本發(fā)明涉及植物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種番茄葉片保衛(wèi)細胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法。

背景技術(shù)：

Ca²⁺作為細胞內(nèi)的第二信使，參與ABA等激素誘導的氣孔運動中。同時許多生物或非生物脅迫都會引起植物細胞胞質(zhì)內(nèi)Ca²⁺濃度([Ca²⁺]_cyt)的變化，植物會根據(jù)[Ca²⁺]_cyt變化的差異解碼不同的刺激從而使細胞作出相應的反應。比如葉片上的保衛(wèi)細胞在受到外界刺激時其膜電位會發(fā)生變化，從而引起[Ca²⁺]_cyt的變化，但每一個成熟的保衛(wèi)細胞由于不是同步發(fā)育的，造成每個保衛(wèi)細胞有其獨有的信號轉(zhuǎn)導方式。一部分保衛(wèi)細胞[Ca²⁺]_cyt在某種環(huán)境的誘導下會發(fā)生變化，可能會表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)Ca²⁺濃度的上升，這種上升幅度的不同產(chǎn)生了不同的“鈣信號”，最終導致了外界環(huán)境刺激下氣孔的不同步關(guān)閉或打開。

現(xiàn)在一般認為細胞對許多外界環(huán)境和激素等刺激作出的反應是通過細胞胞質(zhì)中游離Ca²⁺濃度變化來傳遞的，因此檢測細胞內(nèi)[Ca²⁺]_cyt的變化對于研究信號轉(zhuǎn)導是非常重要的。近年來鈣離子的熒光測定法得到不斷的發(fā)展，包括定性及定量測定技術(shù)，能夠在亞細胞水平實時、無損傷的研究細胞內(nèi)[Ca²⁺]_cyt的變化。但目前的熒光指示劑檢測方法存在不同植物組織中檢查靈敏度差異大，不同植物組織熒光指示劑裝載條件的差異性且番茄葉片保衛(wèi)細胞中沒有優(yōu)化的具體指示劑熒光檢測方法的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明提供一種番茄葉片保衛(wèi)細胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，能間接直觀地檢測番茄葉片保衛(wèi)細胞游離鈣離子濃度。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種番茄葉片保衛(wèi)細胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，包括：

本發(fā)明實施例提供一種番茄葉片保衛(wèi)細胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，包括：

步驟1，配制設(shè)定濃度的熒光指示劑工作液；

步驟2，獲取番茄葉片下表皮；

步驟3，將配制的所述熒光指示劑溶液裝載至獲取的所述番茄葉片下表皮；

步驟4，用激光掃描共聚焦顯微鏡對裝載所述熒光指示劑溶液的所述番茄葉片下表皮進行熒光圖像采集，根據(jù)所采集的熒光圖像確定番茄葉片保衛(wèi)細胞游離Ca²⁺濃度。

本發(fā)明的有益效果為：通過將配制好的設(shè)定濃度熒光指示劑工作液裝載至獲取的番茄葉片下表皮，并利用激光掃描共聚焦顯微鏡對裝載所述熒光指示劑溶液的所述番茄葉片下表皮進行熒光圖像采集，進而間接測定番茄葉片保衛(wèi)細胞游離Ca²⁺濃度。該方法檢測準確，操作方便。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他附圖。

圖1為本發(fā)明實施例提供的番茄表皮保衛(wèi)細胞中不同濃度的Fluo-8AM裝載效果圖；

圖2為本發(fā)明實施例提供的不同溫度及時間條件下Fluo-8AM的裝載情況圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明實施例提供一種番茄葉片保衛(wèi)細胞游離鈣離子濃度的熒光指示劑檢測方法，包括：

步驟1，配制設(shè)定濃度的熒光指示劑工作液；優(yōu)選熒光指示劑工作液的濃度為10μM；

步驟2，獲取番茄葉片下表皮；

步驟3，將配制的所述熒光指示劑溶液裝載至獲取的所述番茄葉片下表皮；

步驟4，用激光掃描共聚焦顯微鏡對裝載所述熒光指示劑溶液的所述番茄葉片下表皮進行熒光圖像采集，根據(jù)所采集的熒光圖像確定番茄葉片保衛(wèi)細胞游離Ca²⁺濃度。

上述檢測方法中，熒光指示劑采用Fluo-8AM。

上述檢測方法中，配制熒光指示劑溶液包括：

步驟11，采用粉末狀的熒光指示劑為原料；

步驟12，用二甲基亞砜溶解所述熒光指示劑，配制成1或2mM的母液；

步驟13，所述母液密封分裝于-20℃避光保存；

步驟14，使用前將母液稀釋成需要濃度的工作液即為熒光指示劑工作液。

上述檢測方法步驟14中，稀釋母液采用10mM的Mes-Tris，pH為6.1的緩沖液。

上述檢測方法中，獲取番茄葉片下表皮包括：

步驟21，選取植株健壯、苗齡為4～5片真葉的番茄幼苗；

步驟22，選取步驟1選定的所述番茄幼苗從下向上數(shù)第三片真葉相同位置的小葉；

步驟23，將步驟2選取的葉片在50μM濃度的茉莉酸甲酯中孵育一小時作為前處理；

步驟24，用尖頭鑷子撕取所述前處理后的葉片下表皮，放置在載玻片上，然后用毛筆鋪展所述表皮，用于熒光指示劑的裝載。

上述檢測方法中，將配制的所述熒光指示劑溶液裝載至獲取的所述番茄葉片下表皮包括：

步驟31，將熒光指示劑工作液的裝載濃度配制成三個濃度，分別為5μM、10μM、15μM；

步驟32，向載玻片上鋪展的所獲取的番茄葉片下表皮上分別滴加三個濃度的熒光指示劑工作液，使番茄葉片下表皮浸在熒光指示劑工作液中，然后常溫黑暗下孵育30min～50min；優(yōu)選的常溫黑暗下孵育時間為50min；

步驟33，用Mes-Tris緩沖液洗滌步驟32的各番茄葉片下表皮三次，去除熒光指示劑工作液，室溫放置20min，即完成將配制的所述熒光指示劑溶液裝載至獲取的所述番茄葉片下表皮上。

上述方法中，步驟4中所用的激光掃描共聚焦顯微鏡為Leica TCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明

本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化的檢測番茄葉片保衛(wèi)細胞游離Ca²⁺濃度的熒光指示劑法，為進一步研究番茄葉片保衛(wèi)細胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導機理奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明方法包括：步驟1，熒光指示劑Fluo-8AM溶液的配制；步驟2，番茄葉片下表皮的獲得；步驟3，熒光指示劑的裝載(孵育)方法；步驟4，運用激光掃描共聚焦顯微鏡進行熒光圖像的采集等步驟。

其中，步驟1的熒光指示劑Fluo-8AM溶液的配制步驟如下：

步驟11.熒光指示劑第一次使用時需要配成母液，且由于試劑微量，開封前適當輕彈幾次管壁，保證粉末不會大量粘在管壁上。

步驟12.用質(zhì)量高的DMSO(二甲基亞砜)溶解指示劑，配制成1或2mM的母液。

步驟13.母液建議分裝保存，然后用封口膜封口，并用錫箔紙包裹，放在密閉性較好的塑料袋中，并放入干燥劑，于-20℃密封避光保存。

步驟14.使用前再根據(jù)實驗需要把母液稀釋成不同濃度的工作液。

步驟2的番茄葉片下表皮的獲得包括以下步驟：

步驟21.選取植株健壯、苗齡為4-5片真葉的番茄幼苗。

步驟22.實驗過程中要選取從下向上數(shù)第三片真葉相同位置的小葉。

步驟23.為了保證能夠用熒光指示劑檢測到葉片保衛(wèi)細胞胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子信號，取下的葉片需要提前在50μM濃度的茉莉酸甲酯中孵育一個小時，可以促進鈣離子濃度的上升。

步驟24.所有不同條件的孵育都要保持一個變量，番茄苗的生長狀態(tài)、苗的生長環(huán)境、葉片獲取的位置、葉片的前處理等都要保持相同。

步驟25.用尖頭鑷子小心撕取前處理后的葉片下表皮，放置在載玻片上，然后再用毛筆小心鋪展表皮，進行下一步熒光指示劑的裝載。

步驟3的熒光指示劑的裝載(孵育)包括以下步驟：

步驟31.熒光指示劑的工作液需要用10mM的Mes-Tris，pH為6.1的緩沖液稀釋母液得到。

步驟32.指示劑的裝載濃度配制成三個濃度，分別為5μM、10μM、15μM。

步驟33.載玻片上鋪展的葉片下表皮上分別滴加三個濃度的指示劑，使下表皮浸在溶液中，然后常溫黑暗下孵育40min。

步驟34.用Mes-Tris緩沖液洗滌表皮三次，去除指示劑。室溫放置20min，以確保AM體在細胞內(nèi)的完全酯化作用。

步驟35.用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察這三個熒光指示劑濃度的裝載效果，顯微鏡具體操作見下一部分。

以上步驟是優(yōu)化指示劑的裝載濃度，5μM是指示劑說明書的建議濃度，10μM是文獻報道的其他植物葉片保衛(wèi)細胞中檢測鈣離子的指示劑濃度。結(jié)果見圖1。

為了進一步優(yōu)化熒光指示劑裝載的溫度及時間，進行了下面的實驗步驟：

(1)指示劑在裝載溫度上設(shè)置了4℃、室溫(25℃)以及30℃，然后黑暗孵育。

(2)4℃下孵育1.5h，室溫下孵育30min和50min，30℃下孵育30min和50min。

(3)以上條件孵育結(jié)束后用Mes-Tris緩沖液洗滌表皮三次，去除指示劑。室溫放置30min，以確保AM體在細胞內(nèi)的完全酯化作用。

(4)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察以上條件熒光指示劑的裝載效果，從而優(yōu)化番茄葉片保衛(wèi)細胞游離Ca²⁺濃度的熒光指示劑檢測法。結(jié)果見圖2。

步驟4的激光掃描共聚焦顯微鏡進行熒光圖像的采集包括以下步驟：

本步驟中使用的顯微鏡為Leica TCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡

步驟41，依次打開系統(tǒng)的“PC Microscope”、“Scanner Power”及“Laser Power”三個圓形按鈕，然后把“Laser Power”按鈕右側(cè)的激光開關(guān)鑰匙(Laser Emission)順時針旋轉(zhuǎn)90度至“On”的位置。記錄開機時間。

步驟42，雙擊電腦顯示器桌面上的“LAS AF”圖標啟動Leica共聚焦軟件。

步驟43，點擊“OK”以打開軟件。

步驟44，軟件界面上點擊工具欄下方的“Configuration”,再點擊“Lsaer”,用對勾打開所需激光。本實驗需使用Argon離子激光，拖動滑塊兒調(diào)節(jié)激光的輸出功率到所需的值。

步驟45，系統(tǒng)預熱30min。

步驟46，點擊“Aquire”進行光路的設(shè)置，選擇FITC通道，調(diào)節(jié)488波長激光輸出功率。

步驟47，單擊“Additional Channels”進行透射光檢測器的選擇，選擇觀察方式有BF、DIC等。

步驟48，選擇掃描模式。在“Acquire”菜單欄的”Acquisition”中選擇掃描模式為xyz模式，這是默認模式，是最常用的掃描模式。

步驟49，設(shè)置掃描參數(shù)。在“Acquire”菜單欄的”Acquisition”中設(shè)置掃描參數(shù)，包括分辨率(format)、掃描速度(speed)、針孔大小(pinholesize)、線平均(line average)、面平均(frame average)、累加(accumulation)等為默認值，放大倍數(shù)(zoom)選擇3。

步驟410，預覽圖像。點擊“Live”以設(shè)定的掃描參數(shù)預覽圖像，圖像將顯示在右側(cè)的顯示屏上，此時可以調(diào)整掃描參數(shù)，以達到最佳效果。

步驟411，采集圖像。單擊“Capture Image”可以采集一維圖像。對于序列掃描，或者多維圖像掃描，單擊“Start”進行圖像采集。

步驟412，圖像文件的保存及輸出。在“Acquire”的”Experiment”下顯示采集的所有圖像文件名稱，右鍵點擊圖像文件名，可進行多種操作。

步驟413，關(guān)機。觀察完后把對應波長激光輸出功率調(diào)為0，把離子激光輸出功率調(diào)為0并關(guān)閉；若使用過油鏡，需要用無水乙醇清洗鏡頭；關(guān)閉LAS AF軟件，將電腦桌右側(cè)的激光開關(guān)鑰匙(Laser Emission)逆時針旋轉(zhuǎn)90度至“OFF”位置；關(guān)閉“Scanner Power”按鈕；電腦關(guān)閉；關(guān)閉“PC Microscope”按鈕；風扇停止后，關(guān)閉“Laser Power”按鈕，記錄關(guān)機時間及儀器使用狀況。

上述步驟4采集的圖像如圖1、2所示，圖1為番茄表皮保衛(wèi)細胞中不同濃度的Fluo-8AM裝載效果。其中，(a)為5μM濃度的指示劑；(b)為10μM濃度的指示劑；(c)為15μM濃度的指示劑。由圖可以看出在其他條件相同的情況下10μM濃度的Fluo-8AM檢測番茄葉片保衛(wèi)細胞中[Ca²⁺]cyt效果更好。

圖2為不同溫度及時間條件下Fluo-8AM的裝載情況。其中，(a)為4℃下孵育1.5h；(b1)為室溫下孵育30min；(b2)為室溫下孵育50min；(c1)為30℃下孵育30min；(c2)為30℃下孵育50min。由圖1和圖2綜合可以得出10μM濃度的Fluo-8AM在室溫下孵育50min來檢測番茄葉片保衛(wèi)細胞中[Ca²⁺]cyt效果最好。

上述實施例中通過不同濃度的熒光指示劑，不同裝載(孵育)溫度及時間來確定了番茄葉片保衛(wèi)細胞游離Ca²⁺濃度的熒光指示劑檢測的最佳方法。

本發(fā)明方法中采用Fluo-8AM熒光染料作為熒光指示劑來檢測，這種染料是AM酯化型(酯溶性)的，它可以穿透細胞膜進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-8，F(xiàn)luo-8若以游離形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與細胞內(nèi)自由鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強的熒光，最大激發(fā)波長為506nm，最大發(fā)射波長為526nm。實際檢測時使用的激發(fā)波長為488nm左右，發(fā)射波長為525～530nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。但由于植物細胞壁中存在的非特異性酯酶的影響常使指示劑裝載不成功，因此本發(fā)明確定了不同濃度指示劑，不同裝載溫度及時間對檢測的影響，從而得出優(yōu)化的番茄葉片保衛(wèi)細胞游離Ca²⁺濃度的熒光指示劑檢測方法，保證了檢測結(jié)果的準確性。本發(fā)明方法中由于使用了激光掃描共聚焦顯微鏡成像，可以進行熒光圖像的比較，是一種優(yōu)化的檢測方法，為進一步研究番茄葉片保衛(wèi)細胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導機理奠定了基礎(chǔ)。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書的保護范圍為準。