本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B₁（AFB₁）的檢測，具體涉及一種基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB₁電化學(xué)檢測方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素( aflatoxin，AF) 作為許多霉菌的二級代謝物，在田間和存儲(chǔ)過程中能夠污染大多數(shù)農(nóng)產(chǎn)品，比如谷物、花生、玉米、油籽等多種糧食和飼料，已經(jīng)成為影響食品安全、危害人類和動(dòng)物健康的巨型殺手。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素具有誘導(dǎo)突變、抑制免疫和致癌作用，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物質(zhì)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFM₁和AFM₂等18種，其中以AFB₁最為多見，危害性也最強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，AFB₁的毒性分別是嘔吐毒素的30倍，玉米赤霉烯酮的20倍，氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。因此，很多國家制訂了嚴(yán)格的AF限量標(biāo)準(zhǔn)，其中尤以歐盟的最為苛刻，規(guī)定花生中AFB₁含量不得超過2 ppb，嬰兒食品中AFB₁含量不得高于0.1 ppb（European Commission regulation 1881/2006）。目前黃曲霉毒素B₁（AFB₁）的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析法(TLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA) 等。因大多數(shù)情況下，農(nóng)產(chǎn)品中AFB₁的含量極其微量，所以開發(fā)操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、檢測通量高的檢測方法對于減少AF對人類生命安全的危害、保證國際進(jìn)出口貿(mào)易的暢通具有極其重要的作用。

核酸適配體作為單鏈寡核苷酸（20～60堿基），被稱為“化學(xué)抗體”，具有諸多優(yōu)點(diǎn)：特異性高，兼容性好，穩(wěn)定性好且易合成，易標(biāo)記。電化學(xué)生物傳感檢測方法具有快速、靈敏、儀器設(shè)備簡單等特殊優(yōu)勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決目前AFB₁檢測方法的靈敏度低，操作難度大，檢測成本高的技術(shù)難題，公開了一種基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB₁電化學(xué)檢測方法及應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)難題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB₁電化學(xué)檢測方法，所述檢測方法將AFB₁核酸酸適配體作為分子識(shí)別元件，絲網(wǎng)印刷電極作為換能器，采用恒溫鏈置換擴(kuò)增方法進(jìn)行信號(hào)放大后，再通過表面臨近雜交反應(yīng)進(jìn)行信號(hào)輸出。

所述AFB₁核酸酸適配體的序列如SEQ ID NO：1所示。

基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB₁電化學(xué)檢測方法，包括以下步驟：

（1）磁珠的表面修飾：將生物素標(biāo)記的AFB₁核酸適配體和Block探針儲(chǔ)備液，分別經(jīng)95℃ 5min，0℃ 10min的預(yù)處理，然后用AFB₁ 1×BB緩沖液稀釋至200nM，并于室溫雜交30min，制得雜交混合液；同時(shí)，取50 μL磁珠用500 μL AFB₁ 1×BB緩沖液洗滌兩次；取200μL雜交混合液于離心管中加入洗滌過的磁珠，于室溫下孵育15min，最后再用500 μL AFB₁ 1×BB緩沖液，洗滌孵育過的磁珠兩次，完成磁珠的表面修飾；

（2）絲網(wǎng)印刷電極的預(yù)處理及傳感界面的制備：在經(jīng)無水乙醇和去離子水洗滌干凈的絲網(wǎng)印刷電極的電極表面上，滴加40 μL 0.1 M H₂SO₄溶液，在2V直流電壓下活化60s，在活化后的絲網(wǎng)印刷電極上，滴加4 μL含有1μM巰基修飾探針的緩沖溶液，在30℃條件下組裝3h，用AFB₁ 1×BB緩沖液清洗組裝后的絲網(wǎng)印刷電極，最后滴加4 μL 1 mM6-巰基己醇溶液于室溫中封閉30min，用AFB₁1×BB緩沖液清洗3次后，將絲網(wǎng)印刷電極吹干于4℃?zhèn)溆茫?/p>

（3）AFB₁結(jié)合介導(dǎo)的鏈置換和表面臨近雜交反應(yīng)：在AFB₁靶標(biāo)溶液中加入50μL步驟（1）中修飾好的磁珠，于室溫下輕輕震蕩孵育30 min，隨后磁分離，取10 μL上清，加入10 μL 10×NEB buffer 3.1、2 μL 0.5 μM 鏈置換探針、2 μL 10 mM dNTPs、4 μL 2 U/μL聚合酶和2 μL 10 U/ μL切刻內(nèi)切酶，用去離子水補(bǔ)充反應(yīng)體系到100 μL，于55℃下反應(yīng)1h；接著添加10 μL二茂鐵標(biāo)記探針，混合均勻后，取40 μL滴加到（2）中，修飾好的絲網(wǎng)印刷電極表面室溫反應(yīng)30 min，最后用1×AFB₁緩沖液洗滌干凈并用氮?dú)獯蹈桑?/p>

（4）電化學(xué)檢測：向經(jīng)步驟（3）處理過的絲網(wǎng)印刷電極表面滴加40 μL 含有10 mM MgCl₂的0.1 M KClO₄溶液，然后進(jìn)行差示脈沖電化學(xué)檢測。

所述步驟（1）中Block 探針的序列如SEQ ID NO：2所示，Block 探針儲(chǔ)液的濃度為10 μM；所述AFB₁ 1×BB緩沖液的配方為：10 mM Hepes, 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 5 mM MgCl₂, pH 7.0。

所述步驟（2）中巰基修飾探針的序列如SEQ ID NO：3所示，巰基修飾探針的緩沖溶液的配方為：1μM巰基修飾探針、1M NaCl和1mM TCEP。

所述步驟（3）中鏈置換探針的序列如SEQ ID NO：4所示，二茂鐵標(biāo)記探針如SEQ ID NO：5所示。

所述步驟（4）中的電化學(xué)檢測在電化學(xué)工作站上進(jìn)行，具體參數(shù)為窗口掃描寬度為0-0.5 V，脈沖寬度為50 mV，靜默時(shí)間0.2 s，脈沖寬度為0.06 s。

基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB₁電化學(xué)檢測方法，作為檢測作物中AFB₁的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

（1）本發(fā)明采用AFB₁核酸適配體作為分子識(shí)別元件，特異性進(jìn)一步提高；同時(shí)，因核酸的合成成本非常低，且已經(jīng)商業(yè)化，大大降低了AFB₁的檢測成本。

（2）本發(fā)明利用“化學(xué)抗體”核酸適配體的高特異性特點(diǎn)，結(jié)合鏈置換擴(kuò)增信號(hào)放大策略，同時(shí)采用表面臨近雜交的信號(hào)輸出方式，構(gòu)建了一種測定黃曲霉毒素B₁的電化學(xué)核酸適配體傳感器，具有簡單快捷、高靈敏、高特異性的優(yōu)點(diǎn)。

（3）本發(fā)明采用絲網(wǎng)印刷電極作換能器，具有操作簡單、易于批量分析的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為活化后的絲網(wǎng)印刷電極特征峰值圖。

圖2為檢測原理示意圖。

圖3為檢測方法特異性分析圖。

圖4為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及線性范圍圖。

具體實(shí)施方式

一種基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB₁電化學(xué)檢測方法，所述檢測方法將AFB₁核酸酸適配體作為分子識(shí)別元件，絲網(wǎng)印刷電極作為換能器，采用恒溫鏈置換擴(kuò)增方法進(jìn)行信號(hào)放大后，再通過表面臨近雜交反應(yīng)進(jìn)行信號(hào)輸出。

所述AFB₁核酸酸適配體的序列如SEQ ID NO：1所示。

基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB₁電化學(xué)檢測方法，包括以下步驟：

（1）磁珠的表面修飾：將生物素標(biāo)記的AFB₁核酸適配體和Block探針儲(chǔ)備液，分別經(jīng)95℃ 5min，0℃ 10min的預(yù)處理，然后用AFB₁ 1×BB緩沖液稀釋至200nM，并于室溫雜交30min，制得雜交混合液；同時(shí)，取50 μL磁珠用500 μL AFB₁ 1×BB緩沖液洗滌兩次；取200μL雜交混合液于離心管中加入洗滌過的磁珠，于室溫下孵育15min，最后再用500 μL AFB₁ 1×BB緩沖液，洗滌孵育過的磁珠兩次，完成磁珠的表面修飾；

（2）絲網(wǎng)印刷電極的預(yù)處理及傳感界面的制備：在經(jīng)無水乙醇和去離子水洗滌干凈的絲網(wǎng)印刷電極的電極表面上，滴加40 μL 0.1 M H₂SO₄溶液，在2V直流電壓下活化60s，在活化后的絲網(wǎng)印刷電極上，滴加4 μL含有1μM巰基修飾探針的緩沖溶液，在30℃條件下組裝3h，用AFB₁ 1×BB緩沖液清洗組裝后的絲網(wǎng)印刷電極，最后滴加4 μL 1 mM6-巰基己醇溶液于室溫中封閉30min，用AFB₁1×BB緩沖液清洗3次后，將絲網(wǎng)印刷電極吹干于4℃?zhèn)溆茫?/p>

（3）AFB₁結(jié)合介導(dǎo)的鏈置換和表面臨近雜交反應(yīng)：在AFB₁靶標(biāo)溶液中加入50μL步驟（1）中修飾好的磁珠，于室溫下輕輕震蕩孵育30 min，隨后磁分離，取10 μL上清，加入10 μL 10×NEB buffer 3.1、2 μL 0.5 μM 鏈置換探針、2 μL 10 mM dNTPs、4 μL 2 U/μL聚合酶和2 μL 10 U/ μL切刻內(nèi)切酶，用去離子水補(bǔ)充反應(yīng)體系到100 μL，于55℃下反應(yīng)1h；接著添加10 μL二茂鐵標(biāo)記探針，混合均勻后，取40 μL滴加到（2）中，修飾好的絲網(wǎng)印刷電極表面室溫反應(yīng)30 min，最后用1×AFB₁緩沖液洗滌干凈并用氮?dú)獯蹈桑?/p>

（4）電化學(xué)檢測：向經(jīng)步驟（3）處理過的絲網(wǎng)印刷電極表面滴加40 μL 含有10 mM MgCl₂的0.1 M KClO₄溶液，然后進(jìn)行差示脈沖電化學(xué)檢測。

所述步驟（1）中Block 探針的序列如SEQ ID NO：2所示，Block 探針儲(chǔ)液的濃度為10 μM；所述AFB₁ 1×BB緩沖液的配方為：10 mM Hepes, 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 5 mM MgCl₂, pH 7.0。

所述步驟（2）中巰基修飾探針的序列如SEQ ID NO：3所示，巰基修飾探針的緩沖溶液的配方為：1μM巰基修飾探針、1M NaCl和1mM TCEP。

所述步驟（3）中鏈置換探針的序列如SEQ ID NO：4所示，二茂鐵標(biāo)記探針如SEQ ID NO：5所示。

所述步驟（4）中的電化學(xué)檢測在電化學(xué)工作站上進(jìn)行，具體參數(shù)為窗口掃描寬度為0-0.5 V，脈沖寬度為50 mV，靜默時(shí)間0.2 s，脈沖寬度為0.06 s。

基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB₁電化學(xué)檢測方法，作為檢測作物中AFB₁的應(yīng)用。

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

1．一種基于鏈置換放大和表面臨近雜交策略的黃曲霉毒素B₁（AFB₁）電化學(xué)檢測方法，包括以下步驟：

（1）磁珠的表面修飾

生物素標(biāo)記的AFB₁核酸適配體如SEQ IDNO：1所示，其3’端修飾有Biotin基團(tuán)和10 μM Block 探針如SEQ ID NO：2所示，儲(chǔ)備液先經(jīng)過95℃ 5 min，0℃ 10 min的預(yù)處理，然后用AFB₁ 1×BB緩沖液（10 mM Hepes, 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 5 mM MgCl₂, pH 7.0）稀釋到200 nM，并于室溫雜交30 min。同時(shí)，取50 μL MP-SA-10 磁珠用AFB₁ 1×BB洗滌兩次，500 μL/次，然后取200 μL上述雜交好的混合溶液于1 mL離心管中與洗滌干凈的磁珠于室溫下孵育15 min，最后用AFB₁ 1×BB洗滌修飾好的磁珠兩次，500 μL/次，4℃存儲(chǔ)備用。

（2）絲網(wǎng)印刷電極的預(yù)處理及傳感界面的制備

新的絲網(wǎng)印刷電極先用無水乙醇和去離子水洗滌干凈，滴加40 μL 0.1 M H₂SO₄于電極表面，并施加+2 V的直流電壓活化60 S。往活化后的絲網(wǎng)印刷電極表面滴加40 μL 0.1 M H₂SO₄，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，窗口掃描寬度為0~1.5 V，掃描速率為100 mV/s，結(jié)果如圖1所示?；罨蟮慕z網(wǎng)印刷電極的特征峰與多晶金電極在硫酸中的循環(huán)伏安特征峰極其相似。往活化后的電極表面立即滴加4 μL含有1μM巰基修飾探針如SEQ ID NO：3所示，3’端修飾有SH基的緩沖溶液（含有1 M NaCl和1 mM 磷酸三(2-氯乙基)酯（TCEP）），30℃下組裝3 h，用AFB₁1×BB （10 mM Hepes, 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 5 mM MgCI2, pH 7.0）清洗干凈。最后滴加 4 μL 1 mM6-巰基己醇溶液中室溫封閉30 min，用1×BB清洗3次后，將電極清洗干凈后吹干4℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）AFB₁結(jié)合介導(dǎo)的鏈置換和表面臨近雜交反應(yīng)及電化學(xué)檢測

基于鏈置換放大和表面臨近雜交策略的黃曲霉毒素B1電化學(xué)檢測方法的原理如圖2所示。3’端生物素標(biāo)記的AFB₁適配體與Block探針形成的雜交復(fù)合物預(yù)先固定在磁珠表面，AFB₁存在的情況下，Block探針與AFB₁競爭與適配體結(jié)合。因AFB₁與適配體的結(jié)合力大于Block探針與適配體的結(jié)合力，Block探針被競爭下來。離心后，收集上清中的Block探針加入鏈置換擴(kuò)增體系，觸發(fā)啟動(dòng)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)從而產(chǎn)生大量的擴(kuò)增子。

該擴(kuò)增子能夠協(xié)同參與隨后的表面臨近雜交反應(yīng)：巰基修飾探針，二茂鐵標(biāo)記探針和擴(kuò)增子三者的協(xié)同反應(yīng)，從而在絲網(wǎng)印刷電極表面引入電活性探針，產(chǎn)生相應(yīng)的電信號(hào)。如果AFB₁不存在，就不會(huì)發(fā)生AFB₁結(jié)合介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)和表面臨近雜交反應(yīng)，自然不會(huì)產(chǎn)生電流信號(hào)。因此，該方法是一種signal-on檢測模式。鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的引入，保證了該方法具有足夠的靈敏度；表面臨近雜交的信號(hào)輸出策略將該檢測原理轉(zhuǎn)變成signal-on模式，從而進(jìn)一步提高了方法的靈敏度；絲網(wǎng)印刷電極的使用，確保該方法可以大規(guī)模平行測試，保證了足夠的檢測通量。

具體實(shí)施步驟為：一定濃度的AFB₁靶標(biāo)加入50 μL上述（1）中修飾好的磁珠中，于室溫下輕輕震蕩孵育30 min，隨后磁分離，取10 μL上清，10 μL 10×NEB buffer 3.1 (1 M NaCl, 500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 1 mg/mL BSA, pH 7.9), 2 μL 0.5 μM 鏈置換探針(SDA probe，如SEQ ID NO：4所示), 2 μL dNTPs (10 mM), 4 μL Vent exo^-聚合酶 (2 U/μL), 2 μL Nt.Bst NBI (10 U/ μL) 切刻內(nèi)切酶，并用滅菌的去離子水調(diào)整反應(yīng)體積到100 μL，55℃下反應(yīng)1 h。接著添加 10 μL二茂鐵標(biāo)記的探針如SEQ ID NO：5所示，其5’端修飾有二茂鐵基團(tuán)并混合均勻，取40 μL滴加到（2）中修飾好的電極表面室溫反應(yīng)30 min，最后用1×AFB₁緩沖液洗滌干凈并用氮?dú)獯蹈伞?/p>

（4）電化學(xué)檢測

緊接著滴加40 μL 含有10 mM MgCl₂的0.1 M KClO₄溶液到上述（3）修飾好的電極表面，進(jìn)行差示脈沖（DPV）電化學(xué)檢測。窗口掃描寬度為0~0.5 V，脈沖寬度為50 mV, 靜默時(shí)間0.2 s，脈沖寬度為0.06 s。電化學(xué)檢測在UI5020 型電化學(xué)工作站上于室溫條件下進(jìn)行：電化學(xué)實(shí)驗(yàn)使用通用的絲網(wǎng)印刷電極：工作電極為修飾好的金電極，鉑電極為輔助電極，氯化銀作參比電極。

為了驗(yàn)證方法的特異性，專門針對污染玉米中常見的共生毒素如FB₁, AFB₂, OTA, 和T-2 毒素進(jìn)行了干擾測試，結(jié)果如圖3所示。該檢測方法的特異性很高，對FB₁, AFB₂, OTA和T-2 毒素幾乎無響應(yīng)；即使針對與AFB₁結(jié)構(gòu)極其相似的AFB₂毒素，也僅僅產(chǎn)生大約20%的干擾信號(hào)。

（5）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

往修飾好的電極表面滴加40 μL 含有10 mM MgCl₂的0.1 M KClO₄溶液，進(jìn)行DPV電化學(xué)檢測，記錄峰電流值。其他濃度的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 pM、1 pM、10 pM、100 pM、1 nM、10 nM）重復(fù)以上（3）、（4）實(shí)驗(yàn)操作依次進(jìn)行DPV測量，并記錄相應(yīng)的峰電流值。以峰電流值作縱坐標(biāo)，以AFB₁濃度作橫坐標(biāo)作圖，建立測定AFB₁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在優(yōu)化條件下，對AFB₁進(jìn)行了定量測定，結(jié)果如圖4所示，該方法的檢測范圍為0.1 pM~10 nM，檢測限為0.1 pM （3倍背景信號(hào)強(qiáng)度），線性方程為y = 16.89 ln (C_AFB1) + 89.63（R2 = 0.991）。

（6）玉米樣品分析

稱取5 g已粉碎的玉米樣品，加入15 mL 乙腈：水（4:6，v/v）提取液，室溫振蕩提取20 min，4℃離心（4000 g）10 min，上清用孔徑為0.22 mm的定性濾紙過濾后用1×BB溶液稀釋4倍。然后按照上述（3）、（4）操作，進(jìn)行DPV電化學(xué)檢測，記錄峰電流值。利用上述（5）所建立的黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出玉米樣品溶液中的AFB₁濃度，并與商業(yè)化的ELISA試劑盒進(jìn)行對比，用于實(shí)際玉米樣品的篩查分析。

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所

<120>一種基于鏈置換放大和表面臨近雜交反應(yīng)的AFB1電化學(xué)檢測方法及應(yīng)用

<160> 5

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（47）

<400> 1

gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggccc 47

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（21）

<400> 2

acacgtgccc aacaatctgg t 21

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（14）

<400> 3

gcagcaaaga gtcg 14

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（50）

<400> 4

gcagcaacaa tctggacagt ttttgactca ccagattgtt gggcacgtgt 50

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（17）

<400> 5

cgactctcaa tctggac 17