本發(fā)明涉及臨床血液診斷領(lǐng)域中的凝血酶原時間(Prothrombin Time，PT)檢測，尤其是指一種凝血酶原時間測試卡的制備方法。
背景技術(shù)：
凝血功能檢測是一項重要的臨床檢測項目，對于臨床各科疾病診斷具有重要意義。通常測定凝血功能的測定包括4項檢查內(nèi)容，即凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原(FIB)。其中，凝血酶原時間(PT)是臨床上主要的凝血性能測試指標(biāo)之一。
PT可用于監(jiān)測口服抗凝劑用量和療效、相關(guān)凝血因子和抑制劑情況、證實相關(guān)凝血酶原和纖維蛋白原等的缺陷和抑制物存在情況。PT延長常見于維生素K缺乏、DIC、服用抗凝藥物等情況。凝血因子縮短見于血栓性疾病等。另外，由于凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ主要由肝臟合成，因此PT結(jié)果也是反應(yīng)肝功能的一項重要指標(biāo)。因此，PT檢測具有重要的實際意義。PT的測量結(jié)果常用凝血酶原時間(PT)、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)等形式表示。
體內(nèi)存在有內(nèi)源性及外源性兩種凝血激活系統(tǒng)。一般認為，無活性的凝血因子Ⅶ與組織因子結(jié)合，會很快被活化的因子Ⅹ激活為Ⅶa，從而形成Ⅶa組織因子復(fù)合物，進而啟動外源性凝血過程。外源性凝血所需的時間短，反應(yīng)迅速。PT檢測方法就是利用外源性凝血的反應(yīng)原理，通過向血液樣本中加入PT檢測試劑，基于一系列酶促反應(yīng)，測定血漿或全血形成血塊所需要的時間，實現(xiàn)對相關(guān)疾病或缺陷的診斷。
PT試劑通常由自然或重組來源的組織因子、磷脂等物質(zhì)組成。其中，主要活性成分為組織因子。組織因子也稱促凝血酶原激酶、凝血因子Ⅲ等，是由263個氨基酸組成、分子質(zhì)量為47kDa的跨膜受體蛋白質(zhì)。組織因子分子中有三個結(jié)構(gòu)域，其中1-219殘基組成胞外區(qū)，能夠與凝血因子Ⅶ高親和性結(jié)合，并作為Ⅶa的輔因子，促進凝血因子Ⅹ轉(zhuǎn)化為因子Ⅹa。磷脂也是試劑的重要組成部分，這是因為充分發(fā)揮組織因子的生物學(xué)活性，必須在體外與磷脂充分結(jié)合。PT檢測方法有光化學(xué)方法(美國專利US5418141)、電化學(xué)方法(美國專利US6060323，中國專利CN201310301617)等，他們都是通過檢測血樣流動性或血漿濃度改變，完成對凝血酶原時間的測定。
美國專利US5314695是制備了一種由磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺組成的脂質(zhì)體，將重組組織因子與制備的磷脂雙分子層結(jié)合，制備了一種PT檢測試劑。但是整個工藝過程十分繁瑣，增大了時間成本和生產(chǎn)成本，不利于廣泛應(yīng)用。目前，常規(guī)的PT檢測也是通過PT試劑完成的，但是這往往需要PT試劑與大型的血凝儀配合使用，這對于設(shè)備水平、操作人員的操作技能等都有較高要求。而且，PT測試不僅可以用于檢測評估腎臟疾病、凝血缺陷，也常用于華法林抗凝療法的INR值動態(tài)監(jiān)測，而試劑和血凝儀配套使用，延長了PT測試的周期。不僅如此，市售的凝血試劑往往為干粉狀，在使用前還需要預(yù)先進行復(fù)溶、預(yù)熱 等操作才能進行測試，這就使得實驗過程更加繁瑣。這都使得PT值的即時檢驗(point-of-care testing，POCT)變得幾乎不可能。鑒于PT檢測在臨床上的重要作用，制備一種準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，并且能夠?qū)崿F(xiàn)PT值即時檢測的試劑具有重要現(xiàn)實意義。
美國專利US5418141將組織因子、磷脂、鹽、Ca2+等在緩沖溶液中充分分散，固定在特殊材質(zhì)的材料上烘干成膜，制備成一種PT檢測卡。所制備檢測卡可以通過檢測光信號變化，配合小型光電探測器即可完成凝血酶原時間測定，這為實現(xiàn)通過光化學(xué)方法測定PT值臨床檢驗提供一種新思路。
結(jié)合上述經(jīng)驗，目前基于電化學(xué)方法，檢測PT的文獻和專利仍鮮有報道。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于通過電化學(xué)的方法，制備了一種能夠?qū)崿F(xiàn)PT檢測的檢測卡，所制備的PT檢測卡與本司研發(fā)的小型設(shè)備配套使用，即可完成對PT的臨床即時檢測。所制備的凝血酶原時間檢測卡特征在于，無需與大型設(shè)備配套使用，大大降低的測試成本；對操作者的技術(shù)水平要求較低，甚至患者自己就能夠完成PT檢測；所制備的檢測卡中的反應(yīng)試劑以固態(tài)形式與血樣反應(yīng)，無需復(fù)溶；所制備的檢測卡每次使用一條，并且試劑被固定在檢測卡上，不存在試劑污染。因此，本發(fā)明制備的檢測卡有望應(yīng)用于POCT領(lǐng)域，尤其是PT檢驗的臨床實驗，具有重要的研究和實踐價值。此外，該檢測卡制備方法簡單、準(zhǔn)確度高、易于接受，具有很高的的市場價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
根據(jù)凝血酶原時間(PT)檢測方面的相關(guān)研究進展及成果，本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于提供了基于電化學(xué)這一方法的凝血酶原時間檢測卡，解決在PT檢測在POCT領(lǐng)域的技術(shù)不足，能夠簡單快捷的完成對患者PT檢測，并且結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確性、重復(fù)性。
本發(fā)明制備的凝血酶原時間檢測卡，由凝血酶原時間試劑、電化學(xué)基板等部分組成。當(dāng)未經(jīng)凝血處理的新鮮指尖血或靜脈血滴加到附著有凝血酶原時間試劑的導(dǎo)電基板上時，啟動外源性凝血過程，相關(guān)設(shè)備能夠采集到電信號的變化，進而測定出PT值。所述凝血酶原時間試劑由組織因子脂化物和緩沖液體系組成。具體步驟包括：
(1)將磷脂溶解在含有表面活性劑，pH值為7.0-7.5Tris緩沖溶液(50-200mM)中，攪拌30-60min。其中磷脂含量為0.01％-0.1wt％；
(2)將rTF溶解在步驟(1)的溶液中，得到組織因子含量0.005wt％的溶液，超聲處理10-30min，工作時間3s，間歇時間2s，使二者充分混合得到組織因子脂化物；
(3)將該組織因子酯化物于常溫下，在pH 7.0-7.5的Tris緩沖溶液(10mM)中，透析6-72h；
(4)制備pH 7.0-7.5的50mM Tris緩沖溶液，并且含有：10-200mM氯化鈉、8.2-10.5％wt％海藻酸鈉、1.0-4.2wt％甘氨酸、4.5-5.5wt％PEG 8000、0.4-1.0wt％硫柳汞、2-4mM氯化鈣；
(5)采用步驟(4)制備的溶液將步驟(3)制備的溶液稀釋1-100倍；
(6)將步驟(5)制備的溶液以涂覆或滴加的方式加入在導(dǎo)電基板的特定區(qū)域內(nèi)，在40-80℃下烘干5-30min制備得到凝血酶原時間檢測卡。
其中，步驟(1)所選擇的磷脂為磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺中的至少一種，優(yōu)選為磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸按照質(zhì)量比2:1混合。此外，用所選磷脂能夠起到相同作用的磷脂也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(1)和(4)可選用的緩沖溶液可以為Tris、HEPES、TES、PBS等，濃度范圍20-300mM且pH范圍為5.0-8.0，但優(yōu)選為Tris緩沖溶液(pH為7.0-7.5，50mM)。能夠在所需pH范圍內(nèi)起到緩沖左右的緩沖體系，也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(1)所選擇的溶解條件可以為振蕩、超聲、攪拌等凡能促進和分散作用的手段，均應(yīng)視為被保護內(nèi)容，其目的在于使得磷脂充分分散，其中攪拌條件優(yōu)選為30-60min。
其中，步驟(1)所選擇的表面活性劑為TritonX-100、Tween-80等中的至少一種，優(yōu)選為TritonX-100。此外，在體系中能夠與所選TritonX-100起到類似同作用的表面活性劑也應(yīng)視為保護內(nèi)容。
其中，步驟(2)所選擇的rTF來源為人、兔、豬等來源中的至少一種，優(yōu)選為重組人組織因子，且組織因子含量0.001-0.01wt％，優(yōu)選為0.005wt％。
其中，步驟(2)加入rTF后的處理方式為振蕩、超聲、攪拌等，目的在于充分分散rTF，并使rTF與磷脂充分結(jié)合，其中超聲條件10-30min，工作時間3s，間歇時間2s，優(yōu)選15min，具體超聲條件因所選材料和超聲設(shè)備不同，可能略有差異，凡與該手段相似的操作也應(yīng)列為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(3)選用的透析液可以為Tris、HEPES、PBS等中的至少一種，濃度范圍為5-300mM且pH范圍為5.0-8.0，優(yōu)選為7.0-7.5的Tris緩沖溶液(10mM)凡能夠在所需pH范圍內(nèi)起到緩沖作用的緩沖體系，也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(3)選用的透析條件為0-40℃環(huán)境，透析時間可以為6-72h，優(yōu)選為常溫透析24h。此外，該步驟中其他能夠與透析起到相似作用的分離手段，例如樹脂吸附，也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(4)所選擇的多糖可以選擇海藻酸鈉、蔗糖、淀粉、纖維素等中的至少一種，含量為8.2-10.5％wt％，優(yōu)選為海藻酸鈉。
其中，步驟(4)所選擇的電解質(zhì)可以選擇氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉等中的至少一種，含量為10-200mM，優(yōu)選為20mM氯化鈉。
其中，步驟(4)所選擇的甘氨酸還可以為牛血清白蛋白、人血清白蛋白等中的至少一種，含量為1.0-10.0wt％，優(yōu)選為甘氨酸。
其中，步驟(4)所選擇的PEG 8000還可以為其他分子量的PEG、PVA等中的至少一種，含量為4.5-5.5wt％，優(yōu)選為PEG 8000。其他能夠起到相似作用的聚合物也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(4)所選擇的硫柳汞，其他能夠起到相似作用的防腐劑或抑菌劑也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(4)所選擇的引入Ca2+的試劑可以為氯化鈣、硝酸鈣等易溶性鈣鹽的至少一種，含量為2-4mM，優(yōu)選為的氯化鈣。未列舉的其他含有Ca2+的相關(guān)試劑也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(5)所選擇稀釋倍數(shù)可以為1-100倍，優(yōu)選為10-30倍。具體倍數(shù)因所選組織因子活力、磷脂的不同而有所不同，也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(6)所選擇的將試劑加到導(dǎo)電基板的反應(yīng)區(qū)的方法可以是吸附法、交聯(lián)法、粘合劑法等中的至少一種；由于吸附法操作簡單，本發(fā)明選擇吸附法，即直接將試劑滴加或涂抹于導(dǎo)電基板的反應(yīng)區(qū)內(nèi)，進行烘干。其他將試劑固定在導(dǎo)電基板上的方法也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
其中，步驟(6)所選擇烘干條件為40-80℃，烘干時間為5-30min，優(yōu)選為70℃條件下，烘干10min。具體條件因所選組織因子活力、磷脂的不同而有所不同，也應(yīng)視為被保護內(nèi)容。
本發(fā)明提供了一種基于電化學(xué)方法的凝血酶原時間(PT)檢測卡的制備方法，制備PT檢測卡的性能優(yōu)劣，主要是由試紙條反應(yīng)區(qū)組分中的rTF和磷脂等關(guān)鍵因素決定的。因此，在開發(fā)本發(fā)明中尤其注意(1)組織因子的活性和特異性；(2)磷脂的種類、濃度、用量等。
本發(fā)明的優(yōu)勢在于：基于電化學(xué)方法，提供了一種凝血酶原時間檢測卡及其制備方法，能夠完成對指尖血和未做抗凝處理新鮮血樣的PT檢測；無需大型儀器即可對患者的凝血酶原時間予以檢測；操作簡單，對操作人的技術(shù)水平要求不高；制備方法簡單，便于大規(guī)模應(yīng)用；檢測過程快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。基于以上優(yōu)點，該凝血酶原時間檢測卡可應(yīng)用于POCT領(lǐng)域，在臨床檢驗等方面具有廣闊前景。
附圖說明
附圖為凝血酶原時間檢測試劑和所制備的凝血酶原時間檢測卡測定血樣的PT值的對比情況。其中橫、縱坐標(biāo)分別為凝血酶原時間檢測卡在配套設(shè)備上測定的INR值和市售凝血酶原試劑在血凝儀上測定的血樣INR值。
具體實施方式
關(guān)于本專利的具體實施過程將在以下實施例中詳細描述，具體實施過程包括但不限于下述實施例。
實施例1磷脂溶液的制備
本發(fā)明制備的凝血酶原時間檢測卡檢測功能的發(fā)揮主要基于成分中組織因子脂化物的作用，組織因子脂化物由重組組織因子和磷脂制備得到。其中磷脂是輔助組織因子發(fā)揮作用的重要組成部分，是該凝血酶原時間檢測卡能夠完成檢測的重要成分。因而制備均一、穩(wěn)定的磷脂溶液是制備該凝血酶原時間檢測卡的重要前提。
具體地，將凍干的磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸按質(zhì)量比2:1混合(0.6g)加入1L該緩沖溶液中，30-40℃條件下磁力攪拌30min，充分分散溶解。
實施例2組織因子脂化物的制備
組織因子脂化物是該凝血酶原時間檢測卡中具有生物活性的主要成分，參與啟動外源性凝血過程。具體地，將rTF溶解于實施例1所制備的磷脂混合溶液中，室溫混合并超聲15min(設(shè)置工作時間3s，間歇時間2s)，即可獲得組織因子脂化物溶液。將該組織因子酯化物于常溫下，在pH 7.0Tris緩沖溶液(10mM)中，透析48h。
實施例3點膜工藝
本發(fā)明制備的凝血酶原時間檢測卡(電化學(xué)法)與傳統(tǒng)凝血酶原時間試劑盒的具有很多不同之處，例如二者有效成分與待測血樣反應(yīng)時的存在狀態(tài)。對于前者，有效成分以固態(tài)薄膜形式均勻分散在導(dǎo)電基板的反應(yīng)區(qū)內(nèi)；而對于后者，參與反應(yīng)時反應(yīng)試劑則以液體形式存在。為在導(dǎo)電基板上制備均勻分散的固態(tài)薄膜，制備具體實施方法是：
制備含量為50mM氯化鈉、10％wt％海藻酸鈉、3.5wt％甘氨酸、5.0wt％PEG 8000、0.8wt％硫柳汞、4mM氯化鈣，pH 7.0濃度為50mM的Tris緩沖溶液。將該緩沖液體與經(jīng)透析處理的組織因子脂化物按照50:1的體積比混合均勻，滴加導(dǎo)電基板的特定區(qū)域內(nèi)，并在70℃條件下干燥10min，即得到帶有附著有組織因子脂化物的凝血酶原時間檢測卡。將制備完成的檢測卡放入含有硅膠干燥劑的密封袋中，密封并于4℃條件下保存，使用時恢復(fù)至室溫使用。
實施例4基于所制備的凝血酶原時間檢測卡(電化學(xué)法)的血樣PT值檢測
所制備的凝血酶原時間檢測卡(電化學(xué)法)可用于凝血酶原時間(PT)的臨床檢驗。為檢驗測試條測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，將本發(fā)明制備的PT檢測卡與市售的PT試劑進行了對照。具體地，采用本發(fā)明制備的PT檢測卡和配套測試儀測定了50例指尖血樣本的PT值，樣本信息如表1所示。
表1樣本信息
所測定血樣的PT和INR值可以直接從測試儀中讀出。購買市售的凝血酶原時間(PT)試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司)，利用血凝儀(普朗PUN-2048A半自動血凝分析儀)測定相同50人的靜脈血的PT和INR值。對比二者測量結(jié)果，如附圖所示。由圖可知，所制備的基于電化學(xué)法制備凝血酶原時間檢測卡與市售的凝血酶原時間檢測試劑的測試結(jié)果具有很高的吻合度。
以上實施例對本發(fā)明進行了詳盡的描述，旨在讓本領(lǐng)域或相關(guān)技術(shù)人員認識、了解本發(fā)明的內(nèi)容并能夠加以實施，但本發(fā)明的內(nèi)容并不限于此。凡以本發(fā)明為基礎(chǔ)，進行相關(guān)的延伸、等效變換或修飾，都應(yīng)包括在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。