本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及SP8蛋白及其應(yīng)用、SP8蛋白抗體的制備方法、應(yīng)用及雜交瘤細(xì)胞。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)在生活的壓力的加大，男性不育的比例也在不斷的增長，加上男性的生活習(xí)慣，比如酗酒、吸煙等都會影響甚至導(dǎo)致男性不育。男性不育的問題給渴望做父母的人帶來很大的傷害。

無精子癥或嚴(yán)重少精子癥的發(fā)病原因可分為睪丸前性、睪丸性和睪丸后性三大類。如果是由于在睪丸精子發(fā)生過程中精子發(fā)生出現(xiàn)障礙，則稱為睪丸性的精子發(fā)生障礙；如果是由于附睪或輸精管阻塞，而精子發(fā)生正常則稱為梗阻性無精子癥，準(zhǔn)確鑒別這兩種不同的病理類型對于不育癥的處置具有重要的臨床價值。目前對于無精癥或嚴(yán)重少精子癥的確診主要基于睪丸穿刺活組織病理學(xué)檢查，睪丸穿刺為有創(chuàng)性診斷技術(shù)，不能反復(fù)進行，存在出血、感染并發(fā)癥的可能，病人接受度不高。另外，由于穿刺取樣部位的隨機性，不能準(zhǔn)確判斷睪丸精子發(fā)生情況。

市場上的檢測試劑盒大多是通過檢測精細(xì)胞的SP10蛋白位點，該類檢測靈敏度也不盡如人意，容易誤檢；容易給被檢測人帶來一些負(fù)面的影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供SP8蛋白作為標(biāo)志物在制備男性不育檢測試劑盒中的應(yīng)用；該應(yīng)用以SP8蛋白作為男性不育癥檢測的蛋白靶點，其具有更好的靈敏度和特異性。

本發(fā)明的第二目的在于提供SP8蛋白抗體在制備男性不育檢測試劑盒中的應(yīng)用，該試劑盒中的SP8蛋白抗體，專門針對SP8蛋白，針對性更強，反應(yīng)更靈敏。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種男性不育檢測試劑盒，該試劑盒能夠更準(zhǔn)確地檢測出待測樣本中的SP8蛋白濃度。

本發(fā)明的第四目的在于提供一種SP8蛋白抗體的制備方法，該方法簡單易行，操作方便，制備的SP8蛋白抗體與SP8蛋白具有更好結(jié)合能力，針對性強，反應(yīng)靈敏，制備的濃度較高，利于大量制備。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

SP8蛋白作為標(biāo)志物在制備男性不育檢測試劑盒中的應(yīng)用，SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

SP8蛋白抗體在制備男性不育檢測試劑盒中的應(yīng)用，SP8蛋白抗體與SP8蛋白具有抗原抗體反應(yīng)，SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一種男性不育檢測試劑盒，該男性不育檢測試劑盒是膠體金試劑盒或酶聯(lián)免疫試劑盒，膠體金試劑盒和酶聯(lián)免疫試劑盒均包括SP8蛋白抗體，SP8蛋白抗體與SP8蛋白具有抗原抗體反應(yīng)，SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一種SP8蛋白抗體的制備方法，包括如下步驟：

蛋白表達步驟：將重組載體轉(zhuǎn)化表達菌株表達得到SP8蛋白，重組載體包括有能表達SP8蛋白的Sp8基因，SP8蛋白的氨基酸序列為如SEQ ID No.1所示。

細(xì)胞融合步驟：用SP8蛋白免疫第一宿主動物，研磨經(jīng)免疫后的第一宿主動物的脾臟得到脾細(xì)胞，將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到融合的雜交瘤細(xì)胞，第一宿主動物是小鼠。

抗體制備步驟：將雜交瘤細(xì)胞注射第二宿主動物腹腔，7-10天后，取第二宿主動物的腹水，純化腹水得到SP8蛋白抗體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：相對于現(xiàn)有的以SP10蛋白作為標(biāo)志物用于檢測男性不育癥，本發(fā)明提供的SP8蛋白作為標(biāo)志物在制備男性不育檢測試劑盒中的應(yīng)用，其具有更好的靈敏度和特異性，該兩項指標(biāo)均達到100％。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的SP8蛋白及SP8蛋白抗體的應(yīng)用作進一步的說明。

男性不育很多情況是無精子癥或嚴(yán)重少精子癥。SP8蛋白是一種在男性的睪丸特異表達的蛋白，本研究表明其在精子膜表達，并分泌到精漿，是一個在精子運動調(diào)節(jié)作用中起重要作用的蛋白。通過SP8蛋白免疫小鼠等宿主動物，制備針對SP8蛋白的抗體，將抗體制備成試劑盒，能快速準(zhǔn)確的鑒定樣品中是否含有SP8蛋白。

SP8蛋白作為標(biāo)志物在制備男性不育檢測試劑盒中的應(yīng)用，SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。SP8蛋白作為男性不育檢測的蛋白靶點，具有更高的特異性，在抗原抗體反應(yīng)中的檢測靈敏度就更高。該男性不育檢測試劑盒的應(yīng)用以SP8蛋白作為檢測靶點，根據(jù)檢測出的SP8蛋白濃度用以判斷是否患有男性不育癥。SP8蛋白作為檢測靶點其具有較高的靈敏度和特異性。

SP8蛋白抗體在制備男性不育檢測試劑盒中的應(yīng)用，SP8蛋白抗體與SP8蛋白具有抗原抗體反應(yīng)，SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。針對SP8蛋白而制備的抗體，特異性也更高，更容易取得檢測結(jié)果。該男性不育檢測試劑盒含有SP8蛋白抗體，用以檢測待測樣本中的SP8蛋白濃度，根據(jù)檢測出的SP8蛋白濃度判斷是否患有男性不育癥。

一種男性不育檢測試劑盒，所述男性不育檢測試劑盒是膠體金試劑盒或酶聯(lián)免疫試劑盒，膠體金試劑盒和所述酶聯(lián)免疫試劑盒均包括SP8蛋白抗體，SP8蛋白抗體與SP8蛋白具有抗原抗體反應(yīng)，SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

進一步地，當(dāng)男性不育檢測試劑盒是膠體金試劑盒時，膠體金試劑盒包括試紙條，SP8蛋白抗體包被于試紙條的檢測線。

膠體金試劑盒是一類能快速定性分析的試劑盒，能快速獲知檢測的結(jié)果；而酶聯(lián)免疫試劑盒檢測步驟略多，但是酶聯(lián)免疫試劑盒是能夠定量分析的試劑盒。

本發(fā)明實施例提供一種SP8蛋白抗體的制備方法，包括如下步驟：

蛋白表達步驟：將重組載體轉(zhuǎn)化表達菌株表達得到SP8蛋白，重組載體包括有能表達SP8蛋白的Sp8基因。其中，SP8蛋白的氨基酸序列為如SEQ ID No.1所示。

進一步地，本發(fā)明的較佳實施例中，上述Sp8基因使用的是去掉信號肽表達片段的基因；上述表達菌株為大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌或農(nóng)桿菌等。蛋白表達的表達菌株可以選用很多的菌株，本發(fā)明優(yōu)選常見和常用的大腸桿菌、酵母菌或農(nóng)桿菌作為表達菌株。

細(xì)胞融合步驟：用SP8蛋白免疫第一宿主動物，研磨免疫后的第一宿主動物的脾臟，得到脾細(xì)胞，將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到融合的雜交瘤細(xì)胞，第一宿主動物為小鼠。

抗體制備步驟：將雜交瘤細(xì)胞注射第二宿主動物腹腔，7-10天后，取第二宿主動物的腹水，純化腹水得到SP8蛋白抗體。

進一步地，本發(fā)明的較佳實施例中，上述SP8蛋白免疫第一宿主動物是指：將SP8蛋白、弗氏佐劑和YOULONG佐劑按照1.8-2.2:0.8-1.1:0.8-1.2的體積比混合后，得到乳化液，用乳化液免疫第一宿主動物。其中，弗氏佐劑、YOULONG佐劑等均為常規(guī)試劑。

進一步地，本發(fā)明的較佳實施例中，第二宿主動物為小鼠或家兔或山羊。試驗中的第一宿主動物和第二宿主動物可以包括很多的哺乳動物，但是從實驗的可行性和可操作性分析，并且從經(jīng)濟節(jié)約的角度考慮，本實驗將第一宿主動物優(yōu)選為小鼠，將第一宿主動物優(yōu)選為小鼠、家兔和山羊。

本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生SP8蛋白抗體，其生物保藏信息：分類命名為抗體細(xì)胞株，于2016年11月18日在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號：CGMCC No.13284。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明一種SP8蛋白抗體制備方法、應(yīng)用及制備試劑盒作進一步的詳細(xì)描述。

實施例1

本實施例提供的一種SP8蛋白抗體的制備方法，包括如下步驟：

蛋白表達步驟：將能表達SP8蛋白的Sp8基因通過酶切連接，重組到pET-30a載體上，得到重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到表達菌種；取活化的表達菌種，以1:50的接種量接種到500mL的液體LB培養(yǎng)基(卡那霉素的濃度50μg/mL)中，待培養(yǎng)基的OD值在0.4到0.6的時候，加入濃度為0.8mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達12h，獲得SP8蛋白。

細(xì)胞融合步驟：將獲得的SP8蛋白、弗氏佐劑和YOULONG佐劑按照2.2:1.1:1.2的體積比混合后，得到乳化液；用乳化液免疫Balb/c小鼠，取免疫過的Balb/c小鼠的脾臟，磨碎過80目篩網(wǎng)，得到的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG4000作用下融合，篩選得到陽性的雜交瘤細(xì)胞。該雜交瘤細(xì)胞，其生物保藏信息：分類命名為抗體細(xì)胞株，于2016年11月18日在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號：CGMCC No.13284。

抗體制備步驟：將獲得的陽性的雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤細(xì)胞配成雜交瘤細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為8×10⁵個/mL；用1.5mL雜交瘤細(xì)胞懸浮液注射小鼠腹腔，10天后，取小鼠的腹水，純化腹水得到SP8蛋白抗體。

實施例2

本實施例提供的一種SP8蛋白抗體的制備方法，包括如下步驟：

蛋白表達步驟：將能表達SP8蛋白的Sp8基因通過酶切連接，重組到pET-30a載體上，得到重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化酵母菌感受態(tài)細(xì)胞，得到表達菌種；取活化的表達菌種，誘導(dǎo)大量表達SP8蛋白，獲得SP8蛋白。

細(xì)胞融合步驟：將獲得的SP8蛋白、弗氏佐劑和YOULONG佐劑按照2.0:0.8:1.2的體積比混合后，得到乳化液；用乳化液免疫Balb/c小鼠，取免疫過的Balb/c小鼠的脾臟，磨碎過90目篩網(wǎng)，得到的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG4000作用下融合，篩選得到陽性的雜交瘤細(xì)胞。

抗體制備步驟：將獲得的陽性的雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤細(xì)胞配成雜交瘤細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為1×10⁶個/mL；用1.2mL雜交瘤細(xì)胞懸浮液注射山羊腹腔，8天后，取山羊的腹水，純化腹水得到SP8蛋白抗體。

實施例3

本實施例提供的一種SP8蛋白抗體的制備方法，包括如下步驟：蛋白表達步驟：將能表達SP8蛋白的Sp8基因通過酶切連接，重組到pET-30a載體上，得到重組載體，將重組載體熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，得到表達菌種；取活化的表達菌種，大量表達SP8蛋白，獲得SP8蛋白。

細(xì)胞融合步驟：將獲得的SP8蛋白、弗氏佐劑和YOULONG佐劑按照2.0:1.0:1.0的體積比混合后，得到乳化液；用乳化液免疫Balb/c小鼠，取免疫過的Balb/c小鼠的脾臟，磨碎過100目篩網(wǎng)，得到的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG4000作用下融合，篩選得到陽性的雜交瘤細(xì)胞。

抗體制備步驟：將獲得的陽性的雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤細(xì)胞配成雜交瘤細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為1.2×10⁶個/mL；用1.0mL雜交瘤細(xì)胞懸浮液注射家兔腹腔，8天后，取家兔的腹水，純化腹水得到SP8蛋白抗體。

實施例4

本實施例提供的一種SP8蛋白抗體的制備方法，包括如下步驟：

蛋白表達步驟：將能表達SP8蛋白的Sp8基因通過酶切連接，重組到pET-32a載體上，得到重組載體，將重組載體熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，得到表達菌種；取活化的表達菌種，大量表達SP8蛋白，獲得SP8蛋白。

細(xì)胞融合步驟：將獲得的SP8蛋白、弗氏佐劑和YOULONG佐劑按照1.8:0.8:0.8的體積比混合后，得到乳化液；用乳化液免疫Balb/c小鼠，取免疫過的Balb/c小鼠的脾臟，磨碎過80目篩網(wǎng)，得到的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG4000作用下融合，篩選得到陽性的雜交瘤細(xì)胞。

抗體制備步驟：將獲得的陽性的雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤細(xì)胞配成雜交瘤細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為1.0×10⁶個/mL；用1.0mL雜交瘤細(xì)胞懸浮液注射家兔腹腔，10天后，取家兔的腹水，純化腹水得到SP8蛋白抗體。

實施例5

本實施例提供了一種檢測男性不育的試劑盒。

該檢測男性不育的試劑盒是膠體金試劑盒。該試劑盒包括試紙條，試紙條上設(shè)置有質(zhì)控線和檢測線，檢測線包被有由實施例1得到的SP8蛋白抗體。

使用方法，取樣品1mL加到EP管中，同時取SP8蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液稀釋到工作濃度；取試紙條分別放入EP管中并計時；5-15min后觀察反應(yīng)結(jié)果；如果質(zhì)控線和檢測線均有顏色反應(yīng)，且與標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)一致，就可以判斷樣品含有SP8蛋白靶點；如果陰性對照顯示僅質(zhì)控線顯色，說明試紙條正常，若檢測結(jié)果與陰性對照反應(yīng)一致，說明樣本不含SP8蛋白靶點。緩沖液可以自備也可以市購。

該檢測男性不育的試劑盒以SP8蛋白作為靶點，能夠快速準(zhǔn)確的檢測并得出結(jié)果，說明該試劑盒具有很好地靈敏度和特異性。

實施例6

本實施例提供了一種檢測男性不育的酶聯(lián)免疫試劑盒。

該檢測男性不育的酶聯(lián)免疫試劑盒，SP8蛋白抗體(通過實施例1提供的方法獲得)。

采用本實施例提供的檢測男性不育的酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測的方法：1、設(shè)置空白孔，只添加顯色液和終止液；待測樣本和不同濃度的SP8蛋白標(biāo)準(zhǔn)品100μL分別加到相應(yīng)的酶標(biāo)板的孔里，密封酶標(biāo)板，孵育30-120min；2、洗滌液洗板3-5次，拍干；3、加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔不加酶標(biāo)試劑；4、孵育30-120min，洗滌液洗板3-5次，6、加入顯色劑100μL，輕輕混勻，37℃避光反應(yīng)10-20min；7、終止反應(yīng)并讀數(shù)，加入終止液50μL，終止反應(yīng)，以450nm波長讀數(shù)。

根據(jù)空白孔調(diào)零酶標(biāo)儀，根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)建立一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本的OD₄₅₀值，計算出樣本的SP8蛋白濃度，并根據(jù)SP8蛋白的濃度及相應(yīng)的用以判斷男性不育癥的標(biāo)準(zhǔn)值，對樣本做出相應(yīng)的評價。

所用的酶標(biāo)板、SP8蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及稀釋液、酶標(biāo)試劑顯色劑A和B、終止液和洗滌液均購買

該檢測男性不育的試劑盒以SP8蛋白作為靶點，以實施例1制備的SP8蛋白抗體預(yù)先包被酶標(biāo)板，通過酶聯(lián)免疫吸附測定，能精確的讀取計算出樣本的SP8蛋白的含量，即使SP8蛋白的含量很低也能被檢出，所以該檢測男性不育的試劑盒具有很好的檢測靈敏度和抗原抗體結(jié)合的特異性。

實施例7

本實施例提供了一種檢測男性不育的酶聯(lián)免疫試劑盒。

該檢測男性不育的酶聯(lián)免疫試劑盒包括SP8蛋白抗體(由實施例1的方法制得)，以及酶標(biāo)板、SP8蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及稀釋液、酶標(biāo)試劑顯色劑A和B、終止液和洗滌液。

檢測方法同實施例6。

效果同實施例6。

試驗例1

抗體配對檢測，取實施例1-4制備的SP8蛋白抗體，進行抗體配對檢測實驗。參考以下步驟：

1.1包被：將實施例1-4得到的SP8蛋白抗體分別用CB buffer稀釋至5ug/ml，分別加入酶標(biāo)板孔中，每孔100ul，37℃包被3小時。每個實施例的SP8蛋白抗體均設(shè)置一個陽性對照組和一個陰性對照組。

1.2封閉：洗滌上述包被有SP8蛋白抗體酶標(biāo)板3次，拍干，用CB buffer稀釋羊血清至10％，加入酶標(biāo)板孔中，每孔150ul，37℃封閉2小時。

1.3抗原孵育：洗滌封閉過的酶標(biāo)板3次，拍干，往陽性對照組加入100ul濃度為1ug/ml的陽性樣本(SP8蛋白)提取液，往陰性對照組加入00ul濃度稀釋至1ug/ml的陰性樣本(不含SP8蛋白)，37℃反應(yīng)45分鐘。

1.4多抗及二抗孵育：洗滌抗原孵育過的酶標(biāo)板3次，拍干，加入對應(yīng)的兔多抗，每孔100ul，37℃反應(yīng)30分鐘；洗滌三次，拍干；加入二抗即堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔多抗抗體，每孔100ul，37℃避光反應(yīng)30分鐘。

1.5顯色：洗滌3次，拍干，加入BCIP/NBT顯色劑，每孔100ul，37℃避光反應(yīng)15分鐘。

1.6終止反應(yīng)與讀數(shù)：加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上，檢測每個實施例對應(yīng)的陽性對照組和陰性對照組的最終讀數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 抗體配對檢測結(jié)果

本試驗例中，以450nm/620nm雙波長讀數(shù)的差值ΔA表征被檢樣本的濃度，該差值ΔA與被檢樣本的濃度成正比。從表1可以看出，通過抗原抗體反應(yīng)顯色，實施例1-4獲得的SP8蛋白抗體均能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，實施例1-4獲得的SP8蛋白抗體與抗原即SP8蛋白具有特異性的結(jié)合能力。

試驗例2

抗體靈敏度檢測，選取實驗例1-4制備的SP8蛋白抗體，稀釋高濃度的抗原得到不同濃度的稀釋抗原，通過抗原抗體反應(yīng)，檢測抗體靈敏度。參考以下步驟：

2.1包被：將實施例1-4獲得的SP8蛋白抗體用CB buffer稀釋至0.1ug/ml，加入酶標(biāo)板孔中，每孔100ul，37℃包被3小時。

2.2封閉：洗滌上述添加了抗體的酶標(biāo)板3次，拍干，用CB buffer稀釋羊血清至10％，加入酶標(biāo)板孔中，每孔150ul，37℃封閉2小時。

2.3抗原孵育：洗滌上述封閉過的酶標(biāo)板3次，拍干，同一抗體的一組4個酶標(biāo)孔分別加入100ul不同濃度的抗原，抗原濃度分別是1000ppb、100ppb、10pp和0ppb，37℃反應(yīng)45分鐘。

2.4多抗孵育：洗滌上述加入過抗原的酶標(biāo)板3次，拍干，分別加入稀釋1倍(1X)、3倍(3X)、9倍(9X)和27倍(27X)的兔多抗，每孔100ul，37℃反應(yīng)30分鐘。

2.5酶孵育：洗滌上述多抗孵育過的酶標(biāo)板3次，拍干，加入酶標(biāo)二抗即堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔多抗抗體，每孔100ul，37℃反應(yīng)30分鐘。

2.6顯色：用洗滌緩沖液，洗滌上述酶標(biāo)二抗孵育過的酶標(biāo)板3次，拍干，加入顯色劑，每孔100ul，37℃避光反應(yīng)15分鐘。

2.7終止反應(yīng)與讀數(shù)：加入終止液終止反應(yīng)在酶標(biāo)儀上以450nm/620nm雙波長讀數(shù)。結(jié)果如表2所示。

表2 抗體靈敏度檢測結(jié)果

從表2可看出，隨著抗原濃度的不斷降低，SP8蛋白抗體的檢出能力也在不斷地減低；兔多抗的濃度越低，SP8蛋白抗體的檢出能力也隨著減低。當(dāng)兔多抗的濃度稀釋27倍后，抗原濃度降到10ppb時候，實施例1-4的SP8蛋白抗體的檢出能力略高于空白對照。所以從靈敏度的檢測可以看出，實施例1-4的抗體的靈敏度基本上達到10ppb。

試驗例3

本試驗提供的雜交瘤細(xì)胞制備方法，該雜交瘤細(xì)胞可用于生產(chǎn)SP8蛋白抗體，所得到的SP8蛋白抗體能夠特異性地與SP8蛋白結(jié)合。該制備方法包括如下步驟：

蛋白表達步驟：將能表達SP8蛋白的Sp8基因通過酶切連接，重組到pET-30a載體上，得到重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到表達菌種；取活化的表達菌種，以1:50的接種量接種到500mL的液體LB培養(yǎng)基(卡那霉素的濃度50μg/mL)中，待培養(yǎng)基的OD值在0.4到0.6的時候，加入濃度為0.8mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達12h，獲得SP8蛋白。

細(xì)胞融合步驟：將獲得的SP8蛋白、弗氏佐劑和YOULONG佐劑按照2.2:1.1:1.2的體積比混合后，得到乳化液；用乳化液免疫Balb/c小鼠，取免疫過的Balb/c小鼠的脾臟，磨碎過80目篩網(wǎng)，得到的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG4000作用下融合，篩選得到陽性的雜交瘤細(xì)胞。

本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生SP8蛋白抗體，其生物保藏信息：分類命名為抗體細(xì)胞株，于2016年11月18日在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號：CGMCC No.13284。

綜上所述，以SP8蛋白作為標(biāo)志物在制備男性不育檢測試劑盒中的應(yīng)用，該應(yīng)用以SP8蛋白作為男性不育癥檢測的蛋白靶點，其具有更好的靈敏度和特異性；以SP8蛋白抗體在制備男性不育檢測試劑盒中的應(yīng)用，男性不育檢測試劑盒包括能夠特異性結(jié)合SP8蛋白的SP8蛋白抗體，因此，該試劑盒能快速準(zhǔn)確的檢測出樣本的SP8蛋白的情況；另外，本發(fā)明得到的雜交瘤細(xì)胞能分泌SP8蛋白抗體，該雜交瘤細(xì)胞分泌的SP8蛋白抗體能夠特異性結(jié)合SP8蛋白，其可在制備男性不育試劑盒中進行應(yīng)用。

本發(fā)明實施例的一種SP8蛋白抗體的制備方法，該方法操作簡單易行，成本低廉，針對性較強；而且成功率較高。通過該方法制得的SP8蛋白抗體，經(jīng)抗體配對檢測，能夠與抗原發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，是能夠工作的；而通過抗體靈敏度實驗檢測，抗體的靈敏度在10ppb的水平依然能夠發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，說明制得的抗體靈敏度較高；通過抗體的驗證進一步驗證抗體的制備方法的有效。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都樸華科技有限公司

<120> -一種SP8蛋白抗體的制備方法及其應(yīng)用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 224

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Leu Tyr Cys Gln Lys Gly Leu Ser Met Thr Val Glu Ala Asp Pro Ala

1 5 10 15

Asn Met Phe Asn Trp Thr Thr Glu Glu Val Glu Thr Cys Asp Lys Gly

20 25 30

Ala Leu Cys Gln Glu Thr Ile Leu Ile Ile Lys Ala Gly Thr Glu Thr

35 40 45

Ala Ile Leu Ala Thr Lys Gly Cys Ile Pro Glu Gly Glu Glu Ala Ile

50 55 60

Thr Ile Val Gln His Ser Ser Pro Pro Gly Leu Ile Val Thr Ser Tyr

65 70 75 80

Ser Asn Tyr Cys Glu Asp Ser Phe Cys Asn Asp Lys Asp Ser Leu Ser

85 90 95

Gln Phe Trp Glu Phe Ser Glu Thr Thr Ala Ser Thr Val Ser Thr Thr

100 105 110

Leu His Cys Pro Thr Cys Val Ala Leu Gly Thr Cys Phe Ser Ala Pro

115 120 125

Ser Leu Pro Cys Pro Asn Gly Thr Thr Arg Cys Tyr Gln Gly Lys Leu

130 135 140

Glu Ile Thr Gly Gly Gly Ile Glu Ser Ser Val Glu Val Lys Gly Cys

145 150 155 160

Thr Ala Met Ile Gly Cys Arg Leu Met Ser Gly Ile Leu Ala Val Gly

165 170 175

Pro Met Phe Val Arg Glu Ala Cys Pro His Gln Leu Leu Thr Gln Pro

180 185 190

Arg Lys Thr Glu Asn Gly Ala Thr Cys Leu Pro Ile Pro Val Trp Gly

195 200 205

Leu Gln Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ser Phe Ile His Phe Ser

210 215 220

<210> 2

<211> 672

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ctgtattgtc aaaagggtct gtccatgact gtggaagcag atccagccaa tatgtttaac 60

tggaccacag aggaagtgga gacttgtgac aaaggggcac tttgccagga aaccatacta 120

ataattaaag cagggactga gacagccatt ttggccacga agggctgcat cccggaaggg 180

gaggaggcca taacaattgt ccagcactct tcacctcccg gcctgatcgt gacctcctac 240

agtaactact gtgaggattc cttctgtaat gacaaagaca gcctgtctca gttttgggag 300

ttcagtgaga ccacagcttc cactgtgtca acaaccctcc attgtccaac ctgtgtggct 360

ttggggacct gtttcagtgc tccttctctt ccctgtccca atggtacaac tcgatgctat 420

caaggaaaac ttgagatcac tggaggtggc attgagtcgt ctgtggaggt caaaggctgt 480

acagccatga ttggctgcag gctgatgtct ggaatcttag cagtaggacc catgtttgtg 540

agggaagcgt gcccacatca gctgctcact caacctcgaa agactgaaaa tggggccacc 600

tgtcttccca ttcctgtttg ggggttacag ctactgctgc cattgctgct gccatcattt 660

attcactttt cc 672