本發(fā)明屬于檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體涉及基于DNA折紙模板納米金棒構(gòu)建Dolmen結(jié)構(gòu)的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

美國(guó)加州理工學(xué)院資深研究員Paul Rothemund發(fā)明了“DNA折紙術(shù)”，這是一種具有創(chuàng)新性的自下而上的組裝技術(shù)。先借助納米儀器，畫(huà)好折疊物的形狀，然后用折疊的DNA長(zhǎng)鏈把這個(gè)形狀填滿，而DNA短鏈就是固定折疊的DNA長(zhǎng)鏈的“圖釘”。Rothemund用計(jì)算機(jī)計(jì)算每一個(gè)作品所需DNA短鏈的數(shù)量，然后將這些DNA短鏈“釘”在長(zhǎng)鏈構(gòu)成的支架上，就構(gòu)成了各種圖案。該技術(shù)具有過(guò)程簡(jiǎn)單、容易操作和極高產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于生物傳感、物質(zhì)檢測(cè)、單分子水平分析、疾病診斷及治療等領(lǐng)域。

近年來(lái),在金納米棒(Gold NanoRods，GNRs)方面的研究已取得了飛躍式的進(jìn)步,當(dāng)前人們可以利用模板法、光化學(xué)法、晶種生長(zhǎng)法以及電化學(xué)法等多種方法制備出長(zhǎng)徑比不同的金納米棒,由于其具有各向異性及獨(dú)特的光譜特征，故在生物檢測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷、光學(xué)成像以及光譜研究等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

在原子系統(tǒng)中，當(dāng)一個(gè)分立的激發(fā)態(tài)能級(jí)與一個(gè)連續(xù)的激發(fā)態(tài)能級(jí)相重疊時(shí),兩個(gè)激發(fā)態(tài)之間會(huì)出現(xiàn)干涉,從而使原子系統(tǒng)的光譜呈非對(duì)稱線型，這一效應(yīng)稱為法諾(Fano)共振。最近，金屬微納結(jié)構(gòu)中的Fano共振由于在非線性、增強(qiáng)透射、光學(xué)開(kāi)關(guān)與調(diào)制等方面具有重要應(yīng)用，因而引起了人們的廣泛興趣。Richard Vaia(Biswas,S.,Duan,J.,Nepal,D.,Pachter,R.,&Vaia,R.(2013).Nano Letters,13(5),2220-2225.)利用刻蝕通過(guò)Top-Down方法搭建Dolmen結(jié)構(gòu)，生動(dòng)有效地向我們展示了該結(jié)構(gòu)的法諾效應(yīng)。顏灝(Pal,S.,Deng,Z.,Wang,H.,Zou,S.,Liu,Y.,&Yan,H.(2011).Journal of the American Chemical Society,133(44),17606-9.)利用空間可循址性和DNA特異性結(jié)合將納米金棒雜交到DNA折紙，并排列成相應(yīng)的空間構(gòu)型。但迄今為止，還沒(méi)有使用Bottom-Up(自下而上)方法將納米金棒和DNA折紙組裝成Dolmen結(jié)構(gòu)用于法諾效應(yīng)的研究和專利報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于通過(guò)自下而上方法將DNA折紙和納米金棒構(gòu)建成Dolmen結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有的法諾效應(yīng)可用于光學(xué)和等離子體領(lǐng)域檢測(cè)，豐富了DNA納米結(jié)構(gòu)的檢測(cè)手段；本發(fā)明還提供了上述結(jié)構(gòu)的制備方法及應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為基于DNA折紙模板和納米金棒構(gòu)建Dolmen結(jié)構(gòu)的方法，包含以下步驟：

(1.1)通過(guò)晶種生長(zhǎng)法制備特定尺寸納米金棒；

(1.2)制備特異性設(shè)計(jì)矩形DNA折紙；

(1.3)按照納米金棒與DNA折紙按摩爾比為5:1的比例加入納米金棒，在45℃～20℃條件下循環(huán)梯度退火，使特定尺寸納米金棒與特異性設(shè)計(jì)矩形DNA折紙雜交，使得納米金棒構(gòu)建成Dolmen結(jié)構(gòu)。

上述晶種生長(zhǎng)法制備特定尺寸納米金棒具體包括：

(2.1)將摩爾濃度為0.01mol/L～1mol/L的十六烷基三甲基溴化銨水溶液和摩爾濃度為1mmol/L～100mmol/L的氯金酸水溶液攪拌混勻，加入摩爾濃度為1mmol/L～100mmol/L的硼氫化鈉水溶液；

(2.2)將步驟2.1獲得的混合溶液置于20℃～40℃條件下，靜置反應(yīng)1～3h。

進(jìn)一步，晶種生長(zhǎng)法制備特定尺寸納米金棒具體包括：

(3.1)將摩爾濃度為0.01mol/L～1mol/L的十六烷基三甲基溴化銨水溶液和摩爾濃度為1mmol/L～100mmol/L的氯金酸水溶液按體積比10:1～40:1混合，攪拌混勻；

(3.2)20～40℃條件下，邊攪拌邊向步驟3.1的溶液中加入摩爾濃度為1mM～100mM的硝酸銀溶液和摩爾濃度為0.1mol/L～2mol/L的鹽酸溶液，攪拌1～5min；

(3.3)20～40℃條件下，邊攪拌邊向步驟3.2的溶液中滴加摩爾濃度為

10mmol/L～200mmol/L的抗壞血酸溶液，溶液從黃色迅速變?yōu)闊o(wú)色，攪拌1～5min；

(3.4)20～40℃條件下，邊攪拌邊向步驟3.3的溶液中滴加步驟2.1的稀釋液，攪拌1～5min，靜置反應(yīng)10～20h；

(3.5)溶液從無(wú)色變成棕色，反應(yīng)結(jié)束，采用離心提純法濃縮步驟3.4獲得的溶液，將離心產(chǎn)物分散到超純水中。

上述納米金棒為經(jīng)ssDNA1所示核苷酸序列修飾后的納米金棒，通過(guò)以下方法制備：

(4.1)根據(jù)步驟3.5中離心產(chǎn)物溶液與ssDNA1所示核苷酸序列按體積比為100:1～20:1混合，攪拌混勻，在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(4.2)將步驟4.1溶液滴加氯化鈉溶液，滴加3～5次，每次滴加不超過(guò)5μL，間隔時(shí)間0.5～1h，滴加完畢后在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(4.3)采用離心提純法濃縮步驟4.2獲得的溶液，將離心產(chǎn)物常溫保存。

上述特異性設(shè)計(jì)矩形DNA折紙通過(guò)以下方法制備：

(5.1)將摩爾濃度為1nmol/L～5nmol/L的M13mp18噬菌體環(huán)狀單鏈DNA分子與摩爾濃度為10nmol/L～50nmol/L的訂書(shū)釘單鏈按和設(shè)計(jì)捕獲單鏈按體積比1:1:1～1:5:5混合，攪拌混勻；

(5.2)將步驟5.1的溶液在95℃～25℃條件下梯度退火，反應(yīng)結(jié)束后，離心提純。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)DNA折紙具有精確的空間可尋址性，加入納米金棒后可以高效精確組裝；

(2)Dolmen結(jié)構(gòu)具有法諾效應(yīng)，在特定光波長(zhǎng)下出現(xiàn)很明顯的“零吸收”現(xiàn)象；

(3)本發(fā)明借助瓊脂糖電泳和透射電鏡進(jìn)行表征，利用納米金棒組裝體在暗場(chǎng)顯微鏡暗場(chǎng)圖中特殊顏色的特點(diǎn)，容易與掃描電鏡共定位，因此與刻蝕手段相比，具有簡(jiǎn)便、可靠、低成本、較低的實(shí)驗(yàn)條件要求等優(yōu)勢(shì)。

附圖說(shuō)明

圖1為Dolmen結(jié)構(gòu)組裝和檢測(cè)示意圖；

圖2為合成特定尺寸(75×30nm)納米金棒透射電鏡圖；

圖3為分離提純Dolmen結(jié)構(gòu)的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果；

圖4為進(jìn)過(guò)提純后的Dolmen結(jié)構(gòu)透射電鏡圖；

圖5為對(duì)Dolmen結(jié)構(gòu)法諾效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果，其中a為暗場(chǎng)顯微鏡下結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)的光斑，b為Dolmen結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖，c為散射強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。本發(fā)明所述Dolmen結(jié)構(gòu)構(gòu)建及檢測(cè)的原理如圖1所示，在矩形折紙的兩面修飾捕獲鏈，利用DNA特異性雜交，將修飾上巰基DNA的納米金棒組裝上折紙，使用暗場(chǎng)顯微鏡檢測(cè)其法諾效應(yīng)。

基于DNA折紙模板和納米金棒構(gòu)建Dolmen結(jié)構(gòu)的方法可以概括為首先通過(guò)晶種生長(zhǎng)法制備特定尺寸納米金棒，然后與特異性設(shè)計(jì)矩形DNA折紙雜交，最后使納米金棒構(gòu)建成Dolmen結(jié)構(gòu)。

其中晶種生長(zhǎng)法制備特定尺寸納米金棒通過(guò)以下方法制備：

(1)將摩爾濃度為0.01mol/L～1mol/L十六烷基三甲基溴化銨水溶液和摩爾濃度為1mmol/L～100mmol/L的氯金酸水溶液攪拌混勻，加入摩爾濃度為1mmol/L～100mmol/L的硼氫化鈉水溶液；

(2)將步驟(1)獲得混合溶液置于20℃～40℃條件下靜置反應(yīng)1～3h。

作為優(yōu)選，晶種生長(zhǎng)法制備特定尺寸納米金棒通過(guò)以下方法制得：

(1)將摩爾濃度為0.01mol/L～1mol/L十六烷基三甲基溴化銨水溶液和摩爾濃度為1mmol/L～100mmol/L的氯金酸水溶液按體積比10:1～40:1混合，攪拌混勻；

(2)20～40℃條件邊攪拌邊向步驟(1)的溶液中加入摩爾濃度為1mM～100mM的硝酸銀溶液和摩爾濃度為0.1mol/L～2mol/L的鹽酸溶液，攪拌1～5min；

(3)20～40℃條件邊攪拌邊向步驟(2)的溶液中滴加摩爾濃度為10mmol/L～200mmol/L的抗壞血酸溶液，溶液從黃色迅速變?yōu)闊o(wú)色，攪拌1～5min；

(4)20～40℃條件邊攪拌邊向步驟(3)的溶液中滴加權(quán)利要求2中步驟(1)的稀釋液，攪拌1～5min，靜置反應(yīng)10～20h；

(5)溶液從無(wú)色變成棕色，反應(yīng)結(jié)束，采用離心提純法濃縮步驟(4)獲得的溶液，將離心產(chǎn)物分散到超純水中。

其中，納米金棒為經(jīng)ssDNA1修飾的納米金棒，可以通過(guò)以下方法制得：

(1)納米金棒溶液與ssDNA1所示核苷酸序列按體積比為100:1～20:1混合，攪拌混勻，在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(2)將步驟(1)溶液滴加氯化鈉溶液，滴加3～5次，每次滴加不超過(guò)5μL，間隔時(shí)間0.5～1h，滴加完畢后在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(3)采用離心提純法濃縮步驟(2)獲得的溶液，將離心產(chǎn)物常溫保存。

作為優(yōu)選，特異性設(shè)計(jì)矩形DNA折紙有以下方法制得：

(1)將摩爾濃度為1nmol/L～5nmol/L的M13mp18噬菌體環(huán)狀單鏈DNA分子與摩爾濃度為10nmol/L～50nmol/L的訂書(shū)釘單鏈按和設(shè)計(jì)捕獲單鏈按體積比1:1:1～1:5:5混合，攪拌混勻；

(2)將步驟(1)的溶液在95℃～25℃條件下梯度退火，反應(yīng)結(jié)束后，離心提純。

其中，納米金棒與DNA折紙雜交構(gòu)建成Dolmen結(jié)構(gòu)有以下方法制得：

將納米金棒與DNA折紙按摩爾比為5:1的比例加入納米金棒，最后在45℃～20℃條件下循環(huán)梯度退火，通過(guò)瓊脂糖電泳分離提純。

基于DNA折紙模板納米金棒構(gòu)建Dolmen結(jié)構(gòu)的方法及其應(yīng)用，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)在一定光波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有法諾效應(yīng)，可用于光學(xué)器件等領(lǐng)域應(yīng)用。

為便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解和實(shí)施本發(fā)明，現(xiàn)提供本發(fā)明中相關(guān)步驟的具體實(shí)施例如下：

實(shí)施例1、關(guān)于晶種生長(zhǎng)法制備特定尺寸納米金棒晶種制備：

(1)將10mL摩爾濃度為0.1mol/L十六烷基三甲基溴化銨水溶液和0.25mL摩爾濃度為0.01mol/L的氯金酸水溶液攪拌混勻，快速加入經(jīng)過(guò)冰水浴的0.6mL摩爾濃度為0.01mol/L硼氫化鈉水溶液，劇烈攪拌2min；

(2)將步驟(1)獲得混合溶液置于30℃條件下靜置反應(yīng)2h。

實(shí)施例2、關(guān)于晶種生長(zhǎng)法制備特定尺寸納米金棒生長(zhǎng)液制備：

(1)將40mL摩爾濃度為0.1mol/L十六烷基三甲基溴化銨水溶液和2mL摩爾濃度為0.01mol/L的氯金酸水溶液混合，攪拌混勻；

(2)30℃條件下邊攪拌邊向步驟(1)的溶液中加入0.3mL摩爾濃度為0.01mol/L的硝酸銀溶液和0.8mL摩爾濃度為1mol/L的鹽酸溶液，攪拌5min；

(3)30℃條件下邊攪拌邊向步驟(2)的溶液中滴加0.30ML摩爾濃度為0.1mol/L的抗壞血酸溶液，溶液從黃色迅速變?yōu)闊o(wú)色，攪拌2min；

(4)30℃條件下邊攪拌邊向步驟(3)的溶液中滴加0.08mL稀釋5倍的晶種稀釋液，攪拌2min，靜置反應(yīng)12h；

(5)溶液從無(wú)色變成棕黑色，反應(yīng)結(jié)束后，采用離心提純法濃縮步驟(4)獲得的溶液，將離心產(chǎn)物分散到超純水中。

通過(guò)透射電子顯微鏡表征本實(shí)施例制備獲得的特定尺寸納米金棒的形貌，結(jié)果如圖2所示。從TEM圖結(jié)果可見(jiàn)，本實(shí)施例制備獲得的納米金棒材料粒徑均一、分布均勻，進(jìn)過(guò)測(cè)量統(tǒng)計(jì)，納米金棒長(zhǎng)度為75±2nm，直徑為25±3nm。實(shí)施例1制備獲得的納米金棒溶液用于實(shí)施例3中制備經(jīng)ssDNA1修飾的納米金棒的原料。

實(shí)施例3、關(guān)于制備經(jīng)ssDNA1修飾的納米金棒：

取實(shí)施例2中150μL納米金棒溶液，制備ssDNA1修飾的納米金棒：

(1)將150μL納米金棒溶液離心清洗2次，4500rpm離心10分鐘，將離心產(chǎn)物分散到100μL超純水中；

(2)取5μL100μM的ssDNA1加入到步驟(1)中的溶液，同時(shí)加入1.5μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的十二烷基硫酸鈉溶液，震蕩混勻，置于溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為250rpm的恒溫?fù)u勻儀，震蕩孵育4h；

(3)往步驟(2)溶液中滴加2mol/L的氯化鈉溶液，每次滴加2.5μL，間隔半小時(shí)，滴加4次，滴加完畢后，置于溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為250rpm的恒溫?fù)u勻儀，震蕩孵育8h；

(4)步驟(3)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心提純法濃縮步驟(3)獲得的ssDNA1修飾的納米金棒，離心提純參數(shù)為4000rpm，10min，離心提純?nèi)?，最終得到15μL的濃縮納米金棒溶液，常溫放置待用。

其中，與末端修飾捕獲鏈的訂書(shū)釘鏈互補(bǔ)的SH-DNA序列如下：

5’-TTTTTTTTTTTTTTT AGCGA-3’，(ssDNA1)。

實(shí)施例4、關(guān)于特異性設(shè)計(jì)矩形DNA折紙制備：

(1)將M13mp18噬菌體環(huán)狀單鏈DNA、100多條未修改的訂書(shū)釘鏈、末端修飾捕獲鏈的訂書(shū)釘鏈(CaptureDNA)按照1：10：10的摩爾比進(jìn)行混合，即加入的體積分別為2.5μL、5μL、5μL，然后加入10μL 10×TAE-Mg²⁺緩沖液(Mg ²⁺濃度12.5mol/L)，補(bǔ)超純水至最終體積為100μL，震蕩搖勻。

(2)將步驟(1)將混合溶液置于PCR儀中以0.1℃/10s的速率從95℃～20℃退火，反應(yīng)后使用100kDa超濾管離心除去多余的訂書(shū)釘鏈，4℃放置待用。

其中，訂書(shū)釘鏈末端修飾捕獲鏈(CaptureDNA)的序列如下：

AAAAAAAAAAAAAAA。

實(shí)施例5、關(guān)于納米金棒與DNA折紙雜交構(gòu)建成Dolmen結(jié)構(gòu)制備：

將10μL濃縮后經(jīng)ssDNA1修飾的納米金棒與10μL特異性設(shè)計(jì)矩形DNA折紙按摩爾比為5：1的比例將兩者配比后雜交，放入PCR儀中45℃～20℃梯度退火，反應(yīng)12h，加入5μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60％的蔗糖溶液混合待用。

實(shí)施例6、關(guān)于提純混合溶液中Dolmen結(jié)構(gòu)的瓊脂糖凝膠電泳分析及觀察結(jié)構(gòu)形成的可行性實(shí)驗(yàn)：

(1)配置0.5％的瓊脂糖凝膠溶液，加熱溶液使之沸騰2次后，流水冷卻至50℃以下，加入2.5μL Nucleic Acid Stain核酸染料，混勻，倒入制膠板，插好梳子，使之凝固。

(2)分別向各個(gè)泳道加樣如下：

1號(hào)泳道：DNA折紙；

2號(hào)泳道：SH-DNA修飾后納米金棒；

3號(hào)泳道：加入蔗糖溶液后的Dolmen結(jié)構(gòu)混合液。

采用100V恒壓下工作30min，將電泳完畢后的凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，300ms曝光，拍照，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，由于折紙上修飾了三根納米金棒，和單純的折紙(見(jiàn)1號(hào)泳道)相比，跑的較慢；和單純的納米金棒(見(jiàn)2號(hào)泳道)相比，跑的更慢，則其較單個(gè)的DNA折紙，位于其的更上方(此處上方是指距離點(diǎn)樣膠孔位置越近，下同)。在3號(hào)泳道中，由于納米金棒相比于折紙是過(guò)量加入的，所以沒(méi)有雜交上折紙的納米金棒跑的位置與2號(hào)泳道的一樣。本實(shí)施例結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明所述的Dolmen結(jié)構(gòu)形成的可行性。

將凝膠放在白光板上，切取結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的凝膠條帶，把條帶置于透析袋中，由于透析帶可以截留小分子，再次通過(guò)電泳作用(方法同上)，可以使結(jié)構(gòu)從切取的凝膠條帶中跑出，截留在透析袋中。吸出透析帶中的溶液通過(guò)離心提純，4000rpm，10min，提純后的溶液待用。

取300目碳支持膜，滴入10μL提純后的溶液，常溫干燥后采用投射電子顯微鏡進(jìn)行表征，表征結(jié)果如圖4所示，在圖中我們可以看到形成的Dolmen結(jié)構(gòu)數(shù)量很多，同時(shí)存在納米金棒擺放的不是很規(guī)則，主要由于納米金棒上修飾的SH-DNA與折紙上捕獲鏈雜交形成雙鏈后會(huì)發(fā)生一定的擺動(dòng)，是納米金棒不能完全按照設(shè)計(jì)規(guī)則擺放。

實(shí)施例6對(duì)Dolmen結(jié)構(gòu)法諾效應(yīng)的檢測(cè)

取長(zhǎng)寬為3cm×1cm的ITO玻璃，在導(dǎo)電面滴入10μL提純后的溶液，靜置10min，使樣品吸附到表面。超純水沖洗三次，氮?dú)獯蹈伞Ｓ锰妓毓P在樣品吸附位置刻畫(huà)“十”字型標(biāo)記線，便于樣品在暗場(chǎng)顯微鏡與掃描電鏡下共定位，表征結(jié)果如圖5中a、b圖。

在不同極化方向(0°～150°)偏振光的作用下，Dolmen結(jié)構(gòu)的散射強(qiáng)度由圖5中c圖所示，從0°～150°不同極化方向作用下,其散射強(qiáng)度在波長(zhǎng)為880nm左右處明顯出現(xiàn)低谷,即為法諾共振。

因此，本發(fā)明利用DNA折紙和納米金棒獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，將DNA折紙和特定尺寸的納米金棒組裝成Dolmen結(jié)構(gòu)，其具有的法諾效應(yīng)在光學(xué)領(lǐng)域和等離子體研究檢測(cè)拓展思路，開(kāi)辟新的路徑。

最后需要說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明所限定的范圍。