數(shù)量，參考已知維生素內(nèi)標(biāo)的濃度，計(jì)算出待測維生素濃度，能同時檢測干血濾紙片中水溶性維生素和脂溶性維生素的含量，為國內(nèi)首例，采用本發(fā)明的方法和試劑盒檢測維生素，精密度和準(zhǔn)確度更高，并且易于運(yùn)輸待測標(biāo)本，成本更低；(2)本發(fā)明的方法可從干血濾紙片將多種水溶性和脂溶性維生素提取出來，利用串聯(lián)質(zhì)譜儀在2～3min內(nèi)對1個標(biāo)本中十余種維生素同時進(jìn)行定量，通過分析可以對人體內(nèi)維生素水平進(jìn)行評價和監(jiān)測，從而對維生素相關(guān)疾病進(jìn)行診斷和治療效果評估，檢測周期顯著縮短；(3)本發(fā)明的方法用定量濾紙將臨床采集的全血樣本制成干血濾紙片樣本，干血濾紙片易于對微量標(biāo)本定量，正好配合靈敏度極高的串聯(lián)質(zhì)譜方法，并且干血濾紙片易于保存和運(yùn)輸，其中的提取液可直接使干血濾紙片樣本中的蛋白變性,避免了液體標(biāo)本去蛋白的繁瑣步驟。附圖說明圖1為實(shí)施例1所得總離子圖；圖2為實(shí)施例1所得掃描后各成分的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1同時檢測干血濾紙片中多種維生素的方法一、主要實(shí)驗(yàn)步驟：(1)準(zhǔn)備內(nèi)標(biāo)工作液：采用美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室提供的各種維生素的同位素內(nèi)標(biāo)及濃度；依據(jù)當(dāng)次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量計(jì)算內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的量。將上述各種內(nèi)標(biāo)混合得到高濃度內(nèi)標(biāo)混合液，使用時，按1:100比例采用流動相將高濃度內(nèi)標(biāo)混合液稀釋，注意充分混勻即可得到內(nèi)標(biāo)工作液。(2)待測標(biāo)本采集：取新鮮全血滴到定量濾紙片上，使血滴自然分布均勻，懸掛晾干不小于4個小時，得到干血濾紙片標(biāo)本，密封保存于2～8℃?zhèn)溆谩?3)分析過程：1、取干血濾紙片標(biāo)本，用打孔鉗打取3.2毫米直徑的血斑10～20個放入離心管，加入提取液200～500微升，27～30℃下650～750rpm振頻振蕩孵育45分鐘；2、離心后取所有上清液加入96孔板中，用氮?dú)獯蹈蓛x吹干，另取100微升流動相復(fù)溶，同時加入混合的內(nèi)標(biāo)工作液50微升，覆上鋁箔封膜減少揮發(fā)，振蕩混勻；3、將96孔板放入串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)自動進(jìn)樣器中，啟用應(yīng)用軟件，建立樣品列表，選擇正確的內(nèi)標(biāo)濃度文件和采集方法，以檢測干血濾紙片中多種維生素的含量。(4)結(jié)果計(jì)算：串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)中軟件可以將檢測結(jié)果通過比較分析物和內(nèi)標(biāo)的離子強(qiáng)度來進(jìn)行計(jì)算，給出各維生素的濃度并生成數(shù)據(jù)報告。(5)注意事項(xiàng)：1、同位素標(biāo)準(zhǔn)品用完之后應(yīng)立即放入2～8℃冰箱保存；2、使用鋁箔包裹微孔板時，必須包緊；3、如果試劑已經(jīng)從試劑瓶倒出，不能再次使用。二、主要試劑：本實(shí)施例用到的試劑包括提取液，流動相和探針洗液，本實(shí)施例中的具體試劑配方為：(1)內(nèi)標(biāo)：選用美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室提供的各維生素的同位素內(nèi)標(biāo)及濃度，如下表所示：名稱商品英文名稱濃度維生素B1內(nèi)標(biāo)Thiamine～d3Hydrochloride30nmol/L葉酸內(nèi)標(biāo)FolicAcid～d24nmol/L維生素A內(nèi)標(biāo)VitaminA～d5Acetate1.5μmol/L25羥基維生素D2內(nèi)標(biāo)25～HydroxyvitaminD2～[d6]10nmol/L25羥基維生素D3內(nèi)標(biāo)25～HydroxyvitaminD3～～[d6]30nmol/L維生素E內(nèi)標(biāo)α～Tocopherol～d66μg/mL維生素K1內(nèi)標(biāo)VitaminK1～[d7])1.5ng/mL(2)提取液：采用以下配方中的一個：配方一：按照體積百分比包括組分：84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方二：按照體積百分比包括組分：20～79％的乙醇、20～70％的甲醇和1～10％的水。(3)流動相：流動相的選擇有三種配方，可分別與兩種提取液配方交叉組合，以下三種不同配方對最后的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度沒有影響。配方一：包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘；配方二：包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘；配方三：包括以下體積百分比的組分：49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘。(4)探針洗液：1、50～80％的乙腈水溶液；2、50～80％的甲醇水溶液。(5)注意事項(xiàng)：1、公示的提取液和流動相中乙腈，水，甲酸，及甲醇的比例可在相應(yīng)范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，同時須在質(zhì)譜儀上進(jìn)行相應(yīng)參數(shù)的調(diào)整，這樣，所檢測的維生素含量結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度不受影響；2、所有試劑均選用色譜級別；3、配置所用水選用三蒸水或純水機(jī)過濾的超純水，其電阻≥18MΩ或電導(dǎo)<5us/cm，PH值為7.0±0.2；4、根據(jù)上述提取液和流動相配方在串聯(lián)質(zhì)譜儀器watersTQD型號和AB3200型號上各維生素的母離子、子離子及質(zhì)譜條件。三、質(zhì)譜參數(shù)：根據(jù)提取液和流動相配方，在串聯(lián)質(zhì)譜儀器watersTQD上的設(shè)置參考用質(zhì)譜條件如下表:根據(jù)提取液和流動相配方在串聯(lián)質(zhì)譜儀器AB3200上的設(shè)置的參考質(zhì)譜條件如下表：需要注意的是，上述參數(shù)中母離子固定，針對不同的機(jī)器或同一品牌機(jī)器質(zhì)譜參數(shù)變化時，子離子有可能會發(fā)生變化。其中，液相泵梯度及質(zhì)譜儀條件如下表：需要注意的是，由于每臺機(jī)器在裝機(jī)調(diào)試時，機(jī)器的精密度等不同，以上參數(shù)僅供參考，具體調(diào)試參數(shù)由工程師做少許改動。如圖1所示的通過本實(shí)施例的方法所得的總離子圖，橫坐標(biāo)代表時間，縱坐標(biāo)代表總離子數(shù)量，該圖表示所有待測離子總的掃描離子數(shù)量，通過該圖可以判斷總離子數(shù)量是否達(dá)到檢測要求，如果沒有達(dá)到檢測要求，對結(jié)果準(zhǔn)確性會帶來影響。如圖2所示的通過本實(shí)施例的方法所得的掃描后各成分的質(zhì)譜圖，橫坐標(biāo)代表母離子的質(zhì)荷比(實(shí)時的監(jiān)測數(shù)，沒有按大小排列)，縱坐標(biāo)代表離子強(qiáng)度，該圖表示不同檢測物質(zhì)的離子數(shù)量，通過該圖可以計(jì)算待測維生素濃度。實(shí)施例2同時檢測干血濾紙片中多種維生素的試劑盒根據(jù)血樣本的不同分別設(shè)定試劑配比和串聯(lián)質(zhì)譜條件，本實(shí)施的試劑盒可以一次性測出11水溶性和7中脂溶性維生素，可以測出的維生素如下表所示：水溶性維生素脂溶性維生素?zé)熕岚肪S生素A煙酸維生素D2維生素B1維生素D3維生素B225-羥基維生素D2鹽酸吡哆醇25-羥維基生素D3鹽酸吡哆胺維生素E鹽酸吡哆醛維生素K1葉酸泛酸生物素維生素B12本實(shí)施例的試劑盒包括：內(nèi)標(biāo)混合液、提取液、流動相和探針洗液，內(nèi)標(biāo)混合液中包括內(nèi)標(biāo)品，內(nèi)標(biāo)品采用美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室提供的各種維生素的同位素內(nèi)標(biāo)及其濃度，提取液和流動相可相互交叉搭配使用。(1)內(nèi)標(biāo)混合液的使用：采用美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室提供的各種維生素的同位素內(nèi)標(biāo)及濃度，將各種內(nèi)標(biāo)混合得到高濃度內(nèi)標(biāo)混合液，在使用時，用流動相按照所需的比例將高濃度內(nèi)標(biāo)混合液稀釋，并且充分混勻得到內(nèi)標(biāo)工作液。(2)流動相的選擇有三種配方，可分別與兩種提取液配方交叉組合，這三種不同配方對最后的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度沒有影響，流動相采用以下配方中的一個：配方一：包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘；配方二：包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘；配方三：包括以下體積百分比的組分：49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘。(3)提取液采用以下配方中的一個：配方一：按照體積百分比包括組分：84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方二：按照體積百分比包括組分：20～79％的乙醇、20～70％的甲醇和1～10％的水。(4)探針洗液：可采用以下其中一種：1.50～80％的乙腈水溶液；2.50～80％的甲醇水溶液。實(shí)施例1的方法配合國內(nèi)常用的串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB公司和美國WATERS公司的MS/MS測定儀)以及實(shí)施例2的試劑盒，能通過一次實(shí)驗(yàn)同時檢測干血濾紙片中多種水溶性維生素和脂溶性維生素，檢測結(jié)果具有很高的精確度和準(zhǔn)確度。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3