專利名稱：人血管生成抑制素基因、含有該基因的載體和菌株及其表達(dá)產(chǎn)物的生產(chǎn)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人血管生成抑制素基因、含有該基因的載體以及用該載體轉(zhuǎn)化的微生物菌株及其表達(dá)產(chǎn)物的生產(chǎn)和應(yīng)用。
臨床上常見某些原位腫瘤經(jīng)手術(shù)切除后，往往加速其遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移瘤的生氏。多年來，這一現(xiàn)象的機(jī)制一直懸而未決。1994年，O’Reilly等人從接種Lewis肺癌低轉(zhuǎn)移突變株(LLC-LM)小鼠的尿液和血清中分離純化得到一種蛋白質(zhì)，命名為血管生成抑制素(Angiostatin)?？贵w中和實(shí)驗(yàn)表明血管生成抑制素是原發(fā)瘤抑制轉(zhuǎn)移瘤生長的關(guān)鍵，動物實(shí)驗(yàn)研究表明血管生成抑制素對人前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞株在小鼠體內(nèi)形成的原發(fā)瘤有95％以上的抑制作用，顯示其在腫瘤治療研究領(lǐng)域誘人的應(yīng)用前景。
血管生成旺盛是實(shí)體腫瘤組織得以迅速生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。人血管生成抑制素通過抑制新生血管的形成，切斷腫瘤的血液供應(yīng)和營養(yǎng)供給從而抑制腫瘤生長。由于正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞是不再分裂增殖的，因而不受該藥物的影響，這充分顯示此類生物基因工程藥物優(yōu)于以往的抗癌藥物，具有高度的選擇性、特異性和極小的毒副作用。由于從血液或尿液中提取，或經(jīng)彈性蛋白酶消化制得的血管生成抑制素來源有限且價(jià)格昂貴，因而利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人血管生成抑制素十分必要。
本發(fā)明的目的是利用基因工程技術(shù)，提供重組人血管生成抑制素基因，構(gòu)建含有該基因的載體，特別是表達(dá)載體及其轉(zhuǎn)化的微生物菌株，并且提供由這些菌株高效表達(dá)、生產(chǎn)重組人血管生成抑制素的方法及表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
氨基酸序列分析表明血管生成抑制素是纖溶酶原的一個(gè)內(nèi)片段，相當(dāng)于纖溶酶原第98至440位氨基酸序列，即Kringle1-4(至少包括Kringle1-3)。人纖溶酶原經(jīng)彈性蛋白酶消化后產(chǎn)生這一區(qū)段，具有抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制血管生成和轉(zhuǎn)移瘤生長的生物活性，而完整的纖溶酶原并不具有這一活性。
本發(fā)明的人血管生成抑制素基因是以人纖溶酶原cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增而得到的，它來源于人纖溶酶原cDNA的Kringle1-4或Kringle1-3結(jié)構(gòu)域所對應(yīng)的基因片段。
按照上述的人血管生成抑制素基因，它最好是人纖溶酶原cDNA上292bp至1320bp(相當(dāng)于98位至440位氨基酸)的片段，其核甘酸序列及其所編碼的氨基酸序列如序列表1(SEQID No.1)所示。
本發(fā)明所用作模板的人纖溶酶原cDNA已在以下文獻(xiàn)中公開Forsgren M,et al.Molecular cloning and characterization of a full-length cDNAclone for human plasminogen.FEBS Lett,1987,213:254-260本發(fā)明還構(gòu)建了含有上述人血管生成抑制素基因的載體；特別是含有該基因的大腸桿菌表達(dá)載體以及枯草桿菌、假絲酵母和漢遜酵母的表達(dá)載體。這些載體的構(gòu)建方法是按常規(guī)方法，將通過PCR方法合成的人血管生成抑制素基因經(jīng)酶切和分離純化后，接入到已有的相應(yīng)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間，即構(gòu)建成所需的含有人血管生成抑制素基因的表達(dá)載體。
上述含人血管生成抑制素基因的大腸桿菌表達(dá)載體優(yōu)選由本發(fā)明合成的人血管生成抑制素基因與大腸桿菌表達(dá)載體pBV220構(gòu)建成的重組表達(dá)載體，命名為pBVA2。其構(gòu)建圖和酶切分析見圖2及圖3。本發(fā)明還用上述含有人血管生成抑制素基因的相應(yīng)表達(dá)載體分別構(gòu)建了能高效表達(dá)人血管生成抑制素的大腸桿菌重組株以及枯草桿菌、假絲酵母和漢生酵母重組株。
本發(fā)明還提供了利用上述大腸桿菌重組株生產(chǎn)人血管生成抑制素的方法。先將菌株進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵并經(jīng)熱誘導(dǎo)使其高效表達(dá)人血管生成抑制素重組蛋白，再收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組人血管生成抑制素產(chǎn)品。
本發(fā)明的上述能表達(dá)人血管生成抑制素的大腸桿菌重組菌株優(yōu)選由含有人血管生成抑制素基因的表達(dá)載體pBVA2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α而得到的菌株，命名為Escherichia coliDH5α(pBVA2)，簡稱E.coli DH5α(pBVA2)。
利用該大腸桿菌重組菌株E.coli DH5α(pBVA2)生產(chǎn)人血管生成抑制素的具體方法為(1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵將菌種(挑取單菌落)接種在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中30～37℃,150～200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)種于相同的培養(yǎng)基中，30～37℃,150～250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2～4h，升溫至42℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)3～4h后收菌；(2)表達(dá)產(chǎn)物的純化收集上述培養(yǎng)的菌體，將細(xì)胞破碎后離心收集包涵體沉淀，用含Triton X-100和2M尿素的TE溶液反復(fù)洗滌沉淀，然后將沉淀溶于8M尿素中，用復(fù)性液復(fù)性并經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾層析，對水透析，經(jīng)凍干即為純化的人血管生成抑制素。
上述方法中的菌種培養(yǎng)發(fā)酵步驟還可采用15升發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，以提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。
上述方法所得到的重組人血管生成抑制素在雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗血管生成及對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的強(qiáng)抑制作用，所以可作為有效成份用于制備新一代的抗腫瘤(抗癌)藥物。
本發(fā)明的大腸桿菌重組菌株E.coli DH5α(pBVA2)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏編號CCTCC M98014，保藏日1998年9月21日。
由該E.coli DH5α(pBVA2)菌株可擴(kuò)增、提取得到本發(fā)明的重組表達(dá)載體pBVA2及人血管生成抑制素基因。方法是(1)取E.coli DH5α(pBVA2)單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，離心收集菌種，用常規(guī)的堿裂解法提取質(zhì)粒pBVA2。
(2)用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶解質(zhì)粒pBVA2產(chǎn)生兩條帶，分離提取約1kb的小帶即為人血管生成抑制素基因。
用上述得到的人血管生成抑制素基因與適當(dāng)?shù)妮d體連接，即可構(gòu)建出所需的含人血管生成抑制素基因的載體。用所構(gòu)建的表達(dá)載體即可轉(zhuǎn)化并構(gòu)建出相應(yīng)的能表達(dá)重組人血管生成抑制素的重組菌株。
本發(fā)明的人血管生成抑制素基因通過與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體連接后可在相應(yīng)的微生物菌株中高效表達(dá)，經(jīng)分離純化即可獲得高純度的重組人血管生成抑制素，而且具有表達(dá)水平高，容易純化的優(yōu)點(diǎn)。例如，本發(fā)明的由含有人血管生成抑制素基因的表達(dá)載體pBVA2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌株E.coli DH5α(pBVA2)，其對人血管生成抑制素的表達(dá)量可達(dá)263mg/L(培養(yǎng)物)。所以，通過本發(fā)明，可方便地大量生產(chǎn)重組人血管生成抑制素，而且成本較低。這將為獲得來源穩(wěn)定、成本便宜的重組人血管生成抑制素并用其制備高療效低毒副作用的新一代抗癌(腫瘤)藥物提供一條切實(shí)可行的途徑。
以下通過實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1是以人纖溶酶原cDNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(重組人血管生成抑制素基因)的凝膠電泳分析圖。其中1．PCR產(chǎn)物2．分子量標(biāo)準(zhǔn)3．pCR2.1 4．pCR2.1-A/EcoRⅠ。
圖2是重組表達(dá)載體pBVA2的構(gòu)建過程示意圖，其中，PR、PL為(噬菌體啟動子，T1、T2為rrnB的轉(zhuǎn)錄終止序列。
圖3是質(zhì)粒pBVA2的酶切分析，其中1．pBV220/EcoRⅠ+BamHⅠ,2．pMA1/EcoRⅠ+BamHⅠ,3．pBVA2/EcoRⅠ+BamHⅠ,4．分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖4是重組人血管生成抑制素基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜。其中，1．蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，2．E.coli DH5α(pBVA2)不誘導(dǎo)，3．E.coli DH5α(pBV220)誘導(dǎo)，4．E.coliDH5α(pBVA2)誘導(dǎo)，5．E.coli DH5α(pBVA2)裂解物上清，6．E.coli DH5α(pBVA2)裂解物沉淀。
圖5是重組人血管生成抑制素基因表達(dá)產(chǎn)物的CAM血管生成抑制活性分析結(jié)果示意圖。其中(A)為負(fù)對照，(B)為添加本發(fā)明生產(chǎn)的重組人血管生成抑制素的結(jié)果。
圖6示重組人血管生成抑制素基因表達(dá)產(chǎn)物對小鼠黑色素瘤的抑制作用，其中，單只為不用藥對照小鼠，雙只為用藥小鼠。
實(shí)施例1人血管生成抑制素基因的合成根據(jù)已發(fā)表的人纖溶酶原cDNA全序列，設(shè)計(jì)合成兩段引物，上游引物是在第292位堿基起的18個(gè)同源堿基前加上SalⅠ,EcoRⅠ的限制酶切位點(diǎn)以及起始密碼子ATG(5’CCGTCGACGAATTCAATGTATCTCTCAGAGTGCAAC)，下游引物是在第1320位堿基起的前18個(gè)同源堿基加上限制酶切位點(diǎn)BamHⅠ,HindⅢ和終止密碼子TAG(5’-CCCAAGCTTGGATCCTAGTCTGTGGTAAAACACCAG)，以人纖溶酶原cDNA為模版，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增人纖溶酶原第98位至440位氨基酸序列相應(yīng)的DNA序列即人血管生成抑制素基因，反應(yīng)條件為第一循環(huán)94℃變性4分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；以后各循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，共25個(gè)循環(huán)。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖1。從圖1可見PCR擴(kuò)增了一段長約1.0kb的序列。
將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T-載體pCR2.1TM上得到重組質(zhì)粒pCR2.1A。以重組質(zhì)粒pCR2.1A為模版，pCR2.1TM的一對通用引物和合成的一對與目的基因中間一段同源的引物進(jìn)行序列測定，結(jié)果證實(shí)PCR產(chǎn)物與人纖溶酶原cDNA上第292位至1320位堿基序列一致，表明克隆的PCR產(chǎn)物是人血管生成抑制素基因。人血管生成抑制素基因序列測定結(jié)果見序列表1。為了構(gòu)建表達(dá)載體的方便，用SalⅠ及HindⅢ從pCR2.1A上將人血管生成抑制素基因切下轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pMl的SalⅠ及HindⅢ位點(diǎn)上獲得重組質(zhì)粒pMA1。
實(shí)施例2含人血管生成抑制素基因的大腸桿菌表達(dá)載體pBVA2的構(gòu)建質(zhì)粒pMA1經(jīng)限制酶EcoRⅠ及BamHⅠ酶切后走瓊脂糖凝膠電泳，分離純化約1.0kb的人血管生成抑制素基因片段；大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pBV220經(jīng)限制酶EcoRⅠ及BamHⅠ酶切后分離純化3.67kb的大片段，與1.0kb的人血管生成抑制素基因片段按1∶2混合，用T4連接酶連接16小時(shí)后用標(biāo)準(zhǔn)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，篩選具氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，以標(biāo)準(zhǔn)方法提取質(zhì)粒，篩選大小約4.7kb的重組質(zhì)粒，用限制酶EcoRⅠ及BamHⅠ酶切重組質(zhì)粒，得到1.0kb和3.67kb的兩個(gè)片段，大小分別與人血管生成抑制素基因和表達(dá)載體pBV220大小相同，證明人血管生成抑制素基因已克隆入大腸桿菌表達(dá)載體pBV220中，重組質(zhì)粒命名為pBVA2。質(zhì)粒構(gòu)建圖和酶切分析圖見圖2及圖3。
實(shí)施例3能高效表達(dá)人血管生成抑制素的大腸桿菌重組株E.coli DH5α(pBVA2)的構(gòu)建用CaCl2法將pBVA2轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，在含氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒檢測和酶切分析獲得含pBVA2的重組轉(zhuǎn)化子E.coli DH5α(pBVA2)。
實(shí)施例4含血管生成抑制素基因的枯草桿菌漢生酵母和假絲酵母工程菌的構(gòu)建。
(1)枯草桿菌工程菌DB1342(pURTQAg)的構(gòu)建用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切質(zhì)粒pCR2.1A，分離1kb的小片段即人血管生成抑制素基因，然后將此片段插入質(zhì)粒pURTQ4的相應(yīng)位點(diǎn)上，獲得含人血管生成抑制素基因的質(zhì)粒pURTQAg。
用感受態(tài)轉(zhuǎn)化法將pURTQAg轉(zhuǎn)入枯草桿菌DB1342，即獲得枯草桿菌工程菌DB1342(pURTQAg)。
(2)漢生酵母工程菌Hansenula polymorpha A16(pMIRHA2)的構(gòu)建。
用限制酶SalⅠ及HindⅢ酶切質(zhì)粒pMA1，分離人血管生成抑制素基因，重組進(jìn)質(zhì)粒pMIRH-2獲得含人血管生成抑制素基因的重組質(zhì)粒pMIRHA2，然后用LiCl轉(zhuǎn)化法將pMIRHA2引入漢生酵母Hansenula polymorpha A16，獲得漢生酵母工程菌Hansenula polymorpha A16(pMIRHA2)。
(3)假絲酵母工程菌Candida boidinii(pULA3)的構(gòu)建。
用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ將人血管生成抑制素基因從質(zhì)粒pCR2.1A上切下，轉(zhuǎn)入大腸桿菌-酵母質(zhì)粒pUL4，獲得含人血管生成抑制素基因的重組質(zhì)粒pULA3，再用LiCl轉(zhuǎn)化法將pULA3引入波氏假絲酵母獲得含人血管生成抑制素基因的工程菌Candida boidinii(pULA3)。
實(shí)施例5利用大腸桿菌基因T程菌F.coli DH5α(pBVA2)生產(chǎn)重組人血管生成抑制素。
(1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵挑取大腸桿菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVA2)單菌落接種在含100ug/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，30℃,200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)過夜，次日按10％接種量轉(zhuǎn)種于適當(dāng)體積的相同培養(yǎng)基中，按30℃,250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，待A600約為0.4時(shí)轉(zhuǎn)至45℃水浴中搖動5分鐘，使之迅速升溫至42℃誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，在42℃條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4小時(shí)后收菌。合成的人血管生成抑制素基因在大腸桿菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVA2)中已獲得高效表達(dá)。
另外，可以通過15升發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。挑取大腸桿菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVA2)單菌落接種在含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，30℃200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)過夜，按1％轉(zhuǎn)種到4個(gè)500mL三角瓶中，每瓶含250mL的LB培養(yǎng)液，含50μg/mL氨芐青霉素，30℃ 200轉(zhuǎn)/每分鐘搖床培養(yǎng)12小時(shí)作為種子液。15升發(fā)酵罐B.Braun Biostat C型，含9升LB培養(yǎng)液，少量食用油作為防沫劑。120℃滅菌20分鐘，加1克氨芐青霉素，1升種子液。pH6.8-7.4，攪拌速度500轉(zhuǎn)/每分鐘，通氣量4-6升/每分鐘，溶氧50％,30℃發(fā)酵3小時(shí)至A600=0.5，升溫至42℃進(jìn)行熱誘導(dǎo)4小時(shí)完成發(fā)酵從10升發(fā)酵液中得到50克濕菌體，重組人血管生成抑制素表達(dá)量為263mg/mL。
取少量細(xì)胞加2×上樣緩沖液，煮沸5分鐘后按標(biāo)準(zhǔn)方法走SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果見圖4，顯示經(jīng)誘導(dǎo)的DH5α(pBVA2)在43kd的位置上出現(xiàn)一條新的蛋白帶，未誘導(dǎo)的DH5α(pBVA2)及DH5α(pBV220)不出現(xiàn)此帶，證明人血管生成抑制素已在DH5α(pBVA2)中誘導(dǎo)表達(dá)。
(2)表達(dá)的重組人血管生成抑制素的純化收集高效表達(dá)重組人血管生成抑制素的菌體，經(jīng)超聲波破碎后離心收集包含體沉淀，用含TritonX-100的TE溶液和含2M尿素的TE溶液反復(fù)洗滌沉淀，除去細(xì)胞碎片，雜蛋白，核酸等雜質(zhì)，最終包含體中目標(biāo)蛋白純度為90％以上。回收率76％。按每10毫克包含體加2毫升含8M尿素的溶解緩沖液中，室溫放置1小時(shí)即可溶解。緩緩加入10倍體積的復(fù)性液復(fù)性。復(fù)性蛋白經(jīng)Sephadex G-100柱(1.5×50cm)凝膠過濾層析，用洗脫緩沖液洗脫，流速3mL/min，每管收集5毫升測定A280，繪制洗脫曲線。收集各吸收峰進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，將目標(biāo)峰樣品滴加等體積復(fù)性液，4℃攪拌24小時(shí)，使之進(jìn)一步復(fù)性，再對水充分透析，凍干即為重組人血管生成抑制素純品。
實(shí)施例6 CAM血管生成抑制活性分析在6天齡雞胚的載樣濾紙片上加30ng bFGF作為對照，實(shí)驗(yàn)組加同劑量的bFGF和不同劑量的重組人血管生成抑制素，作用48小時(shí)后觀察。結(jié)果表明，對照組的絨毛尿囊膜在bFGF作用下有明顯的放射狀新生毛細(xì)血管芽形成，實(shí)驗(yàn)組隨著重組人血管生成抑制素劑量的增加，新生毛細(xì)血管的形成受不同程度的抑制，50μg/只和100μg/只劑量組減少了新生毛細(xì)血管的數(shù)量但未能完全抑制新生毛細(xì)血管的生成，而200μg/只劑量組則管生成抑制素在濾紙片中心附近形成無血管區(qū)，如圖5所示。
實(shí)施例7重組人血管生成抑制素對小鼠原位B16黑色素瘤生長的抑制作用C57B16/J小鼠。20±2g,20只，背部皮下接種0.2mL B16黑色素瘤細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/mL)。接種10天后待瘤體積達(dá)100-200mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分5組，每組4只1)對照組注射0.3ml PBS；2)50mg/kg體重劑量組，每12小時(shí)投藥一次；3)100mg/kg體重劑量組，每24小時(shí)投藥一次；4)150mg/kg體重劑量組，每24小時(shí)投藥一次；5)200mg/1kg體重劑量組，每24小時(shí)投藥一次；兩周后觀察小鼠體重及瘤體積重量的變化。從結(jié)果可見，重組人血管生成抑制素可高效抑制B16黑色素瘤細(xì)胞的生長，抑瘤效應(yīng)呈劑量依賴性。結(jié)果如表1和圖6所示。
表1 Ecoli DH5α(pBVA2)表達(dá)產(chǎn)物對C57BL6/J小鼠原位B16黑色素瘤的生長抑制作用
序列表1(SEQ ID No.1)CCGTCGACGA ATTCA ATG TAT CTC TCA GAG TGC AAG ACT GGG AAT GGA48Met Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly1 5 10AAG AAC TAC AGA GGG ACG ATG TCC AAA ACA AAA AAT GGC ATC ACC TGT96Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys15 20 25CAA AAA TGG AGT TCC ACT TCT CCC CAC AGA GCT AGA TTC TCA CCT GCT144Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala30 35 40ACA CAC CCC TCA GAG GGA CTG GAG GAG AAC TAC TGC AGG AAT CCA GAC192Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp45 50 55AAC GAT CCG CAG GGG CCC TGG TGC TAT ACT ACT GAT CCA GAA AAG AGA280Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg60 65 70 75TAT GAC TAC TGC GAC ATT CTT GAG TGT GAA GAG GGA TGT ATG CAT TGC328Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys80 85 90AGT GGA GAA AAC TAT GAC GGC AAA ATT TCC AAG ACC ATG TCT GGA CTG376Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu95 100 105GAA TGC CAG GCC TGG GAC TCT CAG AGC CCA CAC GCT CAT GGA TAC ATT424Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile110 115 120CCT TCC AAA TTT CCA AAC AAG AAC CTG AAG AAG AAT TAC TGT CGT AAC472Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn125 130 135CCC GAT AGG GAG CTG CGG CCT TGG TGT TTC ACC ACC GAC CCC AAC AAG520Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys140 145 150 155CGC TGG GAA CTT TGC GAC ATC CCC CGC TGC ACA ACA CCT CCA CCA TCT568Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser160 165 170TCT GGT CCC ACC TAC CAG TGT CTG AAG GGA ACA GGT GAA AAC TAT CGC616Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg175 180 185GGG AAT GTG GCT GTT ACC GTT TCC GGG CAC ACC TGT CAG CAC TGG AGT664Gly Asn Val Ala Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser190 195 200GCA CAG ACC CCT CAC ACA CAT AAC AGG ACA CCA GAA AAC TTC CCC TGC712Ala Gln Thr Pro His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys205 210 215AAA AAT TTG GAT GAA AAC TAC TGC CGC AAT CCT GAC GGA AAA AGG GCC760Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala220 225 230 235CCA TGG TGC CAT ACA ACC AAC AGC CAA GTG CGG TGG GAG TAC TGT AAG808Pro Trp Cys His Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys240 245 250ATA CCG TCC TGT GAC TCC TCC CCA GTA TCC ACG GAA CAA TTG GCT CCC856lle Pro Ser Cys Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro255 260 265ACA GCA CCA CCT GAG CTA ACC CCT GTG GTC CAG GAC TGC TAC CAT GGT904Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly270 275 280GAT GGA CAG AGC TAC CGA GGC ACA TCC TCC ACC ACC ACC ACA GGA AAG952Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys285 290 295AAG TGT CAG TCT TGG TCA TCT ATG ACA CCA CAC CGG CAC CAG AAG ACC 1000Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gin Lys Thr300 305 310 315CCA GAA AAC TAC CCA AAT GCT GGC CTG ACA ATG AAC TAC TGC AGG AAT 1048Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn320 325 330CCA GAT GCC GAT AAA GGC CCC TGG TGT TTT ACC ACA GAC TAG 1090Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp335340GATCCAAGCT TGGG 110權(quán)利要求
1．人血管生成抑制素基因，其特征是它是以人纖溶酶原cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增而得到的來源于人纖溶酶原cDNA的Kringle1-4或Kringle1-3結(jié)構(gòu)域所對應(yīng)的基因片段。
2．按照權(quán)利要求1所述的來源于人纖溶酶原eDNA Kringle1-4結(jié)構(gòu)域所對應(yīng)的基因片段的人血管生成抑制素基因，其特征是它是人纖溶酶原cDNA上292bp至1320bp(相當(dāng)于第98位氨基酸至440位氨基酸)的片段，其核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列如下CCGTCGACGA ATTCA ATG TAT CTC TCA GAG TGC AAG ACT GGG AAT GGA48Met Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly1 5 10AAG AAC TAC AGA GGG ACG ATG TCC AAA ACA AAA AAT GGC ATC ACC TGT96Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys15 20 25CAA AAA TGG AGT TCC ACT TCT CCC CAC AGA CCT AGA TTC TCA CCT GCT144Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala30 35 40ACA CAC CCC TCA GAG GGA CTG GAG GAG AAC TAC TGC AGG AAT CCA GAC192Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp45 50 55AAC GAT CCG CAG GGG CCC TGG TGC TAT ACT ACT GAT CCA GAA AAG AGA240Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg60 65 70 75TAT GAC TAC TGC GAC ATT CTT GAG TGT GAA GAG GGA TGT ATG CAT TGC288Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys80 85 90AGT GGA GAA AAC TAT GAC GGC AAA ATT TCC AAG ACC ATG TCT GGA CTG336Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu95 100 105GAA TGC CAG GCC TGG GAC TCT CAG AGC CCA CAC GCT CAT GGA TAC ATT384Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile110 115 120CCT TCC AAA TTT CCA AAC AAG AAC CTG AAG AAG AAT TAC TGT CGT AAC432Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Ash Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn125 130 135CCC GAT AGG GAG CTG CGG CCT TGG TGT TTC ACC ACC GAC CCC AAC AAG 480Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys140 145 150 155CGC TGG GAA CTT TGC GAC ATC CCC CGC TGC ACA ACA CCT CCA CCA TCT 528Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser160 165 170TCT GGT CCC ACC TAC CAG TGT CTG AAG GGA ACA GGT GAA AAC TAT CGC 576Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg175 180 185GGG AAT GTG GCT GTT ACC GTT TCC GGG CAC ACC TGT CAG CAC TGG AGT 624Gly Asn Val Ala Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser190 195 200GCA CAG ACC CCT CAC ACA CAT AAC AGG ACA CCA GAA AAC TTC CCC TGC 672Ala Gln Thr Pro His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys205 210 215AAA AAT TTG GAT GAA AAC TAC TGC CGC AAT CCT GAC GGA AAA AGG GCC 720Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala220 225 230 235CCA TGG TGC CAT ACA ACC AAC AGC CAA GTG CGG TGG GAG TAC TGT AAG 768Pro Trp Cys His Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys240 245 250ATA CCG TCC TGT GAC TCC TCC CCA GTA TCC ACG GAA CAA TTG GCT CCC 816Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro255 260 265ACA GCA CCA CCT GAG CTA ACC CCT GTG GTC CAG GAC TGC TAC CAT GGT 864Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly270 275 280GAT GGA CAG AGC TAC CGA GGC ACA TCC TCC ACC ACC ACC ACA GGA AAG 912Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys285 290 295AAG TGT CAG TCT TGG TCA TCT ATG ACA CCA CAC CGG CAC CAG AAG ACC 960Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr300 305 310 315CCA GAA AAC TAC CCA AAT GCT GGC CTG ACA ATG AAC TAC TGC AGG AAT 1008Pro Glu Asn Tyr Pro Ash Ala Gly Leu Thr Met Ash Tyr Cys Arg Asn320 325 330CCA GAT GCC GAT AAA GGC CCC TGG TGT TTT ACC ACA GAC TAG 1050Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp335 340GATCCAAGCT TGGG 1064
3．一種載體，其特征是該載體含有權(quán)利要求1或2所述的人血管生成抑制素基因。
4．按照權(quán)利要求3所述的載體，其特征是該載體為大腸桿菌表達(dá)載體。
5．按照權(quán)利要求4所述的載體，其特征是該載體為pBVA2。
6．按照權(quán)利要求3所述的載體，其特征是該載體為枯草桿菌、假絲酵母或漢生酵母表達(dá)載體。
7．由權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的能表達(dá)人血管生成抑制素的大腸桿菌。
8．按照權(quán)利要求7所述的大腸桿菌，其特征是它是由權(quán)利要求6的表達(dá)載體pBVA2轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中所形成的大腸桿菌重組株E.coli DH5α(pBVA2)即CCTCC M98014。
9．由權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的能表達(dá)人血管生成抑制素的枯草桿菌、假絲酵母或漢生酵母。
10．利用權(quán)利要求7的大腸桿菌生產(chǎn)人血管生成抑制素的方法，先將菌株培養(yǎng)發(fā)酵并經(jīng)熱誘導(dǎo)使其高效表達(dá)人血管生成抑制素重組蛋白，再收集菌體經(jīng)分離純化得到重組人血管生成抑制素產(chǎn)品。
11．按照權(quán)利要求10所述的方法，其特征是所用的大腸桿菌為CCTCC M98014。
12．按照權(quán)利要求11所述的方法，其特征是具體步驟為(1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵將菌種接種在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30-37℃，150-200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)種于相同培養(yǎng)基中，30-37℃，150-200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2-4小時(shí)，升溫至42℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)后收菌；(2)表達(dá)產(chǎn)物的純化收集上述培養(yǎng)的菌體，將細(xì)胞破碎后離心收集包含體沉淀，用含TritonX100和2M尿素的TE溶液反復(fù)洗滌沉淀，然后將沉淀溶于8M尿素中，用復(fù)性液復(fù)性并經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾層析，對水透析，經(jīng)凍干即為純化的重組人血管生成抑制素。
13．按照權(quán)利要求12所述的方法，其特征是其中的菌種培養(yǎng)發(fā)酵是采用15升發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。
14．將按照權(quán)利要求10至13之一所述的方法獲得的重組人血管生成抑制素用于制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以人纖溶酶原cDNA為模板,經(jīng)PCR方法合成人血管生成抑制素基因,并構(gòu)建了含有該基因的載體和重組菌株。特別是含有該基因的大腸桿菌表達(dá)載體pBVA2及其轉(zhuǎn)化的大腸桿菌重組株DH5α(pHVA2),和利用該菌株生產(chǎn)重組人血管生成抑制素的方法。該菌株具有表達(dá)量高,表達(dá)產(chǎn)物易純化等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明將為獲得來源穩(wěn)定價(jià)格便宜的重組人血管生成抑制素并用其制備新一代抗癌藥物提供一條切實(shí)可行的途徑。
文檔編號C12P21/00GK1224758SQ98113368
公開日1999年8月4日 申請日期1998年9月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月25日
發(fā)明者羅進(jìn)賢 申請人:中山大學(xué)