專利名稱：一種快速直接建立合歡再生植株體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的植物組織培養(yǎng)技術(shù)；特別涉及一種快速 直接建立合歡再生植株體系的方法。用于木本植物合歡快速繁殖、轉(zhuǎn)基因 及再生植株體系建立的生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在木本植物合歡再生植株體系建立中，存在著難以快速直接獲得再生 植株的難題，快速直接建立合歡再生植株體系對(duì)于減少母本植株應(yīng)用數(shù)量、 降低種苗生產(chǎn)成本具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速直接建立合歡再生植株 體系的方法。建立了一套高效、可靠、重復(fù)性好的合歡高頻植株再生系統(tǒng)， 達(dá)到減少母本植株應(yīng)用數(shù)量、降低種苗生產(chǎn)成本。 本發(fā)明的技術(shù)方案是
一種快速直接建立合歡再生植株體系的方法，其特征在于將合歡種 子經(jīng)表面消毒后無(wú)菌播種于培養(yǎng)基上， 一周左右，切取無(wú)菌播種苗下胚軸 置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立高頻再生系統(tǒng)，將直 接分化出的不定芽誘導(dǎo)生根，移栽。
1) 植物組織培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下實(shí)施；其過(guò)程包括
2) 將合歡種子經(jīng)表面消毒后無(wú)菌播種于培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)一周后，切取
無(wú)菌播種苗下胚軸置于誘導(dǎo)與分化合一的U801培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立高 頻再生系統(tǒng)；
3) 將直接分化出的不定芽與植株進(jìn)行誘導(dǎo)生根，移栽。
快速直接建立合歡再生植株體系的方法是利用合歡種子無(wú)菌播種苗下 胚軸置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立高頻再生系統(tǒng)，
將直接分化出的不定芽誘導(dǎo)生根、移栽的方法，其特征在于 植物組織培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下實(shí)施；其過(guò)程包括1) 將合歡種子在500 800倍多菌靈溶液中浸泡20min,用自來(lái)水沖 洗干凈后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用0.1X的升汞溶液浸泡8min，溶液中加2滴 吐溫-80，通過(guò)磁棒攪動(dòng)或不斷震蕩搖動(dòng)，無(wú)菌水沖洗5 6次后，用鑷子 將種子直接播種于無(wú)激素的培養(yǎng)基上。
2) 將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室中的溫度為25土rc、 光照條件2000 25001ux; 14h/d光照；
3) 3 4天后，種子萌發(fā)，第5 7天，取出無(wú)菌播種苗，切取下胚軸 長(zhǎng)2cm左右，每段0. 5 lcm置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上進(jìn)行 離體培養(yǎng)。
4) 將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室中的條件與2)相同；
5) 從10 12天開始，外植體膨大并形成愈傷組織，16天后愈傷組織 變綠并長(zhǎng)出芽點(diǎn)，30天左右芽點(diǎn)長(zhǎng)出小植株。
6) 45 50天后，將直接分化出的不定芽與植株進(jìn)行誘導(dǎo)生根，移栽。
7) 接種后日常管理將培養(yǎng)材料置于滿足植物組織培養(yǎng)的溫度(25± 1 。C)、光照條件(2000 25001ux) (16h/d光照)的房間或設(shè)施(如溫室)內(nèi) 進(jìn)行培養(yǎng)。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn) 本發(fā)明解決了木本植物合歡再生植株體系建立中難以快速直接獲得再生 植株的難題，建立了一套高效、可靠、重復(fù)性好的合歡高頻植株再生系統(tǒng)， 該方法獨(dú)特且簡(jiǎn)單實(shí)惠，應(yīng)用價(jià)值高。
針對(duì)木本植物合歡再生植株體系建立中難以快速直接獲得再生植株的 問(wèn)題，發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究工作，最終獲得了利用合歡種子無(wú)菌播種 苗下胚軸置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立高頻再生系 統(tǒng)，將直接分化出的不定芽誘導(dǎo)生根、移栽的方法，從而在短時(shí)間內(nèi)大量 獲得合歡再生植株，建立試管苗的無(wú)菌繁殖體系，進(jìn)而為木本植物合歡快速 繁殖、再生植株體系建立及轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)保障。
本發(fā)明旨在提供一種木本植物合歡再生植株體系建立中難以快速直接 獲得再生植株的問(wèn)題的方法；通過(guò)該方法在短時(shí)間內(nèi)大量獲得無(wú)菌再生植 株，為木本植物合歡快速繁殖、再生植株體系建立及轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究提供 了物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)方法。
1.該技術(shù)具有獨(dú)特且簡(jiǎn)單實(shí)惠、重復(fù)性強(qiáng)、應(yīng)用價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)；將其 應(yīng)用到木本植物合歡轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究、快速繁殖及再生植株體系建立提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和最佳的技術(shù)方法。它能在較短的時(shí)間內(nèi)大量獲得無(wú)菌再生植 株，可以節(jié)約大量時(shí)間和人力和經(jīng)費(fèi)，具有很好的實(shí)際應(yīng)用效果。
2.本方法利用合歡種子無(wú)菌播種苗下胚軸置于誘導(dǎo)與分化合一的
TJ801培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立高頻再生系統(tǒng)，將直接分化出的不定芽誘導(dǎo)
生根、移栽，從而在短時(shí)間內(nèi)大量獲得合歡再生植株，建立試管苗的無(wú)菌
繁殖體系的方法；與國(guó)內(nèi)目前大多數(shù)人所采用的傳統(tǒng)常規(guī)再生植株體系建 立的方法相比，可以較好地解決了合歡組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因中再生植株體系 難以快速直接獲得的問(wèn)題。利用此方法，1個(gè)月至1個(gè)半月就能大量獲得 合歡再生植株，植株再生率可以達(dá)到65 70%。


圖1是合歡組織培養(yǎng)無(wú)菌植株再生體系獲得的方法技術(shù)路線圖
具體實(shí)施例方式
如圖1所示一種快速直接建立合歡再生植株體系的方法是利用合歡種 子無(wú)菌播種苗下胚軸置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立 高頻再生系統(tǒng)，將直接分化出的不定芽誘導(dǎo)生根、移栽，從而在短時(shí)間內(nèi)
大量獲得合歡再生植株，建立試管苗的無(wú)菌繁殖體系的方法，其特征在于 植物組織培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下實(shí)施；其過(guò)程包括將合歡種子無(wú)菌消 毒后，將種子直接播種于無(wú)激素的培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)芽； 種子萌發(fā)第5 7天后，取無(wú)菌播種苗下胚軸接種于誘導(dǎo)與分化合一的 TJ801培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)；外植體膨大并形成愈傷組織、愈傷組織變 綠并長(zhǎng)出芽點(diǎn)及小植株；將分化出的不定芽與植株進(jìn)行誘導(dǎo)生根，移栽。 本發(fā)明較好地解決了合歡組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因中再生植株體系難以快速直接 獲得的問(wèn)題，從而形成了一種簡(jiǎn)單、易行且在無(wú)菌條件下短時(shí)間內(nèi)大量獲 得合歡再生植株，建立試管苗的無(wú)菌繁殖體系的方法。 下面通過(guò)具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)介紹本發(fā)明；
實(shí)施例1
1)將合歡種子在500 800倍多菌靈溶液中浸泡20min，用自來(lái)水沖 洗干凈后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用O. 1X的升汞溶液浸泡8min，溶液中加2滴 吐溫-80，通過(guò)磁棒攪動(dòng)或不斷震蕩搖動(dòng)，無(wú)菌水沖洗5 6次后，用鑷子 將種子直接播種于無(wú)激素的培養(yǎng)基上。2) 將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室中迸行培養(yǎng)，培養(yǎng)室中的溫度為25±rc、
光照條件2000 25001ux; 14h/d光照;
3) 3 4天后，種子萌發(fā)，第5 7天，取出無(wú)菌播種苗，切取下胚軸 長(zhǎng)2cm左右，每段0. 5 lcm置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上進(jìn)行 離體培養(yǎng)。
4) 將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室中的條件與2)相同；
5) 從10 12天開始，外植體膨大并形成愈傷組織，16天后愈傷組織 變綠并長(zhǎng)出芽點(diǎn)，30天左右芽點(diǎn)長(zhǎng)出小植株。
6) 45 50天后，將直接分化出的不定芽與植株進(jìn)行誘導(dǎo)生根，移栽。
7) 接種后日常管理將培養(yǎng)材料置于滿足植物組織培養(yǎng)的溫度(25± 1 °C)、光照條件(2000 25001ux)(16h/d光照)的房間或設(shè)施(如溫室)內(nèi) 進(jìn)行培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1、一種快速直接建立合歡再生植株體系的方法，其特征在于將合歡種子經(jīng)表面消毒后無(wú)菌播種于培養(yǎng)基上，一周左右，切取無(wú)菌播種苗下胚軸置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立高頻再生系統(tǒng)，將直接分化出的不定芽誘導(dǎo)生根，移栽1)植物組織培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下實(shí)施；其過(guò)程包括2)將合歡種子經(jīng)表面消毒后無(wú)菌播種于培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)一周后，切取無(wú)菌播種苗下胚軸置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立高頻再生系統(tǒng)；3)將直接分化出的不定芽與植株進(jìn)行誘導(dǎo)生根，移栽。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速直接建立合歡再生植株體系的方法，其特 征在于-1) 將合歡種子在500 800倍多菌靈溶液中浸泡20min，用自來(lái)水沖洗干 凈后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用0. 1%的升汞溶液浸泡8 min，溶液中加2滴吐溫-80， 通過(guò)磁棒攪動(dòng)或不斷震蕩搖動(dòng)，無(wú)菌水沖洗5 6次后，用鑷子將種子直接播 種于無(wú)激素的培養(yǎng)基上；2) 將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室中的溫度為25士rc、光 照條件2000 25001ux; 14h/d光照；3) 3 4天后，種子萌發(fā)，第5 7天，取出無(wú)菌播種苗，切取下胚軸長(zhǎng) 2cra左右，每段0. 5 lcm置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培 養(yǎng)；4) 將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室中的條件與2)相同；5) 從10 12天開始，外植體膨大并形成愈傷組織，16天后愈傷組織變 綠并長(zhǎng)出芽點(diǎn)，30天左右芽點(diǎn)長(zhǎng)出小植株；6) 45 50天后，將直接分化出的不定芽與植株進(jìn)行誘導(dǎo)生根，移栽。
全文摘要
一種快速直接建立合歡再生植株體系的方法，用于木本植物基因受體生物技術(shù)領(lǐng)域。將合歡種子經(jīng)表面消毒后無(wú)菌播種于培養(yǎng)基上，一周左右，切取無(wú)菌播種苗下胚軸置于誘導(dǎo)與分化合一的TJ801培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，建立高頻再生系統(tǒng)，將直接分化出的不定芽誘導(dǎo)生根，移栽。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，用本發(fā)明的技術(shù)所建立的“兩步法”直接出芽程序?yàn)楹蠚g遺傳轉(zhuǎn)化研究提供一個(gè)良好的再生體系，也為今后開展合歡的快速繁殖、轉(zhuǎn)基因與分子育種提供良好的技術(shù)平臺(tái)。本方法具有一步成苗可快速建立基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，重復(fù)性強(qiáng)和簡(jiǎn)單容易。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101658133SQ20081005434
公開日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日
發(fā)明者付任勝, 周祥明, 夏時(shí)云 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心