本發(fā)明屬于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種利用納米粒子小聚體檢測(cè)桿菌類標(biāo)志物的方法。
背景技術(shù)：
不同種類的納米粒子合成于制備、表征及應(yīng)用的報(bào)道已有很多，但是納米粒子小聚體的可控合成及應(yīng)用仍是很有意義的話題，因?yàn)榧{米粒子小聚體在開發(fā)獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)和生物分子識(shí)別等性能中有著很大的重要性。
利用染料分子作為納米粒子表面上的拉曼信號(hào)分子的研究已有一些報(bào)道，但是利用染料分子作為橋梁分子構(gòu)建納米粒子小聚體的研究還少有報(bào)道。通過(guò)此類方法構(gòu)建的納米粒子小聚體可以作為表面增強(qiáng)拉曼光譜(簡(jiǎn)稱“SERS”)中的增強(qiáng)基底，其具有很強(qiáng)的“熱點(diǎn)”效應(yīng)。利用此類增強(qiáng)基底可以進(jìn)行菌類等生物檢測(cè)，如可以形成芽孢的桿菌類菌種的檢測(cè)。
前期已有報(bào)道是利用SERS效應(yīng)很強(qiáng)的銀納米粒子進(jìn)行SERS檢測(cè)桿菌類芽孢中生物標(biāo)志物的方法，但是在生物體系中，銀粒子表面易被氧化而導(dǎo)致其穩(wěn)定性下降，如果采用表面穩(wěn)定性高且生物兼容性廣的金粒子，相信這方面的檢測(cè)應(yīng)用前景更開闊。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定的、SERS效應(yīng)強(qiáng)的利用納米粒子小聚體檢測(cè)桿菌類生物標(biāo)志物的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明發(fā)用的技術(shù)方案為：
本發(fā)明提供一種利用納米粒子小聚體檢測(cè)桿菌類標(biāo)志物的方法，其是通過(guò)利用花菁染料分子作為組裝分子，在納米尺寸范圍的金納米粒子上組裝花菁染料分子，作為橋梁將單個(gè)的納米粒子進(jìn)行“兩-兩交聯(lián)”構(gòu)建成納米粒子小聚體，作為表面增強(qiáng)拉曼光譜SERS中的增強(qiáng)基底，用于檢測(cè)桿菌類芽孢中的生物標(biāo)志物，生物標(biāo)志物為2，6‐吡啶二羧酸。
本發(fā)明中，所述的金納米粒子的尺寸小于100納米。
本發(fā)明中，所述花菁染料分子的分子式為C39H45IN2或C31H41IN2。
本發(fā)明中，所述的桿菌類為芽孢桿菌類。
本發(fā)明提供的利用納米粒子小聚體檢測(cè)桿菌類標(biāo)志物的方法，具體步驟如下：
1)1.5～2mL的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.5～1.5wt％的HAuCl4水溶液與40～60mL的水混合后邊加熱邊攪拌直至沸騰，而后加入4～8mL的0.5～1.5wt％檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)10～20分鐘；反應(yīng)結(jié)束時(shí)冷卻至室溫，得到表面攜帶檸檬酸根離子的不同尺寸金納米粒子溶膠；
2)將含有0.02～0.2微摩爾的花菁染料溶液加入到步驟1)得到的金納米粒子溶膠中，調(diào)節(jié)酸堿度在pH 3～5范圍內(nèi)，室溫?cái)嚢?，獲得納米粒子小聚體溶液；
3)在步驟2)得到的納米粒子小聚體溶液中加入含有2，6‐吡啶二羧酸的溶液，混合均勻，然后用玻璃毛細(xì)管吸取適量于置于拉曼光譜儀的樣品臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的桿菌類生物標(biāo)志物靈敏檢測(cè)的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
(1)粒子聚合效率高。本發(fā)明采用花菁染料分子作為橋梁，其分子結(jié)構(gòu)中的共軛基團(tuán)與相鄰分子結(jié)構(gòu)中的同種基團(tuán)形成“π-π共軛效應(yīng)”，將每單個(gè)的納米粒子與相鄰粒子之間都可以進(jìn)行“兩-兩交聯(lián)”構(gòu)建成納米粒子凝聚體。
(2)穩(wěn)定性好。本發(fā)明采用在生物體系中表面性能穩(wěn)定的金納米粒子凝聚體作為基底，其表面穩(wěn)定性高，不易被氧化。
(3)兼容性廣。本發(fā)明采用的金粒子表面上可組裝的分子范圍廣泛，可通過(guò)多種方法將生物分子組裝到金粒子表面。
(4)SERS效應(yīng)強(qiáng)。納米粒子構(gòu)建成納米粒子小聚體后，其SERS響應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，可以作為理想的表面增強(qiáng)拉曼光譜(簡(jiǎn)稱“SERS”)中的增強(qiáng)基底，其具有很強(qiáng)的“熱點(diǎn)”效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)微量分析物的靈敏檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。
本發(fā)明各實(shí)施例中所用的各種原料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售。
實(shí)施例1
一種利用納米粒子小聚體檢測(cè)桿菌類標(biāo)志物的方法的操作及表征：
(1)40納米金粒子的制備：
2.2mL的HAuCl4水溶液(1％)與50mL的水混合后邊加熱邊攪拌直至沸騰，而后快速加入6.5mL檸檬酸鈉溶液(1％)，該還原反應(yīng)持續(xù)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束時(shí)溶液呈酒紅色，將其冷卻至室溫，得到的金納米粒子～40納米。
(2)納米粒子小聚體的構(gòu)建：
加入花菁染料溶液到納米溶膠中使得二者濃度分別為0.042微摩爾和1.25納摩爾，使得納米粒子表面上的染料分子達(dá)到5～10％的覆蓋。利用鹽酸調(diào)節(jié)pH～3，在室溫下充分?jǐn)嚢?分鐘。
(3)2，6‐吡啶二羧酸在40納米金粒子小聚體表面的組裝：
將濃度分別為0.01和10還有100ppm(注：1ppm即百萬(wàn)分之一)的吡啶2，6‐二羧酸溶液分別加入到金粒子小聚體溶液中，混合均勻，然后用玻璃毛細(xì)管吸取適量于置于拉曼光譜儀的樣品臺(tái)上進(jìn)行SERS檢測(cè)。納米金粒子小聚體所具有的強(qiáng)SERS“熱點(diǎn)”效應(yīng)很強(qiáng)，可以對(duì)低至0.01ppm微量的被測(cè)物仍能實(shí)現(xiàn)靈敏檢測(cè)。而較高濃度100ppm的信號(hào)并不比10ppm的信號(hào)高太多，究其原因可能是組裝分子在納米結(jié)構(gòu)增強(qiáng)基底表面達(dá)到一個(gè)單分子層以下的覆蓋度越有利于表面增強(qiáng)效應(yīng)，而高濃度將會(huì)引起納米小聚體表面的多分子層覆蓋，因此證明該基底更適合于低濃度的靈敏檢測(cè)。
實(shí)施例2
(1)65納米金粒子的制備：
2.2mL的HAuCl4水溶液(1％)與50mL的水混合后邊加熱邊攪拌直至沸騰，而后快速加入6.5mL檸檬酸鈉溶液(1％)，該還原反應(yīng)持續(xù)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束時(shí)溶液呈酒紅色，根據(jù)粒徑的需要將0.5mL的Au種子與0.5mL的氯金酸水溶液(1％)在室溫下混合后再加入2.1mL的NH2OH·HCl溶液(40mM)作為還原劑，最終獲得～65納米的金溶膠。
(2)納米粒子小聚體的構(gòu)建：
加入花菁染料溶液到納米溶膠中使得二者濃度分別為0.104微摩爾和0.024納摩爾，使得納米粒子表面上的染料分子達(dá)到5～10％的覆蓋。利用鹽酸調(diào)節(jié)pH～3，在室溫下充分?jǐn)嚢?分鐘。
(3)2，6‐吡啶二羧酸在65納米金粒子小聚體表面的組裝：
將濃度分別為0.0001和0.001還有0.01ppm(注：1ppm即百萬(wàn)分之一)的吡啶2，6‐二羧酸溶液分別加入到金粒子小聚體溶液中，混合均勻，然后用玻璃毛細(xì)管吸取適量于置于拉曼光譜儀的樣品臺(tái)上進(jìn)行SERS檢測(cè)。55～65納米范圍的金粒子小聚體所具有的強(qiáng)SERS“熱點(diǎn)”效應(yīng)比其他尺寸的更強(qiáng)，可以對(duì)低至0.0001ppm微量的被測(cè)物仍能實(shí)現(xiàn)靈敏檢測(cè)，究其原因可能是這個(gè)粒徑范圍的金粒子的表面等離子體特征峰最接近激光波長(zhǎng)，因而有利于強(qiáng)SERS效應(yīng)的獲得。因此，利用大尺寸的粒子構(gòu)建的小聚體更適合較低濃度(低于一個(gè)單分子層組裝)的生物分子檢測(cè)。