1.一種基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB1電化學(xué)檢測(cè)方法,其特征在于:所述檢測(cè)方法將AFB1核酸酸適配體作為分子識(shí)別元件,絲網(wǎng)印刷電極作為換能器,采用恒溫鏈置換擴(kuò)增方法進(jìn)行信號(hào)放大后,再通過(guò)表面臨近雜交反應(yīng)進(jìn)行信號(hào)輸出。
2.如權(quán)利要求1所述的基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB1電化學(xué)檢測(cè)方法,其特征在于:所述AFB1核酸酸適配體的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB1電化學(xué)檢測(cè)方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)磁珠的表面修飾:將生物素標(biāo)記的AFB1核酸適配體和Block探針儲(chǔ)備液,分別經(jīng)95℃ 5min,0℃ 10min的預(yù)處理,然后用AFB1 1×BB緩沖液稀釋至200nM,并于室溫雜交30min,制得雜交混合液;同時(shí),取50 μL磁珠用500 μL AFB1 1×BB緩沖液洗滌兩次;取200μL雜交混合液于離心管中加入洗滌過(guò)的磁珠,于室溫下孵育15min,最后再用500 μL AFB1 1×BB緩沖液,洗滌孵育過(guò)的磁珠兩次,完成磁珠的表面修飾;
(2)絲網(wǎng)印刷電極的預(yù)處理及傳感界面的制備:在經(jīng)無(wú)水乙醇和去離子水洗滌干凈的絲網(wǎng)印刷電極的電極表面上,滴加40 μL 0.1 M H2SO4溶液,在2V直流電壓下活化60s,在活化后的絲網(wǎng)印刷電極上,滴加4 μL含有1μM巰基修飾探針的緩沖溶液,在30℃條件下組裝3h,用AFB1 1×BB緩沖液清洗組裝后的絲網(wǎng)印刷電極,最后滴加4 μL 1 mM6-巰基己醇溶液于室溫中封閉30min,用AFB11×BB緩沖液清洗3次后,將絲網(wǎng)印刷電極吹干于4℃?zhèn)溆茫?/p>
(3)AFB1結(jié)合介導(dǎo)的鏈置換和表面臨近雜交反應(yīng):在AFB1靶標(biāo)溶液中加入50μL步驟(1)中修飾好的磁珠,于室溫下輕輕震蕩孵育30 min,隨后磁分離,取10 μL上清,加入10 μL 10×NEB buffer 3.1、2 μL 0.5 μM 鏈置換探針、2 μL 10 mM dNTPs、4 μL 2 U/μL聚合酶和2 μL 10 U/ μL切刻內(nèi)切酶,用去離子水補(bǔ)充反應(yīng)體系到100 μL,于55℃下反應(yīng)1h;接著添加10 μL二茂鐵標(biāo)記探針,混合均勻后,取40 μL滴加到(2)中,修飾好的絲網(wǎng)印刷電極表面室溫反應(yīng)30 min,最后用1×AFB1緩沖液洗滌干凈并用氮?dú)獯蹈桑?/p>
(4)電化學(xué)檢測(cè):向經(jīng)步驟(3)處理過(guò)的絲網(wǎng)印刷電極表面滴加40 μL 含有10 mM MgCl2的0.1 M KClO4 溶液,然后進(jìn)行差示脈沖電化學(xué)檢測(cè)。
4.如權(quán)利要求2所述的基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB1電化學(xué)檢測(cè)方法,其特征在于:所述步驟(1)中Block 探針的序列如SEQ ID NO:2所示,Block 探針儲(chǔ)液的濃度為10 μM;所述AFB1 1×BB緩沖液的配方為:10 mM Hepes, 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 5 mM MgCl2, pH 7.0。
5.如權(quán)利要求2所述的基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB1電化學(xué)檢測(cè)方法,其特征在于:所述步驟(2)中巰基修飾探針的序列如SEQ ID NO:3所示,巰基修飾探針的緩沖溶液的配方為:1μM巰基修飾探針、1M NaCl和1mM TCEP。
6.如權(quán)利要求2所述的基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB1電化學(xué)檢測(cè)方法,其特征在于:所述步驟(3)中鏈置換探針的序列如SEQ ID NO:4所示,二茂鐵標(biāo)記探針如SEQ ID NO:5所示。
7.如權(quán)利要求2所述的基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB1電化學(xué)檢測(cè)方法,其特征在于:所述步驟(4)中的電化學(xué)檢測(cè)在電化學(xué)工作站上進(jìn)行,具體參數(shù)為窗口掃描寬度為0-0.5 V,脈沖寬度為50 mV,靜默時(shí)間0.2 s,脈沖寬度為0.06 s。
8.如權(quán)利要求1或2所述的基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB1電化學(xué)檢測(cè)方法,作為檢測(cè)作物中AFB1的應(yīng)用。