本實(shí)用新型屬于色譜柱技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及到一種超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱。

背景技術(shù)：

糜子的基本結(jié)構(gòu)由四部分組成，包括含有纖維素的麩皮，含較豐富營養(yǎng)素的糊粉層，含大量淀粉的胚乳，富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、B族維生素和維生素E的谷胚。糜子作為常見的谷物是人們膳食“金字塔”中最基礎(chǔ)的部分，其最突出的營養(yǎng)特點(diǎn)是含有豐富的B族維生素。B族維生素是水溶性維生素中重要的一類，其中多種是酶的輔基和酶的組成部分。當(dāng)人體內(nèi)缺乏B族維生素時，便可導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生，而人體自身又無法合成這些化合物，必須通過食物鏈或服用復(fù)合維生素制劑給予補(bǔ)充。

隨著人們對生活品質(zhì)要求的提高，復(fù)合維生素制劑及高檔營養(yǎng)品的出現(xiàn)，同時測定谷物中B族維生素的含量引起人們的廣泛關(guān)注。已有B族維生素的檢測方法很多，熒光法、微生物法、分光光度法、自動測定法、高壓液相色譜法和高效毛細(xì)管電泳法等。這些方法多數(shù)是針對某個單一維生素的測定，近年來國內(nèi)外學(xué)者對多種B族維生素的同時測定進(jìn)行了大量研究，出現(xiàn)了許多分析方法，其中以高效液相色譜法和高效毛細(xì)管電泳法為代表的色譜分析法較為突出。目前水溶性 維生素種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分析測定困難。超高效液相色譜法測定水溶性成分效果較好，但色譜柱種類相對有限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本實(shí)用新型提供了一種分離度好、重現(xiàn)性好的超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱。

本實(shí)用新型所述的一種超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱，所述色譜柱包括柱管1、柱帽2、柱塞6、固定相層3、過濾密封元件4和標(biāo)簽卷繞架5；柱管1整體為空心圓柱形，上下兩端處的外壁長于內(nèi)壁，形成內(nèi)部橫檔，用于擱置過濾密封元件4；柱帽2有兩個，密封蓋合在柱管1兩端；柱帽2中央設(shè)有帶內(nèi)螺紋的圓孔，該圓孔與帶外螺紋的柱塞6能密封配合；標(biāo)簽卷繞架5呈半個圓形或半個長方形，焊接在柱管1外側(cè)；固定相層3由C18鍵合硅膠相堆積而成，C18鍵合硅膠相的密度為3-4毫克每立方毫米。

本實(shí)用新型所述的一種超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱，所述色譜柱內(nèi)徑為2.1mm，長度為100mm。

本實(shí)用新型所述的一種超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱，所述C18鍵合硅膠相的平均粒徑為1.8m。

本實(shí)用新型所述的一種超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱，所述柱管1與柱帽2通過內(nèi)外螺紋相接。

本實(shí)用新型所述的一種超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱，所述過濾密封元件4由篩板和密封墊片組成，篩板嵌裝在密封墊片內(nèi)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型所述的超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱的填有高密度、細(xì)粒徑的C18鍵合硅膠相，分離效果好，適宜分離水溶性物質(zhì)；設(shè)有的標(biāo)簽卷繞架不僅能貼標(biāo)簽，也便于使色譜柱從盒子中取出；而且結(jié)構(gòu)簡單，易于生產(chǎn)制造，經(jīng)濟(jì)成本低。

附圖說明

圖1是超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱示意圖。圖2是維生素混標(biāo)的超高效液相色圖譜。圖3是糜子樣品的超高效液相色譜圖。柱管-1、柱帽-2、固定相層-3、過濾密封元件-4、標(biāo)簽卷繞架-5、柱塞-6。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本實(shí)用新型所述的超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱做進(jìn)一步說明，但是本實(shí)用新型的保護(hù)范圍并不限于此。

實(shí)施例1

一種超高效液相色譜法測定維生素B時用的色譜柱，包括柱管1、柱帽2、柱塞6、固定相層3、過濾密封元件4和標(biāo)簽卷繞架5；柱管1整體為空心圓柱形，上下兩端處的外壁長于內(nèi)壁，形成內(nèi)部橫檔，用于擱置過濾密封元件4；柱帽2有兩個，密封蓋合在柱管1兩端；柱帽2中央設(shè)有帶內(nèi)螺紋的圓孔，該圓孔與帶外螺紋的柱塞6能密封配合；標(biāo)簽卷繞架5呈半個圓形，焊接在柱管1外側(cè)；固定相層3由C18鍵合硅膠相堆積而成，C18鍵合硅膠相的密度為3毫克每立方毫米。所述 色譜柱內(nèi)徑為2.1mm，長度為100mm。所述C18鍵合硅膠相的平均粒徑為1.8m。所述柱管1與柱帽2通過內(nèi)外螺紋相接。所述過濾密封元件4由篩板和密封墊片組成，篩板嵌裝在密封墊片內(nèi)。

色譜柱分離維生素B效果驗(yàn)證

1實(shí)驗(yàn)儀器及步驟

1.1材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：維生素B₁(硫胺素)、維生素B₂(核黃素)、維生素B₆(鹽酸吡多醇)、(葉酸)維生素B₉均為中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲酸均為色譜純；氫氧化鈉、鹽酸均為優(yōu)級純。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。樣品材料：山西省農(nóng)科院品資所提供的河曲紅糜子。

1.2儀器與設(shè)備

儀器：超高效液相色譜儀：(Waters HClass，美國waters)；本實(shí)用新型所述的色譜柱；電子天平(BSA124S，德國Sartorius)；高速離心機(jī)(5804R，Eppendorf)；恒溫水浴鍋(HHS，上海博訊)；漩渦混合器(VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1維生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10mg VB₁、VB₆標(biāo)準(zhǔn)品于25mL棕色容量瓶中，加入15mL濃度為0.01mol/L鹽酸溶液并充分振蕩，超聲15min，待全部溶解后，用0.01mol/L鹽酸溶液定容，即得濃度為0.4mg/mL的儲備液。

分別準(zhǔn)確稱取7.5mg VB₂及VB₉標(biāo)準(zhǔn)品于25mL棕色容量瓶中，先 用1.5mL濃度為2mol/L的NaOH溶液溶解后，再加0.01mol/L鹽酸溶液定容，超聲15min，即得濃度為0.3mg/mL的儲備液。低溫避光保存。

1.3.2超高效液相色譜(UPLC)分析條件

流動相A：乙腈；流動相B：0.1％甲酸；柱溫20℃；紫外檢測器，波長275nm；進(jìn)樣體積5L；流速0.3mL/min，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1，分析運(yùn)行時間10min。

表1梯度洗脫程序

1.3.3工作曲線的繪制

分別吸取一定量的6種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配成不同系列的濃度，于2mL離心管中，配成0.05g/mL～2g/mL濃度的混標(biāo)溶液。按照上述條 件進(jìn)樣，以峰面積對質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到4種維生素的線性方程并以3倍信噪比計(jì)算相應(yīng)的檢出限。

1.3.4樣品預(yù)處理方法

稱取5g糜子(精確至0.01g)于150mL錐形瓶，用35mL 0.1％甲酸水溶解，超聲提取60min后，加入乙酸鋅和鐵氰化鉀溶液混勻，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中用0.1％甲酸定容，混勻，濾紙過濾，取濾液過0.22mm水系濾膜，待上機(jī)。樣品譜圖見圖2。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動相選擇

流動相pH值對這4種水溶性維生素的保留時間有影響，pH值越大，保留時間越短，確定最佳pH范圍。

考慮到流動相的選擇對維生素B的色譜分離效果影響較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈-0.1％甲酸作為流動相均能較好的實(shí)現(xiàn)混標(biāo)中4種維生素B的分離，結(jié)果見附圖2。從圖中可以看出乙腈-0.1％甲酸為流動相分離效果較好。各維生素B的出峰順序?yàn)椋篤B₁：0.520min、VB₆:0.990min、VB₉:5.572min、VB₂:6.019min。

2.1.2色譜柱溫對分離效果的影響

乙腈-0.1％甲酸為流動相，分別考察了同等條件下，柱溫為30℃與20℃時的分離效果，通過對照可以看出，柱溫變化對混標(biāo)中4種維生素B的分離效果影響不大。

2.1.3梯度洗脫條件

色譜條件：流動相A為乙腈，B為0.1％甲酸，柱溫20℃，波長275nm，流速0.3mL/min，利用超高效液相色譜柱可以明顯縮短檢測時間并有較好的分離度。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍和檢出限

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)c，峰面積為縱坐標(biāo)y，得到回歸方程。4種水溶性維生素均具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)R²>0.99，滿足檢測需要。方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限，結(jié)果見表。在本試驗(yàn)方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下，取一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行超高效液相色譜測定，以峰面積y對濃度c(ng/mL)做圖，找出線性關(guān)系。并確定方法最低檢測限。

表1四種維生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3精密度與回收率

本法回收率實(shí)驗(yàn)選用已知B族維生素含量的糜子樣品為基質(zhì)，設(shè) 定了3個添加水平，對每個濃度樣品進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測得4種水溶性維生素回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。VB₁、VB₂、VB₆、VB₉、測定回收率分別為96.8％、97.8％、98.9％和102.2％，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2％。

2.4實(shí)際樣品檢測

分別用所建立的超高效液相色譜法測定糜子樣品中的水溶性維生素，得到的實(shí)際測定數(shù)據(jù)與國標(biāo)法實(shí)測值比較，圖3中的結(jié)果表明相對誤差在1.5％～2.1％，均在允許范圍內(nèi)，說明此法測得的糜子樣品的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，適用于糜子及谷物中水溶性維生素的同時測定。糜子中VB₁、VB₂、VB₆、VB₉的含量分別為：1233.838μg/100g樣品、326.191μg/100g樣品、1759.678μg/100g樣品、724.676μg/100g樣品。

3結(jié)論

通過采用了本實(shí)用新型所述色譜柱的UPLC進(jìn)行檢測，10分鐘完成4種水溶性維生素B的測定，方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度。測定結(jié)果與國標(biāo)法測定數(shù)據(jù)比較，結(jié)果均在允許范圍內(nèi)，可對較寬濃度范圍內(nèi)的糜子多種水溶性維生素進(jìn)行同步分析，有助于提高糜子檢測的分析效率，降低成本。豐富糜子水溶性維生素品質(zhì)評價體系，鑒選優(yōu)良種質(zhì)。