本實用新型涉及生物檢測領域，具體的，本實用新型涉及檢測樣品中CRP的芯片和試劑盒。
背景技術：
C反應蛋白(CRP)于1930年被蒂利特和弗朗西斯最早從肺炎球菌肺炎感染病人身上發(fā)現(xiàn)。這種蛋白分子量為118kDa，其天然結構由五個非共價鍵合和的相同亞基構成。目前，CRP的已被公認為感染或炎癥的早期指標，同時也被認為是許多疾病的通用生物標記物。由于這些疾病開始發(fā)生時，體內的CRP濃度非常低，10nM或甚至pM水平，這就要求所使用的分析方法必須具有高度靈敏度、選擇性，而且還需具備速度快，使用最小的樣品消耗等特點。
因此，在滿足這些要求下，靈敏地分析生物體液中CRP的水平對于診斷和監(jiān)測化療/ 個性化醫(yī)療干預的進展至關重要。
技術實現(xiàn)要素：
本實用新型是基于發(fā)明人對以下問題和事實的發(fā)現(xiàn)而提出的：
當前，臨床檢測CRP的主要有免疫層析、免疫比濁、酶聯(lián)免疫和化學發(fā)光檢測。免疫層析技術發(fā)展成熟、檢測快速、無需專業(yè)技術人員參與，但是其檢測靈敏度較低，通常只能用于定性或半定量檢測，其主要應用在對靈敏度和特異性要求不是很高的快速體外診斷檢測項目中。免疫比濁法操作簡單，檢測速度快、定量效果佳、專業(yè)技能要求低，但是其靈敏度不高，嚴重限制了其應用廣度。酶聯(lián)免疫吸附檢測成本低，技術成熟，但其檢測時間長，檢測靈敏度不高，在西方發(fā)達國家基本已被淘汰?；瘜W發(fā)光屬于一種自發(fā)光的檢測技術，靈敏度高，目前化學發(fā)光免疫檢測在我國三甲醫(yī)院已經廣泛使用，然而其通常需要昂貴復雜的大型設備，且每次只能檢測一項指標，是單通量的檢測方法，其在檢測單個樣品中多項指標時需耗費多倍的時間、樣品和費用。蛋白芯片是近十幾年來伴隨著基因芯片迅速發(fā)展起來的一項新技術。它通過微電子技術及表面化學技術把各種蛋白質高密度、有序地排列在固相支持物表面，然后通過探針蛋白特異性地捕獲樣品中的靶蛋白，并運用相應檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性、定量分析，是一種新的高通量分析技術。蛋白芯片技術具有樣品耗費少、高通量的優(yōu)點，是一種理想的多目標檢測方式。然而，傳統(tǒng)的蛋白芯片檢測靈敏度低，限制了它在醫(yī)療診斷中的應用。
而表面等離子體光子學是將表面等離子體技術應用到光子學領域而發(fā)展出來的一門新的學科。經科學家特殊設計的等離子體納米顆?？梢栽谕饨绻獾淖饔孟掳l(fā)生共振，從而可作為一個有效的光學納米天線捕獲更多的光信號，這種特殊的物理現(xiàn)象可被應用于熒光增強。
本實用新型利用等離子體基底制備等離子體熒光增強CRP檢測芯片，并將其應用到臨床血液檢測中。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，所制備的等離子體熒光增強CRP芯片可以實現(xiàn)采集指尖血全血或血清的檢測，血液樣本體積只需1uL。可以同時實現(xiàn)超敏CRP和常規(guī)CRP的全程檢測，檢測范圍0.2-160mg/L,其檢測時間≤15min，同時所得到的結果與現(xiàn)有常用的臨床 CRP檢測方法(免疫比濁法)具有良好的相關性。
基于此，在本實用新型的第一方面，本實用新型提出了一種檢測樣品中CRP的芯片。根據(jù)本實用新型的實施例，所述芯片包括：基底；負載層，所述負載層形成在所述基底的表面，并且所述負載層是由等離子體納米金屬顆粒形成的；捕獲層，所述捕獲層形成在所述負載層的上表面，所述捕獲層攜帶有第一CRP捕獲抗體，所述第一CRP捕獲抗體特異性針對所述CRP。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片，能夠高靈敏、快速檢測樣品中的CRP。根據(jù)本實用新型的實施例，所述樣品可以全血樣品或血清樣品。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片，對樣品中CRP的檢測靈敏度可低至0.2mg/L，檢測范圍為0.2～160mg/L，對樣品的用量要求可低至1μL，而檢測時間相比于現(xiàn)有技術大幅縮短，檢測用時可控制在15min 以內，并且可實現(xiàn)對CRP的高通量檢測。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述檢測樣品中CRP的芯片還可以進一步包括如下附件技術特征至少之一：
根據(jù)本實用新型的實施例，所述負載層為等離子體納米金層或等離子體納米銀層。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述負載層包括多個非連續(xù)的金島。根據(jù)本實用新型的實施例，所述金島由等離子體納米金顆粒形成，金島可以在外界光的作用下發(fā)生共振，可作為一個有效的光學納米天線捕獲更多的光信號，從而對熒光信號起到增強作用。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述多個金島在所述基底的外表面平均分布，并且所述金島的島面積為100～100000nm2。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述金島的島面積為15000～60000nm2。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述負載層的厚度為10～500nm。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述負載層的厚度為10～200nm。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述負載層的厚度為10～70nm。根據(jù)本實用新型的實施例，所述多個非連續(xù)的金島中相鄰兩個金島的距離為1～100nm納米之間。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述多個非連續(xù)的金島中相鄰兩個金島的距離為5～50nm。多個金島中相鄰兩個金島的距離在5～50nm之間，進而可有效提高金顆粒間的局部電場，進而有效增強熒光分子的激發(fā)。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述基底是由玻璃、硅片或塑料形成的。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述基底是由玻璃形成的。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，玻璃基底具有光學透明的特性，有利于熒光檢測，且玻璃基底表面容易進行化學修飾，方便操作。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述捕獲層包括多個捕獲印斑。根據(jù)本實用新型的實施例，當采用本實用新型的芯片檢測樣品中的CRP時，捕獲層以捕獲印斑的形式設置，捕獲印斑捕獲CRP抗原后，再與攜帶近紅外熒光染料標記的檢測抗體(第二CRP抗體)反應形成免疫三明治結構，此時，檢測抗體上的近紅外熒光信號可在等離子熒光增強作用下放大約 100倍，從而極大地增加對CRP檢測的靈敏度。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述多個捕獲印斑呈圓形，并且所述圓形的直徑為10微米～1厘米。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述圓形的直徑為300微米～500微米。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述捕獲層進一步攜帶有雞IgY抗體，并且所述雞IgY抗體、所述第一CRP捕獲抗體分別設置在不同的捕獲印斑上。在本申請的實施例中，設置有第一CRP捕獲抗體的捕獲印斑被稱為CRP檢測印斑，設置有雞IgY抗體的捕獲印斑被稱為參考印斑。根據(jù)本實用新型的實施例，在檢測血液樣品中的CRP實驗中，可通過羊抗雞 IgY抗體與雞IgY抗體的特異性結合，進而獲得可作為參考印斑上的熒光值，從而通過檢測標準CRP樣品，獲得CRP檢測印斑點上的熒光值與參考印斑上的熒光值的比值，以標準CRP樣品的濃度為橫坐標，比值為縱坐標，繪制“CRP濃度-比值”的標準曲線。在檢測待測樣品中CRP濃度時，可依據(jù)獲得的CRP檢測印斑點上的熒光值與參考印斑上的熒光值的比值，對應“CRP濃度-比值”的標準曲線，精確獲得待測樣品中CRP的濃度。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片檢測樣品中的CRP，可減少干擾，提高定量檢測準確性。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述捕獲印斑是利用微量點樣儀采用0.5～2微摩爾/升的濃度的抗體溶液進行打印形成的。根據(jù)本實用新型的實施例，采用的微量點樣儀能夠將第一 CRP捕獲抗體精確地與負載層進行結合固定，進而能夠精確控制第一CRP捕獲抗體的點樣量、點樣斑點的大小，進而對CRP的檢測更加準確。根據(jù)實用新型的實施例，所述第一 CRP捕獲抗體與負載層的連接方式為物理吸附。
在本實用新型的第二方面，本實用新型提出了一種檢測樣品中CRP的芯片。根據(jù)本實用新型的實施例，所述芯片包括：玻璃基底；負載層，所述負載層形成在所述玻璃基底的外表面的至少一部分，并且所述負載層由多個金島構成，所述多個金島在所述玻璃基底的外表面間隔設置，并且所述金島是由等離子體納米金顆粒形成的，所述多個金島在所述玻璃基底的外表面平均分布，所述多個金島中相鄰兩個的間距為5～50nm，所述金島的厚度為 10～70nm；捕獲層，所述捕獲層形成在所述多個金島的至少一個上，并且所述捕獲層攜帶第一CRP捕獲抗體，所述捕獲層是由多個間隔設置的捕獲印斑構成的，并且一個捕獲印斑至少在一個所述金島的上表面，所述捕獲印斑呈圓形，所述圓形的直徑為300微米～500微米，任選地，所述第一CRP捕獲抗體特異性針對所述CRP。任選地，所述捕獲層進一步攜帶雞IgY抗體，并且所述雞IgY抗體、所述第一CRP捕獲抗體分別設置在不同的捕獲印斑上，任選地，所述捕獲印斑是利用GeSim Nano-Plotter TM 2.1點樣儀采用0.5～2微摩爾/升的濃度的抗體溶液進行打印形成的。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片，能夠快速、高靈敏度地檢測樣品中的CRP。根據(jù)本實用新型的實施例，所述樣品可以是全血樣品或血清樣品。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片，對樣品中預定抗原CRP的檢測靈敏度可低至 0.2mg/L，檢測范圍為0.2～160mg/L，對樣品的用量要求可低至1uL，而檢測時間相比于現(xiàn)有技術大幅縮短，檢測用時可控制在15min以內，并且可實現(xiàn)對CRP的高通量檢測。
在本實用新型的第三方面，本實用新型提出了一種檢測檢測樣品中CRP的試劑盒。根據(jù)本實用新型的實施例，所述試劑盒包括前面所述的檢測樣品中CRP的芯片以及任選的第二抗體容器，所述第二抗體容器中設置有第二CRP檢測抗體，所述第二CRP檢測抗體特異性針對所述CRP，并且所述第二CRP檢測抗體具有近紅外熒光染料標記。利用根據(jù)本實用新型實施例的試劑盒，對樣品中預定抗原CRP的檢測靈敏度可低至0.2mg/L，檢測范圍為 0.2～160mg/L，對樣品的用量要求可低至1μL，而檢測時間相比于現(xiàn)有技術大幅縮短，檢測用時可控制在15min以內，并且可實現(xiàn)對CRP的高通量檢測。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述檢測樣品中CRP的試劑盒還可以進一步包括如下附件技術特征至少之一：
根據(jù)本實用新型的實施例，所述近紅外熒光染料標記為IR800。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相比于cy5 等其它染料，IRDye800標記的第二CRP檢測抗體在前面所述的檢測樣品中CRP的芯片上可獲得高達2個數(shù)量級的熒光增強效果。進而利用本實用新型實施例的試劑盒檢測樣品中預定抗原CRP，檢測靈敏度會進一步顯著提高。
附圖說明
圖1是根據(jù)本實用新型實施例的芯片的縱相剖面圖；
圖2是根據(jù)本實用新型實施例的芯片的負載層的結構示意圖；
圖3是根據(jù)本實用新型實施例的芯片的捕獲層的結構示意圖；
圖4是根據(jù)本實用新型實施例的芯片的結構示意圖；
圖5是根據(jù)本實用新型實施例的等離子體芯片結構的掃描隧道電子顯微鏡照片；
圖6是根據(jù)本實用新型實施例的芯片的檢測示意圖；
圖7是根據(jù)本實用新型實施例的檢測區(qū)分布示意圖；
圖8是根據(jù)本實用新型實施例的標準曲線；
圖9是根據(jù)本實用新型實施例的利用本實用新型的芯片檢測稀釋800倍后的45例血清樣本中的CRP濃度的結果與臨床結果的相關性分析；以及
圖10是根據(jù)本實用新型實施例的利用本實用新型的芯片檢測稀釋800倍后的45例全血樣本中的CRP濃度結果與臨床結果的相關性分析。
具體實施方式
下面詳細描述本實用新型的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本實用新型，而不能理解為對本實用新型的限制。
檢測樣品中CRP的芯片
在本實用新型的第一方面，本實用新型提出了一種檢測樣品中CRP的芯片。根據(jù)的本實用新型的實施例，參考圖(縱相剖面)1，所述芯片包括：基底100；負載層200，所述負載層200形成在所述基底100的表面，并且所述負載層是由等離子體納米金屬顆粒形成的；捕獲層300，所述捕獲層300形成在所述負載層的上表面，所述捕獲層300攜帶有第一CRP捕獲抗體，所述第一CRP捕獲抗體特異性針對所述CRP。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述負載層為等離子體納米金層或等離子體納米銀層。即負載層可由等離子體納米金顆?；蜚y顆粒形成。當負載層為等離子體納米金層時，根據(jù)本實用新型的具體實施例，參考圖2，所述負載層200包括多個金島210。根據(jù)本實用新型的實施例，所述金島210由等離子體納米金顆粒形成，金島210可以在外界光的作用下發(fā)生共振，可作為一個有效的光學納米天線捕獲更多的光信號，從而對熒光信號起到增強作用。
根據(jù)本實用新型的再一具體實施例，所述多個金島210在所述基底100的外表面平均分布，所述金島的島面積為100～100000nm2。
根據(jù)本實用新型的再一具體實施例，所述金島的島面積為15000～60000nm2。
根據(jù)本實用新型的再一具體實施例，金島210所形成負載層200的厚度為10～500nm。
根據(jù)本實用新型的再一具體實施例，金島210所形成負載層200的厚度10～200nm。
根據(jù)本實用新型的再一具體實施例，金島210所形成負載層200的厚度為10～70nm。
根據(jù)本實用新型的再一具體實施例，多個金島210中相鄰兩個金島的距離在1～100納米之間。
根據(jù)本實用新型的再一具體實施例，多個金島210中相鄰兩個金島的距離在5～50nm。進而可有效提高金顆粒間的局部電場，進而有效增強熒光分子的激發(fā)。
所述基底的材料不受特別限制，根據(jù)本實用新型的具體實施例，所述基底的材料可采用玻璃、硅片或塑料形制成的。根據(jù)本實用新型的具體實施例，優(yōu)選采用玻璃。玻璃基底光學透明，有利于熒光檢測、其表面容易進行化學修飾、成本低廉且加工工藝成熟，是工業(yè)上常用的廣學檢測基材。
根據(jù)本實用新型的具體實施例，所述基底100和負載層200形成的結構被稱為等離子體芯片結構。其中等離子體芯片結構可通過液相種子生長法在玻璃基片上原位制備。根據(jù)本實用新型的實施例，所述液相種子生長法的操作步驟如下所述：1)將玻璃基底與氨水和氯金酸接觸，以便獲得第一等離子體芯片結構半成品；2)將所述第一等離子體芯片結構半成品與硼氫化鈉接觸，以便獲得第二等離子體芯片結構半成品；以及3)將所述第二等離子體芯片結構半成品與氯金酸和羥胺接觸，以便獲得所述等離子體芯片結構，在步驟1) 中，所述接觸的時間為0.5min～3min,所述氨水的濃度為100mmol/L～1000mmol/L，所述氯金酸的濃度為0.1mmol/L～25mmol/L，在步驟2)中，所述接觸的時間為0.5min～3min,所述硼氫化鈉溶液的濃度為0.1mmol/L～10mmol/L，在步驟3)中，所述接觸的時間為 11min～23min,所述氯金酸的濃度為0.1mmol/L～1mmol/L，所述氯金酸和所述羥胺的摩爾比為1：1。利用根據(jù)本實用新型實施例的上述操作獲得的等離子體芯片結構，等離子體芯片結構表面的負載層(200)貴金屬膜的形貌和厚度得到了精準的控制，獲得的等離子體金屬層具有非連續(xù)的金島結構210，每個金島的大小合適，金島210之間的距離均勻分布于～10nm 左右，非常適用于近紅外(650nm～1700nm)的熒光增強的生物分子檢測。
根據(jù)本實用新型的實施例，參考圖3，所述捕獲300包括多個捕獲印斑310。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，捕獲層以捕獲印斑310的形式設置，可有效實現(xiàn)CRP的高通量捕獲和檢測。根據(jù)本實用新型的具體實施例，所述捕獲印斑310呈圓形，并且所述圓形的直徑為300微米～500微米。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述捕獲層進一步攜帶雞IgY抗體，并且所述雞IgY抗體、所述第一CRP捕獲抗體分別設置在不同的捕獲印斑310上。根據(jù)本實用新型的實施例，在捕獲血液樣品中的CRP實驗中，可通過羊抗雞IgY抗體與雞IgY抗體的特異性結合，進而獲得可作為參考點的熒光值，從而通過CRP標準品的熒光值與參考點的熒光值的比值，獲得“CRP濃度-比值”的標準曲線。
根據(jù)本實用新型的具體實施例，所述捕獲印斑是利用微量點樣儀采用0.5～2微摩爾/升的濃度的抗體溶液進行打印形成的。根據(jù)本實用新型的實施例，采用微量點樣器，如 GeSimNano-Plotter TM微量點樣器，能夠將第一CRP捕獲抗體精確地與負載層200進行結合固定，進而能夠精確控制第一CRP捕獲抗體的點樣量、點樣斑點的大小，進而對CRP 的檢測更加準確。所述第一CRP捕獲抗體與負載層200的連接方式不受特別限制，根據(jù)實用新型的實施例，可采用物理吸附的方式進行連接。
根據(jù)本實用新型的實施例，所述樣品可以采用全血樣品或血清樣品。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片，對樣品中CRP的檢測靈敏度可低至0.2-160mg/L，樣品的用量可低至1 uL，而檢測時間相比于現(xiàn)有技術大幅縮短，檢測用時可控制在15min以內，并且可實現(xiàn)對 CRP的高通量檢測。本實用新型的芯片，相對于傳統(tǒng)的以玻璃或硝酸纖維素膜為基底芯片熒光檢測，傳統(tǒng)的芯片熒光檢測在檢測過程中需要耗費更多的孵育時間，用于保證樣品中更多的CRP被芯片基底捕獲，后續(xù)才可檢測到。而本實用新型的芯片中的裸金等離子體結構具有熒光放大的作用，可極大地提高靈敏度，只需極其微量的CRP被捕獲便可檢測到。因此可很大程度地減少孵育時間(約5min)，最終使檢測時間可縮短至15min，
在本實用新型的第二方面，本實用新型提出了一種檢測樣品中CRP的芯片。根據(jù)本實用新型的實施例，參考圖4，所述芯片包括：玻璃基底100；負載層200，所述負載層200 形成在所述玻璃基底的外表面的至少一部分，并且所述負載層200由多個金島210構成，所述多個金島210在所述玻璃基底100的外表面間隔設置，并且所述金島210是由等離子體納米金顆粒形成的，所述多個金島在所述玻璃基底的外表面平均分布，所述多個金島210 中相鄰兩個的間距為5～50nm，所述金島210的厚度為10～70nm；捕獲層300，所述捕獲層 300形成在所述多個金島210的至少一個上，并且所述捕獲層攜帶第一CRP捕獲抗體，所述捕獲層300是由多個間隔設置的捕獲印斑310構成的，并且一個捕獲印斑310至少在一個所述金島210的上表面，所述捕獲印斑310呈圓形，所述圓形的直徑為300微米～500微米，任選地，所述第一CRP捕獲抗體特異性針對所述CRP，任選地，所述捕獲層300進一步攜帶雞IgY抗體，并且所述雞IgY抗體、所述第一CRP捕獲抗體分別設置在不同的捕獲印斑310上，任選地，所述捕獲印斑310是利用GeSim Nano-Plotter TM 2.1點樣儀采用0.5～2 微摩爾/升的濃度的抗體溶液進行打印形成的。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片，能夠高靈敏度地檢測樣品中的CRP。根據(jù)本實用新型的實施例，所述樣品可以全血樣品或血清樣品。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片，對樣品中CRP的檢測靈敏度可低至0.2-160mg/L，對樣品的用量要求可低至1uL，而檢測時間相比于現(xiàn)有技術大幅縮短，檢測用時可控制在 15min以內，并且可實現(xiàn)對CRP的高通量檢測。
根據(jù)本實用新型的具體實施例，在利用本實用新型的芯片檢測血樣中CRP時，需要加入具有熒光標記的第二CRP檢測抗體，并且所述第二CRP檢測抗體特異性針對CRP。進而第一捕獲抗體和第二檢測抗體均可特異性識別CRP，第二CRP檢測抗體的熒光標記在第二CRP檢測抗體與CRP特異性結合后，在相應激發(fā)光的作用下可發(fā)出熒光，熒光在本實用新型芯片的熒光增強作用下，熒光可被百倍放大，進而利用本實用新型的實施例的芯片檢測CRP，可實現(xiàn)對CRP的高靈敏度、快速、高通量的檢測。
根據(jù)本實用新型的再一具體施例，上述的熒光標記是IRDye800標記。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相對于cy5等其它染料，IRDye800標記的第二CRP檢測抗體在本實用新型的芯片上可獲得高達2個數(shù)量級放大作用的熒光增強效果。
根據(jù)本實用新型的再一具體實施例，在利用本實用新型的芯片檢測血樣的實驗中，需要進一步加入具有熒光標記的羊抗雞IgY抗體。羊抗雞IgY抗體可特異性結合雞IgY抗體。根據(jù)本實用新型的具體實施例，通過羊抗雞IgY抗體與抗體雞IgY抗體的特異性結合，獲得的熒光值可作為參考點的熒光值，進而通過CRP標準品的熒光值與參考點的熒光值的比值，獲得“CRP濃度-比值”的標準曲線。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片檢測樣品中的 CRP抗原，能夠進一步精確確定樣品中抗原CRP的濃度，最大可能地減少不同裝置、不同操作人員、不同操作環(huán)境下造成的檢測誤差。利用根據(jù)本實用新型實施例的芯片檢測樣品中的CRP的濃度，獲得的檢測結果的準確度、可信度、穩(wěn)定性進一步提高。
為了方便理解，根據(jù)本實用新型的一個實施例，下面對利用本實用新型的高靈敏、快速檢測樣品中CRP的芯片檢測樣品中CRP的濃度的方法進行描述：
血清或全血樣品通過兩次稀釋(第一次：1uL稀釋至39uLPBS(10％BSA)中，第二次： 10uL第一次稀釋液加入190uL PBS(10％BSA)中)稀釋至800倍。分別取100微升稀釋液加入至每個孔中，搖動5min。本實用新型的芯片用PBST洗滌三次，隨后用IRDye800標記的抗體(10nM第二CRP抗體和1nM羊抗IgY)在黑暗中5min搖動染色。后用PBST洗滌三次。等離子體芯片最后用純水清洗、在掃描之前的空氣壓縮機干燥。獲取熒光比值(CRP 檢測點的熒光值與參考點熒光值之比)之后，根據(jù)“CRP濃度-比值”的標準曲線求出樣品中CRP的濃度。
檢測樣品中CRP的試劑盒
另一方面，本實用新型提出了一種檢測檢測樣品中CRP的試劑盒。根據(jù)本實用新型的實施例，該試劑盒包括前面所述的檢測樣品中CRP的芯片以及任選的第二抗體容器，所述第二抗體容器中設置有第二CRP檢測抗體，所述第二CRP檢測抗體特異性針對所述CRP，并且所述第二CRP檢測抗體具有近紅外熒光染料標記。其中，近紅外熒光染料標記的類型不受特別限制，根據(jù)本實用新型的具體實施例，所采用的近紅外熒光染料標記可為IR800，相比于采用cy5等其它染料，IRDye800標記的第二CRP檢測抗體在前面所述的檢測樣品中CRP的芯片上可獲得高達2個數(shù)量級的熒光增強效果。進而利用本實用新型實施例的試劑盒檢測樣品中預定抗原CRP，檢測靈敏度會進一步顯著提高。利用根據(jù)本實用新型實施例的試劑盒，對樣品中預定抗原CRP的檢測靈敏度可低至0.2mg/L，檢測范圍為0.2～160mg/L，對樣品的用量要求可低至1μL，而檢測時間相比于現(xiàn)有技術大幅縮短，檢測用時可控制在15min以內，并且可實現(xiàn)對CRP的高通量檢測。
下面詳細描述本實用新型的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本實用新型，而不能理解為對本實用新型的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。
實施例1
在本實施例中，發(fā)明人詳細介紹了本實用新型芯片相關實驗材料的獲得、IRDye800 標記的檢測抗體的獲得以及血清樣本的制備過程。
實驗材料：氯金酸、硼氫化鈉、鹽酸羥胺和二甲亞砜(DMSO)購自Sigma-Aldrich 公司購買。氫氧化銨購買自Fisher化學。脫鹽柱購自GE Healthcare。FAST框架滑動架和滑動快速孵化室從Sigma-Aldrich公司購買。檢測抗體CRP抗體1、捕獲抗體CRP 抗體2、CRP校準品均購自菲鵬生物科技有限公司。800CW NHS酯是由LI- COR公司購買。胎牛血清購自浙江天杭生物技術公司。
IRDye800標記的檢測抗體的獲得：捕獲抗體通過1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亞胺/N-羥基共價偶聯(lián)IRDye800，然后用柱分離未標記的IRDye800。 800CW NHS酯用DMSO稀釋并保存在-20℃，使用前避光。捕獲抗體和IRDye800以 1:1的摩爾比混合4度下?lián)u動，在黑暗中1.5小時。NAP-5柱用于除去未結合的染料。起初，10毫升的PBS加入到柱中，當柱子中溶液自由低落完全后，將PBS加入至先前的標記混合物中，使其總體積達到500微升并加入至柱子中，滴落后，再加入另外500 微升PBS。最后，收集IRDye800標記的檢測抗體，將其儲存在-20℃，使用前避光。
人血清：這項研究調查方案得到了深圳羅湖醫(yī)院的機構倫理委員會的批準。自項目啟動時已取得患者知情同意。實驗中檢測所用到的所有樣品均在深圳羅湖醫(yī)院收集。 3毫升的血液被吸引到一個EDTA管，并分成等份用于血液檢查。對于血清試驗，3 毫升的血液加入至血清管中，并在3000轉每分鐘離心15分鐘。上清液在離心管收集。血清樣本在使用前儲存在-20℃條件下。全血樣本在采集后24h內檢測。
本申請所述的“等離子體芯片結構”(包括基底100和負載層200)在10.0千伏加速電壓、FEG源下通過日立S-4800掃描電子顯微鏡(SEM)觀察，得到如圖5所示的掃描隧道電子顯微鏡照片。
本申請的所述的檢測樣品中CRP的芯片的檢測示意圖如圖6所示。
實施例2 獲得CRP檢測標準曲線
CRP檢測標準曲線制作：采用夾層結構來檢測CRP。通過點樣儀GeSim Nano-Plotter TM 2.1固定捕獲抗體至等離子體芯片結構上。捕獲抗體用PBS稀釋到1 μM，并加入到384孔板中。通過運行設計的打印方案，捕獲抗體按照4nL每個點、每個點重復4次打印，最終獲得～400微米的圓形斑點。該芯片在4℃下放置過夜。取朗道的標準品(CRP標準品)(濃度分別為0、2.5、10、20、80和160mg/L)通過兩次稀釋(第一次：1uL稀釋至39uLPBS(10％BSA)中，第二次：10uL第一次稀釋液加入 190uL PBS(10％BSA)中)稀釋至800倍。分別取100微升稀釋液加入至每個孔中，搖動5min。芯片用PBST洗滌三次，隨后IRDye800標記的抗體(10nM第二CRP抗體和1nM羊抗IgY)在黑暗中5min搖動染色。后用PBST洗滌三次。等離子體芯片最后用純水清洗、在掃描之前的低速離心甩干表面的液體。檢測區(qū)分布示意圖如圖7所示 (其中，各檢測區(qū)域分布有兩行特異檢測區(qū)，每行分布有4個平行的點，第一行固定有雞IgY，用于定量參考；第二行固定有第一捕獲CRP抗體，用于檢測CRP。第二行四個點熒光強度的平均值除以第一行四個點熒光強度的平均值被稱為熒光比值，此值用于CRP的定量檢測。)根據(jù)不同標準樣品的濃度與其熒光比值(同一檢測孔中CRP 檢測點的熒光值與參考點熒光值之比)繪制標準曲線。所得標準曲線如圖8所示(其中，每個濃度檢測5次，橫坐標表示樣品在稀釋800倍前的CRP濃度，縱坐標是根據(jù)圖7中計算所得的熒光比值)。
熒光測量和分析：用MidaScan(NIRMIDAS Biotech)掃描器掃描芯片，選擇800納米通道、激光強度設置為7.0、分辨率設置為20微米。掃描后獲得16位灰度圖像。 MidaScan配套的圖像軟件用于分析該圖像。選擇柵陣列分析模式測量每個點的強度。點陣的形貌由程序自動識別。每個點的強度通過所選區(qū)域總信號強度除以面積獲得。圖像上平行的4個點的平均強度被定義為測試的強度。血清中特異性標記物的濃度與所獲圖像上的熒光強度比值之間存在正相關關系。讀取熒光強度后便可間接地獲得濃度值。
LOD和LOQ計算：LOD和LOQ均是根據(jù)校準曲線進行計算獲得。等離子體芯片的校正曲線的線性擬合方程均通過OriginPro擬合計算獲得。LOD定義為平均空白值加上S.D.的3倍，LOQ定義為平均空白值加上S.D的10倍。
實施例3 CRP檢測芯片的應用
CRP檢測芯片的檢測：采用夾層結構來檢測CRP。通過點樣儀GeSim Nano-Plotter TM 2.1固定捕獲抗體至等離子體芯片結構上。第一捕獲抗體用PBS稀釋到1μM，并加入到384孔板中。通過運行設計的打印方案，第一捕獲抗體按照4nL每個點、每個點重復4次打印，最終獲得～400微米的圓形斑點。該芯片在4℃下放置過夜。血清或全血樣品通過兩次稀釋(第一次：1uL稀釋至39uLPBS(10％BSA)中，第二次：10uL第一次稀釋液加入190uL PBS(10％BSA)中)稀釋至800倍。分別取100微升稀釋液加入至每個孔中，搖動5min。芯片用PBST洗滌三次，隨后IRDye800標記的抗體(10nM CRP 抗體2和1nM羊抗IgY)在黑暗中5min搖動染色。后用PBST洗滌三次。等離子體芯片最后用純水清洗、在掃描之前的空氣壓縮機干燥。獲取熒光比值(同一檢測孔中CRP 檢測點的熒光值與參考點熒光值之比)之后，根據(jù)實施例2中繪制的標準曲線反求出濃度。
進而，發(fā)明人比較了利用本實用新型的芯片檢測獲得的血清或全血中的CRP濃度與臨床檢測結果進行相關性分析，結果如圖9和圖10所示。其中圖9顯示了利用本實用新型的芯片檢測稀釋800倍后的45例血清樣本中的CRP濃度的結果與臨床結果的相關性分析，圖10顯示了利用本實用新型的芯片檢測稀釋800倍后的45例全血樣本的結果與臨床結果的相關性分析，其中，全血CRP濃度是根據(jù)全血樣本中實際檢測到的CRP濃度經血紅細胞壓積較正獲得。圖9和圖10顯示，利用本實用新型的芯片檢測獲得的血清或全血中的CRP濃度與臨床檢測結果具有很好的相關性。
在本實用新型的描述中，需要理解的是，術語“中心”、“縱向”、“橫向”、“長度”、“寬度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”、“內”、“外”、“順時針”、“逆時針”、“軸向”、“徑向”、“周向”等指示的方位或位置關系為基于附圖所示的方位或位置關系，僅是為了便于描述本實用新型和簡化描述，而不是指示或暗示所指的芯片或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構造和操作，因此不能理解為對本實用新型的限制。
在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本實用新型的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。
盡管上面已經示出和描述了本實用新型的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本實用新型的限制，本領域的普通技術人員在本實用新型的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。