本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測、食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生、生命科學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像方法。

背景技術(shù)：

hg²⁺廢水污染物是構(gòu)成水環(huán)境污染的重要組成部分。排入水中的無極汞污染物不能被生物降解，而是參與食物鏈循環(huán)，可被微生物轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的有機(jī)汞，并在生物體內(nèi)大量富集后經(jīng)過食物鏈(尤其是魚類)進(jìn)入人體，嚴(yán)重威脅著人類的健康，可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及腦部的損害，此外，它可能還會(huì)破壞人體免疫系統(tǒng)，甚至導(dǎo)致死亡。因此，迫切需要建立一種快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確的hg²⁺檢測方法。

目前，hg²⁺的檢測方法主要包括：分光光度法、原子吸收/發(fā)射光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(icpms)、色譜法、光學(xué)及電化學(xué)法等，然而，相比于昂貴的儀器和試劑、繁雜的樣品預(yù)處理、耗時(shí)的檢測流程等，熒光探針法更適合于hg²⁺的檢測，不但能夠較好地滿足方便、經(jīng)濟(jì)、快捷地檢測要求，而且，還能夠?qū)ι矬w內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的hg²⁺實(shí)現(xiàn)原位、動(dòng)態(tài)的實(shí)時(shí)檢測，即實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的時(shí)空分辨。目前，國內(nèi)外對(duì)于生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光檢測與成像的研究并不多，現(xiàn)有技術(shù)主要采用傳統(tǒng)有限的熒光染料進(jìn)行成像研究，不但受到檢測條件如介質(zhì)、ph值的限制、共存物質(zhì)的干擾作用等，更重要的是，檢測與成像的靈敏度和選擇性均有待于提高。

近年來，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)及納米新材料的發(fā)展為hg²⁺的高靈敏、特異性生物傳感檢測技術(shù)提供了新的思路和有利條件，涌現(xiàn)出許多新技術(shù)、新方法。作為金納米粒子家族中的新生代，金納米籠一經(jīng)問世就引發(fā)了廣泛的關(guān)注和研究。該納米材料具有中空多孔的結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的納米顆粒相比，金納米籠的局域表面等離子共振峰位于近紅外區(qū)700～900nm，該波段對(duì)于生物醫(yī)學(xué)意義重大，尤其是對(duì)于細(xì)胞及活體研究。研究表明，包括hg²⁺在內(nèi)的多種金屬離子能夠特異性地和核苷酸“橋連”，使之形成穩(wěn)定的金屬離子-堿基對(duì)。其中，hg²⁺能夠和錯(cuò)配的dna堿基對(duì)t-t相互作用，形成穩(wěn)定的t-hg²⁺-t堿基對(duì)，這種特性已在生物傳感的設(shè)計(jì)與應(yīng)用方面顯示出巨大的潛力，為生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光檢測及共聚焦熒光顯微成像提供了新型、特異、高效的檢測平臺(tái)。采用表面正電荷修飾的金納米籠作為納米容器，利用富t單鏈dna與金納米籠表面的靜電作用構(gòu)建生物傳感器并將其用于生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，針對(duì)基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器用于生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像技術(shù)未見報(bào)道，因此，本發(fā)明的目的：提供一種采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以hg²⁺識(shí)別探針為分子門構(gòu)建而成的生物傳感器進(jìn)行生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像的方法，該方法所采用的生物傳感器具有設(shè)計(jì)巧妙、結(jié)構(gòu)簡單、性能穩(wěn)定、細(xì)胞毒性小、細(xì)胞膜滲透能力強(qiáng)、胞內(nèi)釋放可控性強(qiáng)、對(duì)hg²⁺選擇性好、在細(xì)胞內(nèi)分散性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，將其作為生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺成像的生物傳感器，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的檢測及成像。將本發(fā)明提出的熒光成像方法用于細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光顯微成像，能夠方便、快捷地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的高靈敏、高準(zhǔn)確度的熒光成像，具有選擇性好、響應(yīng)時(shí)間短、易于直接觀測、便于實(shí)時(shí)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，可在生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的檢測、成像方面發(fā)揮重要作用，為生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用提供新的方法和技術(shù)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的的。本發(fā)明所采用的生物傳感器是以金納米籠作為納米載體，利用其空心多孔的結(jié)構(gòu)特性，在其內(nèi)部裝載客體分子如熒光分子羅丹明b，為了防止熒光分子的外泄，通過靜電作用在其表面組裝具有可生物相應(yīng)的分子門；其中，所述的可生物相應(yīng)的分子門是將hg²⁺識(shí)別探針，即富t單鏈dna通過靜電作用組裝到金納米籠表面構(gòu)建而成，具體可以通過在金納米籠表面修飾一層聚陽離子的方法而將富t單鏈dna組裝到金納米籠表面，優(yōu)選地采用聚二烯丙基二甲基氯化銨作為正電荷修飾劑。

優(yōu)選地，所述的金納米籠內(nèi)部裝載的熒光分子可以是羅丹明b。

一種采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以富t單鏈dna為分子門構(gòu)建而成的生物傳感器進(jìn)行生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像的方法，包括如下步驟：

(1)取適量hela細(xì)胞，以2000～3000轉(zhuǎn)/min下離心5～10min，移除上清液；

(2)加入制備好的基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器，37℃恒溫孵育10～30min后進(jìn)行激光共聚焦掃描成像實(shí)驗(yàn)；

所述的基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器的制備方法，包括如下步驟：

(1)將聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液加入到金納米籠的懸浮液中，室溫振蕩過夜；

(2)離心分離上述溶液后，將羅丹明b溶液加入到體系中，室溫振蕩過夜；

(3)將富t單鏈dna溶液加入到上述溶液中，室溫振蕩過夜，離心分離，即制得基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器；

所述的金納米籠按文獻(xiàn)方法獲得(g.d.moon,s.w.choi,x.cai,w.y.li,e.c.cho,u.jeong,l.v.wangandy.n.xia.j.am.chem.soc.2011,133,4762–4765)。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提出的一種采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以富t單鏈dna為分子門構(gòu)建而成的生物傳感器進(jìn)行生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像的方法，不但能夠方便、快捷地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的高靈敏、高準(zhǔn)確度的熒光成像，同時(shí)還具有選擇性好、響應(yīng)時(shí)間短、易于直接觀測、便于實(shí)時(shí)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，可在生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺成像檢測及應(yīng)用方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)也為細(xì)胞熒光成像的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用提供新的方法和技術(shù)。本發(fā)明所采用的基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器具有設(shè)計(jì)巧妙、結(jié)構(gòu)簡單的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)hg²⁺選擇性好、細(xì)胞毒性小、細(xì)胞膜滲透能力強(qiáng)、胞內(nèi)釋放可控性強(qiáng)、在細(xì)胞內(nèi)的分散性好，作為活細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像的生物傳感器，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的特異性成像檢測。該成像方法在環(huán)境檢測、食品衛(wèi)生、生命科學(xué)等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1采用基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器得到的細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的共聚焦熒光顯微成像照片。

具體實(shí)施方式

以下是本發(fā)明涉及的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

下面通過實(shí)施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限定。

實(shí)驗(yàn)儀器：thz-82a氣浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療器械廠)；kdc-160hr高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；leicatcssp5ii激光共聚焦掃描儀(德國萊卡公司)。

實(shí)驗(yàn)試劑：羅丹明b(上海阿拉丁試劑有限公司)；聚二烯丙基二甲基氯化銨(美國sigma-aldrich公司)；富t單鏈dna堿基序列：3’-tttgtttgttggccccccttctttctta-5’(上海生工生物工程股份有限公司)，pbs溶液為0.01m(ph7.4,na2hpo4-nah2po4)。

實(shí)施例1：

一種采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以富t單鏈dna為分子門構(gòu)建而成的生物傳感器進(jìn)行生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像方法，包括如下步驟：

(1)取適量hela細(xì)胞懸浮液，以2500轉(zhuǎn)/min下離心10min，移除上清液；

(2)在細(xì)胞中加入hg²⁺溶液，孵育溫度37℃，30min后離心，移除上清液；

(3)加入制備好的生物傳感器的pbs溶液，37℃恒溫孵育30min后進(jìn)行激光共聚焦掃描成像實(shí)驗(yàn)；

(4)將孵育好的細(xì)胞置于共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上，激發(fā)波長：559nm；接收波長：580-630nm。

得到的hela細(xì)胞的熒光成像照片如圖1所示。

實(shí)施例2:

實(shí)施例1中所述的基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器的制備方法，包括如下步驟：

(1)將200μl濃度11.664mg/ml的聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液加入到400μl金納米籠的懸浮液中，室溫振蕩過夜；

(2)離心分離上述溶液后，將100μl濃度1.0×10^-5mol/l的羅丹明b溶液加入到體系中，室溫振蕩過夜；

(3)將10μl濃度1.0×10^-5m的富t單鏈dna溶液加入到上述溶液中，室溫振蕩過夜，離心分離，即制得基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器；

所述的金納米籠按文獻(xiàn)方法獲得(g.d.moon,s.w.choi,x.cai,w.y.li,e.c.cho,u.jeong,l.v.wangandy.n.xia.j.am.chem.soc.2011,133,4762–4765)。

本發(fā)明將納米技術(shù)、分子生物技術(shù)與細(xì)胞成像技術(shù)相結(jié)合，通過特異性的分子識(shí)別反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的高靈敏、高選擇性的熒光成像。本發(fā)明提出的熒光成像的方法采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以富t單鏈dna為分子門構(gòu)建而成的生物傳感器進(jìn)行生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像。將該生物傳感器與細(xì)胞進(jìn)行孵育后，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用，即可使生物傳感器進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)如果有hg²⁺存在，則會(huì)發(fā)生hg²⁺與富t單鏈dna之間的特異性分子識(shí)別反應(yīng)，即在t-hg²⁺-t的配位作用下，富t單鏈dna轉(zhuǎn)變成類似發(fā)卡型的雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致富t單鏈dna從金納米籠表面脫離，使封堵籠孔的分子門被打開，孔內(nèi)的熒光分子羅丹明b被釋放出來，實(shí)現(xiàn)熒光分子在細(xì)胞內(nèi)的可控釋放。因此，利用該生物傳感器，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的高靈敏、高選擇性的熒光成像檢測。

本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)hg²⁺的熒光成像方法具有選擇性好、可控性強(qiáng)、響應(yīng)時(shí)間短、易于直接觀測、便于實(shí)時(shí)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明所采用的生物傳感器與傳統(tǒng)的熒光染料成像技術(shù)相比，具有對(duì)hg²⁺選擇性好、細(xì)胞毒性小、細(xì)胞膜滲透能力強(qiáng)、胞內(nèi)釋放可控性強(qiáng)、在細(xì)胞內(nèi)的分散性好等諸多優(yōu)點(diǎn)。該成像方法在環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生、生命科學(xué)等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

序列表

sequencelisting

<110>青島科技大學(xué)

<120>一種細(xì)胞內(nèi)hg2+的熒光成像方法

<160>1

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

attctttcttccccccggttgtttgttt28