一種百子蓮高頻再生體系建立的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種百子蓮高頻再生體系建立的方法，將百子蓮幼小花蕾清洗分裝，用75%濃度乙醇溶液浸泡30s，0.1%濃度升汞水溶液中振蕩滅菌10min，水沖洗，濾紙吸干花蕾表面水分；花蕾對半切割開接種至添加有6-芐氨基腺嘌呤、吲哚丁酸和奈乙酸的MS為誘導培養(yǎng)基中30d形成不定芽；不定芽以每叢3-4個單芽的方式接種至添加有6-芐氨基腺嘌呤、奈乙酸和赤霉素的MS增殖培養(yǎng)基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩綠的叢生芽；叢生芽切割后成單芽接種至含有萘乙酸和吲哚丁酸的1/2MS的生根培養(yǎng)基中，30d后形成根；將生根的植株移栽至由泥炭和珍珠巖組成的基質中。本發(fā)明的有益效果是百子蓮的種苗產量高。
【專利說明】—種百子蓮高頻再生體系建立的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)領域，涉及一種百子蓮高頻再生體系建立的方法。
【背景技術】
[0002]百子蓮(Agapanthus praecox ssp.)是原產于南非的多年生根莖類花丼,又名非洲百合、百子蘭、藍花君子蘭、紫穗蘭等，素有“愛情之花”的美譽，目前研究者對其分類地位還不統(tǒng)一，曾被歸為百合科(Liliaceae)、蔥科(Alliaceae)或石蒜科(Amaryllidaceae)的亞科(Agapanthoideae),近期還有學者將其單獨歸為一科一非洲百合科(Agapanthceae)。百子蓮植株秀麗，葉色濃綠，花莖挺立，花型優(yōu)雅，花色淡雅，不但是非常理想的地被和花境植物材料，而且也是很好的鮮切花材料，同時也可用作藥用成分的提取，目前已成功應用在上海世博綠化景觀，這必將在上海及周邊城市綠化景觀上起到示范效應，市場對百子蓮需求將逐步加大，開發(fā)前景廣闊。我國于2000年對百子蓮進行引種栽培，栽培研究發(fā)現(xiàn)，百子蓮多數(shù)不結果或種子不能萌芽或分化嚴重，而且播種繁殖需要3-6年的精心養(yǎng)護才能正常開花；分株繁殖，則繁殖速度緩慢、繁殖系數(shù)低，且小苗生長不快；而組織培養(yǎng)的方法則可大大加快百子蓮的繁殖速度，縮短繁殖的周期。百子蓮屬植物引入我國時間不長，對其組培技術的報道比較少見，僅見康玲以百子蓮的根莖部和葉片為外植體進行組培研究，但未獲得生根。而且用現(xiàn)有的方法生產百子蓮種苗產量不足，難以滿足市場需求的現(xiàn)狀。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明 的目的在提供一種百子蓮高頻再生體系建立的方法，解決了現(xiàn)有的方法生產百子蓮種苗產量不足，難以滿足市場需求的現(xiàn)狀的問題。
[0004]本發(fā)明所采用的技術方案是按照以下步驟進行:
[0005](I)將百子蓮幼小花蕾采集后帶回實驗室，洗潔精清洗4min，用清水沖凈，將清洗干凈的花蕾每個培養(yǎng)瓶分裝，用75%濃度乙醇溶液浸泡30s，0.1%濃度升汞水溶液中振蕩滅菌lOmin，水沖洗，濾紙吸干花蕾表面水分；
[0006](2)將經過步驟(1)處理的花蕾對半切割開接種至添加有6-芐氨基腺嘌呤、吲哚丁酸和奈乙酸的MS為誘導培養(yǎng)基中30d形成不定芽；
[0007](3)將不定芽以每叢3-4個單芽的方式接種至添加有6-芐氨基腺嘌呤、奈乙酸和赤霉素的MS增殖培養(yǎng)基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩綠的叢生芽；
[0008](4)將平均葉長為2.0cm左右的叢生芽切割后成單芽接種至含有萘乙酸和吲哚丁酸的1/2MS的生根培養(yǎng)基中，30d后形成根；
[0009](5)將生根的植株移栽至由泥炭和珍珠巖組成的基質中。
[0010]本發(fā)明的特點還在于步驟(1)中百子蓮幼小花蕾采集的時間是6月份，花蕾在形成I周之內，所述步驟(2)中誘導培養(yǎng)基中添加6-芐氨基腺嘌呤2.5mg.L'奈乙酸0.1mg.L'吲哚丁酸0.3mg.L—1，蔗糖3%。在步驟(3)中增殖培養(yǎng)基為MS且添加有6-芐氨基腺嘌呤2.5mg.L—1、奈乙酸0.25mg.L—1、赤霉素0.05mg.L-1、蔗糖3% ^MS且添加6-芐氨基腺嘌呤3.5mg.171、奈乙酸0.25mg.L'赤霉素0.1Omg.L'鹿糖3%的兩種培養(yǎng)基中交替培養(yǎng),可獲得6.02的增殖倍數(shù)和生長粗壯的不定芽叢。在步驟(4)中生根培養(yǎng)基為1/2MS且培養(yǎng)基中添加吲哚丁酸0.5mg.L'奈乙酸0.5mg.L—1，蔗糖1.5%。步驟(5)中移栽基質泥炭與珍珠巖的比例為3:1。
[0011]本發(fā)明的有益效果是百子蓮的種苗產量高。
【具體實施方式】
[0012]本發(fā)明的【具體實施方式】如下步驟:
[0013]步驟1:試驗材料和處理方法；試驗材料:選取百子蓮花蕾為外植體，在6月期間，將形成一星期之內的百子蓮幼小花蕾連同花梗采收。材料處理方法:先對花蕾進行表面清洗，清洗液可選用洗潔精等，后用清水沖洗4~5次。將清洗干凈的花蕾按照每個培養(yǎng)瓶20個進行分裝，然后在超凈工作臺用75%濃度乙醇溶液浸泡30s取出，0.1%濃度升汞水溶液中進行振蕩滅菌lOmin，無菌水沖洗5~6遍，消毒濾紙吸干花蕾表面水分，進行下一步。
[0014]步驟2:組織培養(yǎng)和植株再生試驗方法；不定芽誘導培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化:將經過滅菌處理的花蕾對半切割開接種至以MS為培養(yǎng)基附加不同6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)、NAA(吲哚丁酸)、IBA (奈乙酸)9種誘導培養(yǎng)基，9種誘導培養(yǎng)基中，6-BA、NAA、IBA與水的濃度分別如表1中所示的Al~A9。采用L9(34)正交試驗設計，每種誘導培養(yǎng)基每升接種25~50個花蕾。按每種每升25瓶的規(guī)格分裝到培養(yǎng)瓶內，照常規(guī)的高壓消毒方法進行滅菌，誘導培養(yǎng)基基中添加白糖為3%，瓊脂粉6.5g.L_S pH值在滅菌后調至6.0。定期觀察并記錄花蕾生長情況，30d (d代表天數(shù))后統(tǒng)計花蕾生長及不定芽的形成情況。培養(yǎng)室內控制溫度25±1° C，光照為40 μ mo 1.m^2.s—1，光照時間為每天14h。
[0015]步驟3:增殖培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化:將上一步在誘導培養(yǎng)基中形成的不定芽叢以每叢3~4個單芽的方式接種至以MS為基本培養(yǎng)基且添加有不同濃度的9種6-BA、NAA、GA3形成的增殖培養(yǎng)基中，其中6-BA、NAA、GA3濃度如表2所示中的BI~B9，采用L9 (34)正交試驗設計，照常規(guī)的高壓消毒方法進行滅菌，30d后統(tǒng)計不定芽的生長和增殖狀況。添加白糖為3%，瓊脂粉6.5g.L_S pH值在滅菌后調至6.0。培養(yǎng)室內控制溫度25± 1°C，光照為40ymOl.m_2.s—1，光照時間為每天14h，生成叢生芽，其增殖倍數(shù)最高可達6.02。
[0016]步驟4:生根培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化:以各元素減半的1/2MS添加有不同濃度的IBA、NAA做為生根培養(yǎng)基，將平均葉長為2.0cm左右、長勢良好增殖形成的叢生芽用解剖刀切割后成單芽接種至其中，IBA、NAA水溶液濃度為如表3所示的SI~S9，采用L9 (34)正交試驗設計，照常規(guī)的高壓消毒方法進行滅菌，SI~S9每種接種40株待生根的百子蓮組培苗，試驗重復3次。30天后統(tǒng)計生根苗數(shù)、生根率、平均根條數(shù)和苗高。生根培養(yǎng)基中還添加白糖為1.5%，瓊脂粉6.Sg^LlpH值在滅菌后調至6.0。培養(yǎng)室內控制溫度25± 1°C，光照為40 μ mo 1.m-2.s'光照時間為每天14h。
[0017]步驟5:將上一步中生長出根的組培苗移栽，組培苗移栽基質篩選:移栽基質為蛭石:草炭:珍珠巖=1:3:1 ;1個月后移栽成活率可達到100%。
[0018]對本發(fā)明的方法進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計:所有的試驗都進行3次或3次以上的重復，增殖倍數(shù)=形成不定芽總數(shù)/接入不定芽總數(shù)。采用Spss軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及Duncan法進行多重比較。[0019]結果與分析，誘導培養(yǎng)基、誘導條件的選擇和優(yōu)化對不定芽誘導的影響:百子蓮花蕾在誘導培養(yǎng)基中IOd后開始膨大，15d后花蕾開始展開，20d后花瓣開始枯萎，部分子房膨大轉綠并直接形成少量芽點，30d后芽點逐漸長大葉子伸長。表1結果可知，百子蓮花蕾子在Al~A9增殖培養(yǎng)基中均可以誘導形成不定芽，進一步分析可知培養(yǎng)基添加的NAA濃度為麵.lmg.L-1時，不定芽的誘導率顯著高于其他培養(yǎng)基，達到顯著差異。這說明恰當?shù)腘AA濃度是獲得百子蓮不定芽高頻誘導的重要條件，同時本實驗中添加適量的IBA既可以
提高誘導率也可以直接形成不定芽，較好的保持了植物材料的優(yōu)良遺傳特性。
[0020]
【權利要求】
1.一種百子蓮高頻再生體系建立的方法，其特征在于:按照以下步驟進行: (1)將百子蓮幼小花蕾采集后帶回實驗室，洗潔精清洗4min，用清水沖凈，將清洗干凈的花蕾每個培養(yǎng)瓶分裝，用75%濃度乙醇溶液浸泡30s，0.1%濃度升汞水溶液中振蕩滅菌lOmin，水沖洗，濾紙吸干花蕾表面水分； (2)將經過步驟(1)處理的花蕾對半切割開接種至添加有6-芐氨基腺嘌呤、吲哚丁酸和奈乙 酸的MS為誘導培養(yǎng)基中30d形成不定芽； (3)將不定芽以每叢3-4個單芽的方式接種至添加有6-芐氨基腺嘌呤、奈乙酸和赤霉素的MS增殖培養(yǎng)基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩綠的叢生芽； (4)將平均葉長為2.0cm左右的叢生芽切割后成單芽接種至含有萘乙酸和吲哚丁酸的1/2MS的生根培養(yǎng)基中，30d后形成根； (5)將生根的植株移栽至由泥炭和珍珠巖組成的基質中。
2.按照權利要求1所述一種百子蓮高頻再生體系建立的方法，其特征在于:所述步驟(O中百子蓮幼小花蕾采集的時間是6月份，花蕾在形成I周之內，所述步驟(2)中誘導培養(yǎng)基中添加6-芐氨基腺嘌呤2.5mg.L—1、奈乙酸0.lmg.L—1、吲哚丁酸0.3mg.L—1，蔗糖3%。
3.按照權利要求1所述一種百子蓮高頻再生體系建立的方法，其特征在于:所述在步驟(3)中增殖培養(yǎng)基為MS且添加有6-芐氨基腺嘌呤2.5mg.L_\奈乙酸0.25mg.L'赤霉素0.05mg.L-1、蔗糖3% ;或MS且添加6-芐氨基腺嘌呤3.5mg.L'奈乙酸0.25mg.L—1、赤霉素0.1Omg.L_\蔗糖3%的兩種培養(yǎng)基中交替培養(yǎng)，可獲得6.02的增殖倍數(shù)和生長粗壯的不定芽叢。
4.按照權利要求1所述一種百子蓮高頻再生體系建立的方法，其特征在于:所述在步驟(4)中生根培養(yǎng)基為1/2MS且培養(yǎng)基中添加吲哚丁酸0.5mg.L'奈乙酸0.5mg.L—1，蔗糖1.5%。
5.按照權利要求1所述一種百子蓮高頻再生體系建立的方法，其特征在于:所述步驟(5)中移栽基質泥炭與珍珠巖的比例為3:1。
【文檔編號】A01H4/00GK103947548SQ201410144190
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權日:2014年4月11日
【發(fā)明者】王志龍, 何月秋, 張椿芳, 林立 申請人:寧波城市職業(yè)技術學院