本發(fā)明屬于光學檢測領域，是一種新的測量雙光子吸收截面的方法。這種測量方法可基于任何一臺雙光子熒光顯微鏡，通過雙光子熒光法獲取熒光材料的光強信息來測量材料的雙光子吸收截面。

背景技術：

雙光子熒光(Two-Photon Fluorescence,2PF)是指熒光材料在高峰值功率脈沖激光激勵下同時吸收光源的兩個光子躍遷到激發(fā)態(tài)，再馳豫回到基態(tài)而發(fā)射出光子的一個過程。通常使用雙光子作用截面(Two-PhotonActionCross-Section,ηδ)來表征材料的雙光子熒光發(fā)射效率，它表示材料吸收入射光子并發(fā)射出雙光子熒光的能力，等于材料的雙光子吸收截面(2PA,Two-PhotonAbsorption Cross-Section,δ)與熒光量子產率(Fluorescence Quantum Yield,η)的乘積。其中，2PA截面表征材料分子發(fā)生雙光子吸收的概率，反映了材料進行雙光子吸收的能力。測量2PA截面的方法大致可以分為兩大類，一類是從吸收截面的定義出發(fā)，進行直接測量，如非線性透過率法。用這種方法測2PA截面時，入射光功率需要很大，且所需材料的濃度比較高。此外，用此方法測量2PA截面缺乏一個參照來確定測量所用入射光功率與材料濃度是否處在一個合理的范圍內。因此透過率法測得的結果容易產生比較大的誤差。另外，透過率法測量對光源的功率要求比較高，普通的飛秒OPO功率往往不夠，需要采用峰值功率比較高的飛秒OPA作為光源。

另一種測量2PA截面的方法是從2PA截面的效果出發(fā)，進行間接測量。如雙光子熒光法測2PA截面，其大致思路：

材料產生的雙光子熒光強度F與2PA截面δ的關系可表示為：

F＝δN_AcηLnI²K (1)

其中，N_A是阿伏加德羅常數，c是材料的摩爾濃度，η是材料的熒光量子產率，L表示材料的通光長度，I是入射光的強度，K是一個與光學系統(tǒng)的收集效率有關的一個常數。這種方法可以通過測量材料的雙光子熒光強度從而反推出它的2PA截面。由于很難直接求得光學系統(tǒng)的收集效率，故通常采用比較法來測量，即尋找一個與待測樣品雙光子熒光光譜接近、且2PA截面已知的參照材料，在相同的光學環(huán)境下分別測量它們的雙光子熒光，再通過參照材料的2PA截面推算出樣品的2PA截面。其計算公式：

其中下標1與0分別代表樣品與參照材料。由于K是一個與光學系統(tǒng)的通光長度與收集效率有關的常數，因此在相同的光學測量環(huán)境下，K值是相同的，即K₁＝K₂。所以，只要在相同的光學環(huán)境下，分別測得兩者的雙光子熒光強度F₁、F₀，并且知道它們的摩爾濃度c₁、c₀，熒光量子產率η₁、η₀，溶液的折射率n₁、n₀，以及參照材料的2PA截面δ₀，就可以得到樣品的2PA截面δ₁。相較于非線性透過率法，雙光子熒光法的優(yōu)勢主要有兩點。一、雙光子熒光強度與入射光強度成平方關系，可以在實驗過程中減少其他非線性吸收及線性吸收帶來的影響。二、熒光法測量中所用的入射光功率與材料濃度分別比透過率法低很多，這也大大減少了其他非線性吸收與線性吸收的貢獻。通過減少這些干擾，雙光子熒光法通?？梢员确蔷€性透過率法測得更為準確的2PA截面。

2PA截面沒有成熟的商業(yè)化儀器可以使用，一般都需要自己搭建光路來測量材料的熒光光譜，進而對光譜強度進行波長積分，并用公式(2)進行計算的。然而，通過光譜儀測量的是熒光材料發(fā)射的熒光信號被散射的部分，而這部分熒光是很弱的，且容易受到環(huán)境中其他雜散光的影響，因此所測得的信號有比較大的誤差。為了解決這個問題，進一步提高檢測的精度，本發(fā)明設計了一種新的測量雙光子吸收截面的方法，即直接用雙光子熒光顯微鏡來獲得待測樣品的雙光子熒光光強信號，進而用公式(2)計算得到其2PA截面。

技術實現要素：

本發(fā)明基于雙光子熒光顯微鏡，提出了一種全新的雙光子吸收截面測量方法。本發(fā)明將飛秒激光引入掃描顯微系統(tǒng)作為光源，飛秒激光經過物鏡聚焦后激發(fā)待測材料的雙光子熒光信號，熒光信號進而被響應靈敏的光電倍增管(Photonmultiplier Tube，簡稱PMT)接收，經過光電轉換、數據采樣、處理后在計算機上成像。再減去材料雙光子熒光成像的背景，而后可讀取材料雙光子熒光成像圖中熒光強度的值作為雙光子熒光強度信號，代入公式(2)計算即可得到待測材料的2PA截面。

本發(fā)明采用的技術方案是：

2PA截面測量系統(tǒng)基于雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)，主要包括飛秒激光光源、二向色鏡、PMT、信號放大器、計算機等。

雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)可以針對所激發(fā)的熒光材料的特性，選擇合適波長的飛秒激光光源以及合適的PMT接收熒光信號，通過程序讀取光強信息，代入計算公式(2)就可以算出材料的2PA截面。

本發(fā)明的效益：本發(fā)明提出的2PA截面測量方法基于穩(wěn)定的雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)，較傳統(tǒng)的2PA截面測試方法，大大減小了測量結果的誤差，且測量方法更為簡便、可靠，適合非光學專業(yè)(如材料、化學、生物等)的人員進行操作。

附圖說明

圖1為用于測量熒光材料2PA截面的雙光子顯微成像系統(tǒng)示意圖；

圖2為用雙光子顯微成像系統(tǒng)測得的毛細管內熒光材料的雙光子熒光成像圖。

具體實施方式

以下結合附圖對本發(fā)明作進一步說明。

如圖1所示，本發(fā)明中的測量系統(tǒng)基于雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)，主要包括飛秒激光光源、振鏡掃描單元、二色鏡、PMT、信號放大器、數據采集卡、計算機等。振鏡掃描單元、二色鏡、PMT等構成掃描顯微系統(tǒng)[這里以奧林巴斯正置掃描顯微成像系統(tǒng)(Olympus,BX61+FV1200)為例]

首先，外置的飛秒激光引入奧林巴斯正置掃描顯微成像系統(tǒng)(Olympus,BX61+FV1200)，進入振鏡掃描單元后經掃描透鏡(scan lens)與鏡筒透鏡(tube lens)形成擴束光束再經一塊長反短通(截止波長：980nm)二向色鏡反射，由物鏡會聚激發(fā)熒光材料，產生雙光子熒光信號，材料激發(fā)出的熒光沿原光路返回，通過980nm長反短通二向色鏡，以及相應的濾光片(進一步濾除飛秒激發(fā)光)后被響應靈敏的PMT接收；PMT將模擬信號轉換為數字信號，經過信號放大器放大后被計算機采集，系統(tǒng)內的振鏡掃描單元也與計算機連接以實現信號掃描的同步。通過這樣一套系統(tǒng)，可以得到材料的雙光子熒光顯微成像圖(如圖2)。圖2中的熒光強度F₁可先用程序1減去背景光，再用MATLAB程序2計算得到。用同樣的方法得到參照熒光染料羅丹明Rh6G的雙光子熒光強度F₀。之后將待測材料與參照材料的光強信息F₁和F₀代入公式(2)可以算出材料的2PA截面。

本實例中采用了大模場面積(large-mode-area)摻Yb(ytterbium-doped)的光子晶體光纖(Photonic Crystal Fiber,PCF)激光器(脈寬:140fs，重復頻率:50MHz，波長:1040nm)作為飛秒光源。二色鏡是截止波長為980nm的長反短通二向色鏡，二色鏡之后的濾光片是590nm的長通濾光片；物鏡是奧林巴斯的25倍水鏡，工作距離為2mm，且在400nm～1600nm光波段具有良好的透過率；PMT可以響應185-800nm波段的光信號。所選用的雙光子熒光材料選用半導體聚合物納米顆粒(Semiconducting Polymer Dots,P-dots)，其吸收光譜位于350-450nm，熒光峰在650nm左右。羅丹明Rh6G為參照熒光材料。

1.減去背景的程序

clear；

const＝1；

I₀＝imread(背景成像.bmp')；

I₁＝imread('圖2.bmp')；

J₁＝rgb2gray(I₁)；

K＝(J₁-J₀)*const；

imwrite(K,'圖2實際強度.bmp')；

2.讀取圖2熒光強度信息的程序

clear；

I＝imread('圖2.bmp')；

J＝rgb2gray(I)；

K＝J(find(J>＝0))；

s₀＝sum(sum(K))

綜上，本發(fā)明陳述了一種新穎的測量2PA截面的方法。本發(fā)明選擇奧林巴斯正置掃描顯微鏡(Olympus,BX61+FV1200)，引入外置1040nm飛秒激光作為激發(fā)光源，激發(fā)P-dots發(fā)射出雙光子熒光信號(用羅丹明Rh6G作為參照)，得到了雙光子熒光成像圖。再通過MATLAB讀取成像圖的熒光強度后代入計算2PA截面的公式(2)，即可算出待測材料的2PA截面。這一套用雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)測量熒光材料2PA截面的方法，相較于傳統(tǒng)的測量方法，收集效率更高，操作更方便，誤差更少，穩(wěn)定性更高，性能更可靠。