干法蛋白質轉移的制作方法
相關專利申請的交叉引用
本申請要求2015年2月10日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/114,387的優(yōu)先權，該文的全部內容通過引用納入本文。
背景技術：
在平板凝膠中通過電泳分離的蛋白質、核酸或其它生物物質在鑒定和定量之前，常被轉移至由硝酸纖維素、尼龍、聚二氟乙烯或類似材料制成的印跡膜。電印跡是一種常用的轉移技術，其中，將凝膠和膜的平坦表面以直接接觸的方式配置。然后，電流沿橫向方向流過凝膠和膜，從而通過與物質在凝膠中移動的方式類似的方式將物質轉移。當物質為dna片段時，該轉移被命名為southern印跡，其開發(fā)者是英國生物學家edwinm.southern。以此類推，rna片段的轉移被命名為northern印跡，蛋白質或多臺的轉移被命名為western印跡。其它示例是針對翻譯后修飾的“eastern”印跡和針對蛋白質相互作用的“farwestern”印跡。
電印跡可以濕、干或半干的形式進行。在濕法印跡中，凝膠和膜相互層疊成層疊體，將該層疊體浸漬在轉膜槽內的轉移緩沖液中，該轉膜槽的壁上安裝有導線或板狀電極。隨后對電極施加電壓以使溶質從凝膠遷移至膜。在半干印跡中，將用轉移緩沖液濕潤的濾紙配置于層疊體的頂部和底部，將凝膠和膜夾在中間以形成“印跡夾心”。隨后將電極配置成與濕潤的濾紙的露出的表面直接接觸。在干法電印跡中，不使用除凝膠中殘留緩沖液以外的液體緩沖液。濕法、干法和半干電印跡的描述以及相關的材料和設備可見margalit等(英杰公司(invitrogen))的美國專利申請公開號us2006/0272946a1(2006年12月7日)、us2006/0278531a1(2006年12月14日)和us2009/0026079a1(2009年1月29日)；littlehales(美國百奧奈特公司(americanbionetics))的美國專利號4,840,714(1989年6月20日)；dyson等(安瑪西亞國際公司(amershaminternational))的美國專利號4,889,606(1989年12月26日)；schuette(生命技術公司(lifetechnologies,inc.))的美國專利號5,013,420(1991年5月7日)；chan等(雅培實驗室公司(abbottlaboratories))的美國專利號5,356,772(1994年10月18日)；camacho(hoefer科學儀器公司(hoeferscientificinstruments))的美國專利號5,445,723(2005年8月29日)；boquet(伯齊公司(bertin&cie))的美國專利號5,482,613(1996年1月9日)；以及chen(威泰克企業(yè)有限公司(wealtecenterpriseco.,ltd.))的美國專利號6,592,734(2003年7月15日)。
在所有的電印跡形式中，有一種或多種水溶液與電泳凝膠或印跡膜接觸，或者包含在電泳凝膠或印跡膜內。將金屬(例如鉑、銀、鉛、銅或鋁)電極應用于電印跡時，在各電極與這些溶液的界面上發(fā)生電化學反應。該反應可包括水電解，該水電解在陽極生成o2氣體、氫離子和過氧化氫，并且在陰極生成h2氣體和氫氧根離子。電化學反應也可使電極電離，導致金屬離子從電極表面釋放至鄰近的溶液中。這種反應的產物可與正在電泳凝膠和印跡膜之間進行轉移的生物物質相互作用，使得這些物質被化學修飾(例如氧化或還原)、變性或喪失功能。電化學反應產物、尤其是由水電解生成的氣體也可使電極的能夠傳輸電流的表面積減小，并導致電印跡的效率降低。
技術實現要素：
本申請?zhí)峁┮环N用于通過電印跡將生物大分子從電泳平板凝膠轉移至印跡膜的試劑盒、系統(tǒng)和方法。
在本發(fā)明的第一個方面，提供一種試劑盒。所述試劑盒包括兩個導電聚合物電極，各電極包括基質和端子。所述基質包含導電聚合物混合物，該導電聚合物混合物包含共軛有機聚合物。所述端子與所述基質電連接，用于接收來自電源的電能。
在所述試劑盒的一些實施方式中，所述共軛有機聚合物是聚噻吩、聚苯胺、聚吡咯、聚亞苯基或聚(對亞苯基亞乙烯基)。所述共軛有機聚合物可以是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(pedot)。在一些實施方式中，所述導電聚合物混合物還包含聚電解質。在這些實施方式中，所述共軛有機聚合物可以帶正電，所述聚電解質可以帶負電。所述聚電解質可以是水溶性的和/或磺化聚苯乙烯。所述導電聚合物混合物可包含聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸鹽/酯)(pedot:pss)。
在所述試劑盒的一些實施方式中，所述導電聚合物混合物是水溶性的。在一些實施方式中，所述導電聚合物混合物具有至少0.1、1、10或100s/cm的電導率。在一些實施方式中，所述基質是納米復合物，并且可進一步包含合成粘土。在一些實施方式中，所述基質是觸變性的。在一些實施方式中，所述基質具有至少0.1、1、10或100s/cm的電導率。在一些實施方式中，所述導電聚合物混合物占所述基質重量的至少百分之0.1、0.3、1、1.3、3、10或30。在一些實施方式中，所述基質還包括多孔性基材，該多孔性基材中設置有所述導電聚合物混合物。
在所述試劑盒的一些實施方式中，各電極還包括包封所述基質的剛性盒體。所述盒體包括底板、與該底板連接的壁、以及從所述壁側向延伸的唇緣。所述盒體的底板和壁限定一個中央空腔，所述基質設置在該中央空腔內。在這些實施方式中，至少一個電極可進一步包括保護板，該保護板粘附于所述盒體的唇緣并覆蓋所述中央空腔，并且設置成能從所述唇緣移除以暴露所述中央空腔。至少一個電極可進一步包括多孔性膜，該多孔性膜安裝于所述基質或所述盒體的唇緣，并覆蓋所述基質。各電極的端子可設置于所述盒體的外表面上，并通過導電元件與所述基質電連接，該導電元件穿過所述盒體的壁或所述盒體的底板。
在所述試劑盒的實施方式中，至少一個電極可進一步包括設置于所述基質和所述盒體底板之間的導電板，該導電板與所述基質及所述端子電連接。所述盒體可包含電絕緣材料。所述盒體的唇緣可配置成在所述電極合并在一起時彼此嚙合，并且一個盒體的唇緣可以與另一個盒體的唇緣在形狀上互補，從而通過所述盒體的唇緣的嚙合將所述電極固定在一起并同時保留所述基質之間的間隙。
在所述試劑盒的一些實施方式中，有多個校準樁從至少一個電極的盒體的唇緣突出，有多個校準孔切入至少一個電極的盒體的唇緣，所述校準樁和校準孔配置成在所述電極合并在一起時彼此嚙合，并且所述校準孔與所述校準樁在形狀上互補，從而通過所述校準樁與所述校準孔的嚙合將所述電極固定在一起并同時保留所述基質之間的間隙。在一些實施方式中，可以在各校準樁的表面上設置電絕緣材料，或者在各校準孔的內部排布電絕緣材料。
所述試劑盒的一些實施方式還包括夾子，該夾子用于將兩個電極在電泳平板凝膠和印跡膜周圍固定在一起。當電極如此固定時，電極的基質彼此面對且平行，電泳平板凝膠和印跡膜則被容納在兩個電極的間隙中，并且所述夾子對電極施力以保持各電極與電泳平板凝膠或印跡膜接觸，并保持電泳平板凝膠與印跡膜相互接觸。在這些實施方式中，所述夾子可與各電極的端子電連接，并且可以用來將電能從電源輸送至所述端子。
在一些實施方式中，所述試劑盒還包括電源，該電源用于經由所述端子向所述電極輸送電能，其中，輸送至一個電極的電流與輸送至另一個電極的電流極性相反。
在本發(fā)明的第二個方面，提供一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于通過電印跡將生物大分子從電泳平板凝膠轉移至印跡膜。所述系統(tǒng)包括：以上所述的試劑盒的兩個導電聚合物電極；容納在所述電極之間的間隙中的電泳平板凝膠和印跡膜；以及用于經由所述端子向所述電極輸送電能的電源；其中，輸送至一個電極的電流與輸送至另一個電極的電流極性相反。所述系統(tǒng)用于，在不存在與電泳平板凝膠或印跡膜接觸的外源的緩沖液、電解質或溶劑的情況下，通過向電極輸送電能而將生物大分子從電泳平板凝膠轉移至印跡膜。
在一些實施方式中，所述系統(tǒng)還包括夾子，該夾子用于將兩個電極在電泳平板凝膠和印跡膜周圍固定在一起，使得，當電極如此固定時：電極的基質彼此面對且平行，并且所述夾子對電極施力以保持各電極與電泳平板凝膠或印跡膜接觸，并保持電泳平板凝膠與印跡膜相互接觸。在這些實施方式中，所述夾子可與各電極的端子電連接，并且可以用來將電能從電源輸送至所述端子。
在本發(fā)明的第三個方面，提供一種方法，該方法用于通過電印跡將生物大分子從電泳平板凝膠轉移至印跡膜。所述電泳平板凝膠和所述印跡膜容納在以上所述的試劑盒的兩個導電聚合物電極之間的間隙中，使得，各電極與電泳平板凝膠或印跡膜接觸，并且電泳平板凝膠與印跡膜相互接觸。此外，所述電極的端子與電源連接。所述方法包括經由所述端子向所述電極輸送電能，其中，輸送至一個電極的電流與輸送至另一個電極的電流極性相反，從而通過電印跡將生物大分子從電泳平板凝膠轉移至印跡膜。
在一些實施方式中，所述方法還包括將所述兩個電極固定在一起。在所述方法的一些實施方式中，不存在與電泳平板凝膠或印跡膜接觸的外源的緩沖液、電解質或溶劑。
附圖說明
圖1是本發(fā)明的一些實施方式中的、被夾在兩個導電聚合物電極之間的電泳平板凝膠和印跡膜的示意圖。
圖2所示為導電聚合物電極，其包括剛性盒體和粘附于所述盒體的唇緣的保護板。例示的電極耗材顯示了包封在剛性盒體中的pedot:pss糊料。自粘膠覆蓋所述糊料，并且可從耗材移除，從而在電轉之前在凝膠和電極之間形成連接。
圖3所示為本發(fā)明的一些實施方式中的導電聚合物電極。各電極的基質包含pedot:pss導電聚合物混合物，并且被包封在剛性盒體中。校準樁從下電極的盒體的唇緣突出，并且校準孔切入上電極的盒體的唇緣。各電極的端子設置于所述盒體的外表面上，并通過導線與所述基質電連接。
圖4是本發(fā)明的一些實施方式中的兩個導電聚合物電極以及容納在所述電極之間的間隙中的電泳平板凝膠和印跡膜的分解圖。
圖5所示為完全組裝好的形態(tài)的圖4的導電聚合物電極。
發(fā)明詳述
i.介紹
現已發(fā)現，可以使用導電聚合物電極來實施蛋白質及其它生物物質的有效的電印跡。各電極包含共軛有機聚合物，該共軛有機聚合物可通過施加外部電勢而被氧化或還原。該共軛有機聚合物是諸如pedot:pss之類的導電聚合物混合物中的一部分，該導電聚合物混合物不僅傳導電流、而且起到在電泳中遷移的離子的源和匯的作用。這些離子可穿透電極，隨著所述共軛有機聚合物的氧化態(tài)的改變而與所述導電聚合物混合物結合或從所述導電聚合物混合物解離。由于溶液離子進入或離開所述電極，且電荷(例如電子)在所述電極中自由移動，因此與金屬電極相比，在所述電極表面更少發(fā)生電化學反應。所以，由水電解或電極溶解導致的電印跡的問題得以緩解。
在本發(fā)明的一些實施方式中，各導電聚合物電極包括納米復合物基質，而所述導電聚合物混合物是該納米復合物基質的一種組分。另一種組分可將聚合物分子物理橋連和/或賦予所述基質強度。所以，所述基質可具有固態(tài)、半固態(tài)或觸變性的主體和/或平坦的表面。聚合物電極也可以采用剛性盒體來包封所述基質，并且采用與所述基質電連接的端子來供電。在此提供使用導電聚合物電極將生物大分子從電泳凝膠轉移至膜的試劑盒、系統(tǒng)及方法。
ii.試劑盒
本文所述的試劑盒包括兩個導電聚合物電極(也稱為“聚合物電極”或簡稱為“電極”)，它們分別包括基質和端子。所述基質包含導電聚合物混合物，所述端子與所述基質電連接。所述基質可具有至少一個平坦的表面，以便與位于該基質附近的電泳凝膠或印跡膜接觸或者以其它方式電接觸。該平坦的表面可具有與本領域中常用的凝膠和膜相當或更大的維度。各電極的端子用于接收來自電源的電能。經由所述端子，所述電源可以用來從所述電極的基質供給或回收電流，或者在基質之間創(chuàng)造不同的電流和/或電勢，以供電印跡。
各電極的基質中的導電聚合物混合物包含共軛有機聚合物。本發(fā)明的實施方式中可用的共軛有機聚合物的例子包括聚噻吩、聚苯胺、聚吡咯、聚亞苯基或聚(對亞苯基亞乙烯基)。在一些實施方式中，所述共軛有機聚合物是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(pedot)、聚噻吩。這里所用的共軛有機聚合物可具有任意所需的鏈長、分支、取代基、雜原子或側基部分。各導電聚合物電極的基質可包含一種共軛有機聚合物，或以所需的比例包含多種共軛有機聚合物。在兩個電極的基質中可以使用相同的共軛有機聚合物，或者也可以使用不同的共軛有機聚合物(或它們的組合)。
在一些實施方式中，所述導電聚合物混合物也包含聚電解質，該聚電解質可增強導電聚合物混合物的穩(wěn)定性、可溶性和/或導電性。有用的聚電解質包括磺化聚苯乙烯(例如聚(苯乙烯磺酸鹽/酯)或聚(苯乙烯磺酸)，均記作pss)之類的水溶性聚電解質。在水性pss中聚合pedot的方法是本領域已知的，例如在groenendaal等,advancedmaterials12,pp.481-494,2000中有記載。所述聚電解質可起到電荷平衡摻雜劑的作用，提供負電荷來中和所述共軛有機聚合物中的正電荷。所以，所述導電聚合物混合物可以有機鹽的形式存在，并且在一些實施方式中是水溶性的。在一些實施方式中，所述導電聚合物混合物包含聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸鹽/酯)(pedot:pss)。
所述導電聚合物混合物可根據需要制備或購得。pedot:pss的水性分散體能夠從西格瑪奧德里奇公司(sigma-aldrichcorporation)(美國密蘇里州圣路易斯(st.louis,missouri,usa))獲得，pedot:pss的專賣制劑能夠從愛克發(fā)·吉華集團(agfa-gevaertn.v.)(比利時莫爾特塞爾(mortsel,belgium))以商品名orgacontm獲得。在一些實施方式中，pedot的聚合在包含過硫酸鈉之類的氧化劑的氧化(即p-摻雜)條件下進行?？梢栽诓煌瑫r間使用其它試劑，以提高所述導電聚合物混合物的電導率，這例如在
各導電聚合物電極的基質可以是液態(tài)或固態(tài)，并且可具有任意所需的稠度。例如，所述基質可以是油灰、糊料、凝膠或漿料。所述基質可以呈圖1所示的平板形狀或可用于電印跡的任何其它形狀。在一些實施方式中，所述基質是納米復合物，并且包含一種或多種納米級材料以及所述導電聚合物混合物。一種這樣的納米級材料是合成剝離型粘土，能夠從畢克化學公司(byk-chemiegmbh)(德國韋塞爾(wesel,germany))以商品名
所述基質也可通過將所述導電聚合物混合物加入明膠、瓊脂糖或丙烯酰胺之類的增稠劑中來制備。有用的增稠劑也包括多糖及其它有機聚合物。通過所述增稠劑的膠凝、交聯(lián)、聚集、團聚或聚合，所述基質可以比單獨的所述單獨聚合物混合物(或例如其水性懸浮液)更粘稠或結實。在一些實施方式中，包含所述導電聚合物混合物、納米級材料、增稠劑或其它組分的所述基質具有至少0.1、1、10或100s/cm的電導率。所述導電聚合物混合物可與納米級材料或其它組分以任意所需的比例混合。在一些實施方式中，所述導電聚合物混合物占所述基質重量的至少百分之0.1、0.3、1、1.3、3、10或30。
所述基質也可包括多孔性基材，該多孔性基材中設置有所述導電聚合物混合物。所述多孔性基材可以是海綿、紙張(例如沃特曼紙(whatmanpaper))、膜材料或陶瓷之類的能吸收液體的材料。所以，當所述導電聚合物混合物成液態(tài)或半液態(tài)(例如是水性分散體的一部分)時，可以將所述導電聚合物混合物浸入或注入所述多孔性基材中，為所述導電聚合物混合物提供機械支撐。在另一實施方式中，所述基質包括固體基材，該固體基材上例如以膜的形式涂覆或沉積有所述導電聚合物混合物。所述固體基材可以使用例如玻璃、陶瓷、塑料或金屬等材料。如果合適，所述固體基材可具有與電泳凝膠或印跡膜同樣的平坦表面。多孔性和/或固體基材通常可用于賦予導電聚合物電極的基質形狀，并確保該電極具有可用于電印跡的幾何結構。在一些實施方式中，在增加的多孔性或固體基材后，所述導電聚合物混合物變硬或變得更不易流動。根據需要，所述基材可以是導電性的或絕緣性的。
包含水或其它溶劑的基質的實施方式可以濕潤形態(tài)或干燥形態(tài)提供給最終用戶。如果為濕潤形態(tài)，則溶劑在生產時就加入基質中。所以，最終用戶可以在不進行改進的情況下方便地在試劑盒中使用導電聚合物電極。而如果基質以干燥形態(tài)提供，則用戶可以在使用時加入部分或全部的溶劑。加入溶劑的方式例如可包括：將導電聚合物混合物和基質的其它組分用溶劑混合、將溶劑注入設置有導電聚合物混合物的多孔性基材中、或者將溶劑吸移至涂覆有導電聚合物混合物的固體基材上。以干燥形態(tài)提供基質可避免共軛有機聚合物與基質的其它組分之間的溶液相副反應，從而延長基質的保存期限。如果需要，可以將一份溶劑(例如水性緩沖液)和基質一起提供給最終用戶。這份溶劑的體積可按照使得溶劑和導電聚合物混合物以特定的比例組合的條件來選擇。所加入的溶劑的體積、ph或組成也可調整為能賦予基材所需的物理性質。例如，可以向一個電極的基質中加入小體積的溶劑，以使基質更粘稠。可加入含高濃度鹽(例如nacl或kcl)的溶劑，以使電印跡過程中的電流更大。
在一些實施方式中，本文所述的試劑盒還包括一個或多個剛性盒體。各盒體用于包封導電聚合物電極的基質，并為所述基質提供機械支撐。所以，所述盒體可對由任意多孔性或固體基材提供的支撐作出補充。所述盒體也可保護所述基質在不使用時(例如運輸過程中及使用前)不發(fā)生機械變形、外來物質污染及其它危害。各盒體包括底板、與該底板連接的壁、以及從所述壁側向延伸的唇緣。所述盒體的幾何結構有許多可能性，在一些實施方式中，所述壁與所述底板垂直，或者所述唇緣與所述壁垂直或與所述底板平行。所述盒體的底板和壁限定一個中央空腔，該中央空腔內設置有所述導電聚合物電極的基質。所述盒體可包括陶瓷或塑料之類的電絕緣材料，或者由該電絕緣材料制成。
在一些實施方式中，所述盒體在一側開口，以提供所述基質和電印跡中使用的電泳凝膠或印跡膜之間的界面。所述基質的露出部分可以是如上所述的平坦表面。在一些實施方式中，所述試劑盒中包括用于至少一個導電聚合物電極的保護板。該保護板粘附于所述盒體的唇緣，并覆蓋所述中央空腔以及所述盒體內部的基質(圖2)。該保護板設置成能從所述唇緣移除以暴露所述中央空腔，從而將所述基質(或其一部分或其表面)暴露在所述盒體外部的空間。所以，所述保護板可保護所述基質在不使用時(例如在所述導電聚合物電極的使用前的運輸或儲存時)不發(fā)生污染?？蛇x的或附加的，在一些實施方式中，至少一個電極包括安裝于所述基質或所述盒體的唇緣的多孔性膜。該多孔性膜覆蓋所述基質的能與電泳凝膠或印跡膜電接觸的一側，并且可在電印跡過程中將所述基質與這些元件物理隔離。但是，所述多孔性膜仍然能讓電流在兩個導電聚合物電極之間流過電泳凝膠和印跡膜。如果需要，所述多孔性膜可以用水或緩沖溶液之類的導電性液體浸漬，或者由金屬之類的導電性材料制成。在一些實施方式中，所述多孔性膜將所述盒體內部的基質密封，從而基質沒有任何一部分直接暴露在所述盒體外部的空間。在一些實施方式中，至少一個導電聚合物電極同時包括多孔性膜和保護板，在此情況下，該多孔性膜層疊在保護板和基質之間。
所述盒體也可輔助所述基質與導電聚合物電極的端子之間的機械偶聯(lián)(圖3)。在一些實施方式中，所述端子設置于所述盒體的外表面上，并通過導電元件與所述基質電連接。所述導電元件可穿透所述盒體的壁或所述盒體的底板。所以，所述壁或底板可包括孔或通道來容納所述導電元件，另外也保持所述基質與所述盒體外部的空間隔離。導電元件的例子包括銅、銀、金和鉑導線，它們在插入所述盒體中前可任選地經電絕緣(諸如用聚合物包覆)。所述端子可具有適合于與電印跡用電源連接的形狀。例子，所述端子可以是通過香蕉插頭或鱷魚夾與一根或多根導線連接的形狀。
在一些實施方式中，導電聚合物電極的基質和端子在所述盒體中通過導電板彼此電連接。該導電板可由任意的方便的導電性材料制成，例如銅、銀、金、鉑、其它金屬或金屬合金。所述導電板設置于所述基質和所述盒體的底板之間，因而與電印跡中使用的所有電泳凝膠或印跡膜都物理隔離。在一些實施方式中，所述導電板位于所述基質上的多孔性膜或粘附于所述盒體的唇緣的保護板的相反側。
所述導電板可通過摩擦或壓力而保持與所述基質接觸，或者可以用例如導電性粘合劑固定于所述基質?；蛘?，所述導電板可與所述基質直接結合，或者用構成所述基質的導電聚合物混合物或納米復合物涂覆。所述導電板與所述基質和所述端子電連接，并且可遍布所述基質的整個表面。在一些實施方式中，所述導電板具有與所述基質的面向盒體外部的平坦表面相當或相等的面積，并且與該表面平行。所以，所述導電板可使流過所述基質的整個質量的電流更均勻，進而使電印跡過程中的生物物質的轉移更均勻。
在包括分別具有包封基質的盒體的兩個導電聚合物電極的試劑盒中，所述盒體的唇緣可配置成在所述電極合并在一起時彼此嚙合。例子，一個盒體的唇緣上的槽口可以對準另一個盒體的唇緣上的凹槽。或者，兩個盒體的唇緣可具有在各自內部契合或相扣的突出部或凹陷部，在一些情況下，該突出部或凹陷部圍繞盒體的整個外周。盒體的唇緣的嚙合可避免電印跡過程中的一個電極相對于另一個電極的旋轉或側向移動和/或避免電極的分離。在一些實施方式中，一個盒體的唇緣與另一個盒體的唇緣在形狀上互補，從而通過盒體的唇緣的嚙合將電極固定在一起并同時保留基質之間的間隙。該間隙可以在電印跡過程中將電泳凝膠和印跡膜容納在基質和任意多孔性膜之間。
本發(fā)明的一些實施方式的盒體的特征可參照圖4和5來理解。圖4是的中間夾著電泳凝膠401和印跡膜402的兩個導電聚合物電極400的分解圖。各導電聚合物電極包括剛性盒體403、404，該剛性盒體403、404具有底板403a、404a，與底板連接的壁403b、404b，以及從壁側向延伸的唇緣403c、404c。導電板405、406設置于各盒體的底板上。各導電板具有從底板延伸出來、并且通往盒體外部的空間的延長部405a、406a。該延長部可與用于接收電能的端子電連接，或者作為用于接收電能的端子。在各導電聚合物電極中，包含導電聚合物混合物的基質407、408設置于由盒體的底板和壁限定的中央空腔內。該基質通過盒體的底板附近的基質的表面與導電板電連接。該表面和與電泳凝膠或印跡膜相接、并且面向盒體外部的平坦表面大致平行。各基質通過多孔性膜409、410與電泳凝膠和印跡膜隔離。當導電聚合物電極合并在一起時，盒體的唇緣彼此嚙合，從而將電極固定在一起并同時保留基質之間的間隙。該間隙容納電泳凝膠和印跡膜。
圖5是本發(fā)明的實施方式的試劑盒的截面圖，其中導電聚合物電極彼此分離。圖5所示為完全組裝好、并且與電泳凝膠401和印跡膜402對齊(但隔離)的圖4的導電聚合物電極。各電極501、502包括剛性盒體、導電板、基質和多孔性膜。導電板的延長部501a、502a從盒體的相反側延伸出來，并且可與電源(未顯示)連接。電極可在電印跡的電泳凝膠401和印跡膜402周圍合并在一起。
本文所述的盒體的一些實施方式中，采用具有互補形狀的校準樁和校準孔作為唇緣的替代或補充。在這些實施方式中，有多個校準樁從至少一個電極的盒體的唇緣突出，并且有多個校準孔切入至少一個電極的盒體的唇緣(圖3)?？梢栽谝粋€盒體上具有樁、在另一個盒體上具有孔，也可以在同一個盒體上同時具有樁和孔。校準樁和校準孔配置成在電極合并在一起時彼此嚙合，并且在形狀上彼此互補。所以，通過校準樁與校準孔的嚙合將電極固定在一起并同時保留基質之間的間隙。校準樁和校準孔可達到與具有互補形狀的盒體唇緣相同的目的，例如避免電極的移動或分離。
如果需要，校準樁可以在插入校準孔中時擴張，以便更有效地將電極固定在一起。替代的或附加的，樁和孔可以加載彈簧或具有蝕刻表面以增大摩擦。在一些實施方式中，在各校準樁的表面上設置有電絕緣材料，或者在各校準孔的內部排布有電絕緣材料。所以，盒體間的機械接觸可以是電絕緣的，并且避免盒體間的導電。
在本發(fā)明的一些實施方式中，試劑盒包括夾子，該夾子用于將兩個導電聚合物電極在電泳凝膠和印跡膜周圍固定在一起。該夾子可以任意的方便的幾何結構與所述電極連接，并且可在采用或不采用剛性盒體來包封所述電極的基質的實施方式中使用。當用所述夾子固定在一起時，所述電極的基質彼此面對且平行，電泳平板凝膠和印跡膜則被容納在所述電極的間隙中，并且所述夾子對所述電極施力以保持各電極與電泳平板凝膠或印跡膜接觸，并保持電泳平板凝膠與印跡膜相互接觸。任何能有效地保持電極的基質之間的、流經凝膠和印跡膜的電通路的力均可采用。在采用盒體的實施方式中，所述電極可通過盒體唇緣的嚙合或者以上所述的校準樁和校準孔的嚙合而固定在一起，并且在這里，所述夾子可確保所述電極如此固定。在不采用盒體的實施方式中，所述夾子可與所述基質直接接觸并用力將它們相互靠近。優(yōu)選地，所述夾子并不為所述電極間的電流提供另外的通路，從而，電流不會偏離而不流過凝膠和印跡膜。所以，所述夾子可整個或部分由塑料之類的非導電性材料制成。但是，在一些實施方式中，所述夾子可與各電極的端子電連接，并且用來將電能從電源輸送至所述端子。所以，所述夾子可同時達到以機械方式將所述電極固定在一起的目的以及將電流導向和導出所述電極的目的。
試劑盒的實施方式也可包括電源。任何在與本文所述的導電聚合物電極電連接時能有效地引發(fā)生物大分子的電印跡的電源均可采用。該電源用于經由所述端子向所述電極輸送電能，其中，輸送至一個電極的電流與輸送至另一個電極的電流極性相反。合適的電源的例子是由伯樂實驗室公司(bio-radlaboratories,inc.)(美國加利福尼亞州赫拉克勒斯(hercules,california,usa))銷售的powerpactm產品線。
iii.系統(tǒng)
本申請也提供一種用于通過電印跡將生物大分子從電泳平板凝膠轉移至印跡膜的系統(tǒng)。系統(tǒng)可包括一對導電聚合物電極和以上所述的電源，以及凝膠和印跡膜。
本文所述的系統(tǒng)中可采用任何電泳凝膠。例如，所述凝膠可具有任意維度，具有任意數量的泳道，以及通過手工或機器制備(灌膠)。在一些實施方式中，所述凝膠包含聚丙烯酰胺或瓊脂糖，其可以任何百分比或濃度存在，包括以多于一種濃度(例如，在凝膠的濃縮膠和分離膠部分)或濃度梯度存在。所述凝膠也可包含十二烷基硫酸鈉或尿素之類的變性劑，以及三(羥甲基)氨基甲烷(tris)、甘氨酸或n-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)之類的緩沖劑。電泳凝膠、尤其是用于分離蛋白質或核酸的凝膠的其它常用成分對于技術人員是顯而易見的。
在一些實施方式中，所述凝膠包含添加劑，與在不存在這些添加劑的情況下實施時相比，該添加劑讓蛋白質在更高的施加電壓下在凝膠中更快地遷移。所述添加劑也通過防止條帶重疊來改善蛋白質的分離，所述條帶重疊可由凝膠與支持該凝膠的容器之間的間隙或不希望的相互作用所致(參見，例如美國專利第7,056,426號)。此類添加劑的示例包括：聚(乙烯醇)、瓊脂糖、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(丙二醇)、聚(丙二醇)/聚(乙二醇)共聚物，以及直鏈聚丙烯酰胺。包含一種或多種這些添加劑的電泳凝膠能夠從bio-rad公司以‘tgx’名稱獲得。
在一些實施方式中，所述凝膠也包含三氯乙醇或三氯乙酸之類的鹵代有機化合物作為成分。該化合物可在原位與所述凝膠中的蛋白質的色氨酸殘基反應，生成可檢測的熒光產物。該反應以及用于實施該反應并檢測其產物的相關試劑、設備和方法有時被稱為‘stain-freetm’(bio-rad)。
在電印跡之前，可通過實施電泳或“跑”膠在所述凝膠中分離生物大分子。這可采用任意所需的技術來實施，并且可使用任何可獲得的材料或設備。在標準操作中，將所述凝膠與電極緩沖液接觸并置于具有相反極性的兩個電極之間。由電極間產生的電場來驅動電泳。加載到所述凝膠中的蛋白質或其它大分子在凝膠中遷移，遠離加載位置，并基于分子量、尺寸或電荷而彼此分離。電泳也可將大分子與污染物分離，所述污染物可能會作為生物樣品的一部分加載到凝膠上。當施加電勢差時，所述污染物可能無法進入凝膠，其可能從該凝膠擴散進入周圍的緩沖液，或可能比感興趣的大分子更慢或更快地通過該凝膠。出于方便且必要時，可將分子量標志物和生物樣品一起加載進入所述凝膠，從而允許操作者在遷移過程中或遷移后跟蹤大分子的位置。
在一些實施方式中，電泳和電印跡使用不同的系統(tǒng)或設備來實施。例如，可以在將所述凝膠保留在一個設備中的情況下實施電泳，隨后將所述凝膠從該設備中移出并插入本發(fā)明的電印跡的導電聚合物電極之間。
本發(fā)明也可使用任何電印跡用印跡膜。標準印跡膜由硝酸纖維素、尼龍或聚偏氟乙烯(pvdf)制成。應認識到，一個特定系統(tǒng)中最適合使用的印跡膜取決于欲轉移的生物大分子的類型、電泳凝膠的組成、轉移后實施的任何檢測方案的細節(jié)或其它考慮因素。在一些實施方式中，所述印跡膜的尺寸至少和平板凝膠一樣大，從而使得分布在凝膠中的任何生物大分子無論其位置在哪里均可遷移至所述印跡膜。
在該系統(tǒng)中，電泳凝膠和印跡膜容納在電極之間的間隙中。如上所述，該間隙可由包括在電極中的任意剛性盒體上的凸起產生。如上所述，所述電源用于經由所述端子向所述電極輸送電能，其中，輸送至一個電極的電流與輸送至另一個電極的電流極性相反。通過將電泳凝膠和印跡膜夾在電極之間，經由端子輸送的電流可在電極間流動，流經所述凝膠和膜并促進電印跡。所述系統(tǒng)還用于，在不存在與電泳平板凝膠或膜接觸的外源的緩沖液、電解質或溶劑的情況下，通過向電極輸送電能而將生物大分子從電泳平板凝膠轉移至膜?？梢栽谕耆稍锏慕Y構、只存在源自凝膠的任何必要的液體和電解質的條件下進行有效的轉移，其部分原因在于，與普通的金屬電極相比，在所述導電聚合物電極表面更少發(fā)生電化學反應。
在一些實施方式中，所述系統(tǒng)也包括夾子，該夾子如上所述用于將兩個電極在電泳平板凝膠和印跡膜周圍固定在一起。當電極如此固定時，電極的基質彼此面對且平行，并且所述夾子對電極施力以保持各電極與電泳平板凝膠或印跡膜接觸，并保持電泳平板凝膠與印跡膜相互接觸。所以，所述夾子確保電流可以在電極的基質之間流動并同時流經電泳平板凝膠和印跡膜。優(yōu)選地，當電極用夾子如此固定時，各電極的基質與電泳平板凝膠或印跡膜的接觸面積達到最大，進而所述凝膠或印跡膜的可供電流流通以及生物大分子轉移的面積達到最大。這可通過將力均勻地施加在電極基質的整個面積上、或者將夾子與電極盒體聯(lián)用來實現，所述電極盒體通過形狀互補的唇緣或校準樁、校準孔而彼此嚙合。如果需要，所述夾子可與各電極的端子電連接，并且用來將電能從電源輸送至所述端子。
iv.方法
本發(fā)明的實施方式也包括一種用于通過電印跡將生物大分子從電泳平板凝膠轉移至印跡膜的方法?？梢杂帽旧暾埖脑噭┖?、系統(tǒng)和方法來轉移的生物大分子(本文章也稱為生物物質)包括但不限于：蛋白質、核酸、脂質、烴類以及它們的變體(例如經翻譯后修飾的蛋白質、糖基化的蛋白質、天然蛋白質、變性蛋白質、抗體、抗體片段、蛋白質－小分子偶聯(lián)物、蛋白質－核酸偶聯(lián)物、dna和rna)。這種生物大分子可以是天然存在的、化學合成的或化學修飾的。
方法可采用以上所述的任何導電聚合物電極來實施。兩個導電聚合物電極的基質可彼此面對配置，使得各電極與電泳平板凝膠或印跡膜接觸，并且電泳平板凝膠與印跡膜相互接觸。如上所述，電泳平板凝膠和印跡膜可容納在電極之間的間隙中。通過與電源連接的電極端子，可經由端子向電極輸送電能，其中，輸送至一個電極的電流與輸送至另一個電極的電流極性相反。于是，生物大分子通過電印跡從電泳平板凝膠轉移至印跡膜。
在一些實施方式中，通過跟蹤電極端子之間的電流或電勢差來監(jiān)測電印跡的進度。這可采用例如電源的數字顯示器來實施。電流或電壓可隨著各電極中的導電聚合物化合物發(fā)生氧化或還原而上升、下降或波動。因此，可以對電極供電，直至電流或電壓到達預定水平(例如下降至低于閾值或上升至高于閾值)為止。在一些實施方式中，以恒定的電壓供電，直至電流下降至低于閾值為止。在一些實施方式中，以恒定的電流供電，直至電壓超過閾值為止。
或者或附加的，可通過觀察電極基質的顏色來監(jiān)測電印跡的進度，該顏色可因電變色而隨時間變化。例如，在pedot:pss電極中，深藍色或淺藍色分別可表示還原或氧化的pedot。因此，在本方法中，可以供電直至一個電極呈現所需的顏色、或兩個電極呈現可區(qū)分的顏色為止。這些顏色可根據需要進行定性或定量的測定。例如，一個電極基質的顏色可通過在所需的波長處測定被基質(或其一部分)吸收、傳播或反射的光量來定量地測定。為了觀察電極基質的顏色，可將各基質周圍的任意外殼的一部分、例如剛性盒體設置成透明的。
在電印跡之前，兩個電極的導電聚合物混合物可具有相同、相似或不同的氧化態(tài)。例如，一個電極(例如陰極)最初可以是被氧化的，而另一個電極(例如氧化)最初可以是被還原的。電極的初始氧化態(tài)可根據需要例如在電極基質的制備過程中設立。不受理論的限制，電印跡過程中的電流流動導致自由電子從陽極經由電源遷移至陰極，而帶正電的電解質(例如鈉離子)從陽極的基質經由電泳平板凝膠和陰極膜遷移至陰極的基質。陽極中的共軛有機聚合物可因被氧化而帶更多正電，并且與聚電解質或其它抗衡離子更強地結合。在一些實施方式中，所述陽極在電印跡過程中與電泳平板凝膠接觸并電相接。在另一實施方式中，所述陽極在電印跡過程中與印跡膜接觸并相接。相對于陽極和陰極的電泳平板凝膠和印跡膜的合適的位置取決于電印跡過程中被轉移的生物大分子所攜帶的電荷(如果有的話)。
可以在電印跡之前實施標準程序，以使生物大分子在電泳凝膠中分離或分布。類似地，可以在電印跡之后用標準程度來檢測印跡膜上的生物大分子。
在一些實施方式中，可以對電極進行重整，以逆轉電印跡過程中發(fā)生的電極的氧化態(tài)變化。重整可通過在電極之間放置空白電泳凝膠或其它導電性的含有電解質的介質、并使電流在電極間沿著與電印跡中所用的電流方向相反的方向流動來實施?；蛘撸卣稍陔姌O的循環(huán)使用過程中實施。例如，電極可設置成使得各電印跡程序中的電流方向與上一道程序中所用的電流方向相反。所以，在一道程序中被氧化的電極可在下一道程序中被還原，反之亦然。電極之間的電泳凝膠和印跡膜的方向可適當地切換，以確保在每一道程序中都能實現生物大分子從電泳凝膠到印跡膜的生產性電印跡。重整可增加一對導電聚合物電極可使用的電印跡程序的數量，并延長電極的使用壽命。
在一些實施方式中，對電極進行預調節(jié)，從而在電印跡之前優(yōu)化電極的氧化態(tài)。例如，可將空白電泳凝膠置于電極之間，并且可使電流在電極間流動，從而將一個電極充分氧化并將一個電極充分還原。如上所述，電極的氧化態(tài)可采用電流或電壓的變化、或采用電變色來監(jiān)測。然后，可將空白電泳凝膠替換成含有生物大分子的電泳凝膠和印跡膜。為了實現電印跡，隨后可使電流在電極間沿著與預調節(jié)中所用的電流方向相反的方向流動。預調節(jié)步驟可增加在電印跡過程中能夠在兩個導電聚合物電極間流動的電流量。
根據需要，可以在本方法的一次執(zhí)行或多次執(zhí)行中使用一對導電聚合物電極。單次使用的(即一次性的)電極可通過省去在電印跡之后清潔或重整電極的需要而提供方便。所以，在每道電印跡程序中都使用新的一對電極可在使用時節(jié)省時間和/或能量。若各對電極是一致性地制備的，則就初始氧化態(tài)和基質組成等因素而言，單次使用的電極也可提供比多次使用的電極更好的電印跡程序間的再現性。另一方面，多次使用的電極可節(jié)約成本。在一些實施方式中，導電聚合物電極設置成具有可替換的基質，使得，例如可在多次使用的盒體中安裝單次使用的基質。
在本方法的一些實施方式中，也包括將兩個電極固定在一起。如上所述，該電極例如可使用夾子或包封基質的剛性盒體的特征來固定。在一些實施方式中，不存在與電泳平板凝膠或印跡膜接觸的外源的緩沖液、電解質或溶劑。
v.實施例
由皮氏培養(yǎng)皿構建兩個導電聚合物電極，并用該導電聚合物電極來實施蛋白質的電印跡。
在各皮氏培養(yǎng)皿的底板上切入一個矩形貫通孔，并用一塊作為多孔性膜的硝酸纖維素覆蓋。將該矩形貫通孔用塑料擋板圍住，該塑料擋板與皮氏培養(yǎng)皿的底板垂直并連結在一起，從而在硝酸纖維素上方限定一個空腔。向該空腔內填充pedot:pss(1.3重量％)的水性分散體，并將導線末端浸沒在該分散體中。隨后向該分散體中加入3nm
將兩塊皮氏培養(yǎng)皿放在一起，以使皮氏培養(yǎng)皿的底板彼此面對，并使硝酸纖維素對齊。將一塊已經通過電泳進行了分離的、含有經染色的蛋白質的電泳凝膠和印跡膜一起放置于皮氏培養(yǎng)皿之間。空腔內的導線與電源連接，電流在導電聚合物電極間流動，因而導致蛋白質從電泳凝膠轉移至印跡膜。電印跡后，經染色的蛋白質在印跡膜上可見。
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在所附的權利要求書中，術語“一個”或“一種”意圖表示“一個(種)或多個(種)”。當術語“包括”及其變體如“包含”和“含有”位于一個步驟或元件之前的時候，意圖表示其它步驟或元件的進一步加入是任選的并且非排他性的。
在此引用的所有文獻(例如專利、專利申請、書籍、雜志或其它出版物)通過引用全文納入本文并用于所有目的，就好像將各篇文獻特定和單獨地通過引用全文納入本文并用于所有目的一樣。對于通過引用納入的這些文獻與本說明書中包含的記載相矛盾的情況，本說明書意圖取代和/或優(yōu)先于任何矛盾之處。
可以在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的條件下對本發(fā)明進行多種修改和改變，這對本領域技術人員來說顯而易見的。本文所述的具體實施方式僅以舉例的方式提供，并不意味著以任何方式受到限定。本說明書和實施例應僅僅視為示例,本發(fā)明真正的范圍和精神由所附權利要求書來限定。
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