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一種水解膠原蛋白粉多肽分子量的快速測定方法與流程

文檔序號:11515798閱讀:828來源:國知局

本發(fā)明屬于多肽分子量測定技術(shù)領(lǐng)域,具體來講是一種水解膠原蛋白粉多肽分子量的快速測定方法。



背景技術(shù):

多肽是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物,它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物,由兩個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽,同理類推還有三肽、四肽、五肽等。通常由三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物都可以成為叫多肽。在高二選修有機(jī)化學(xué)基礎(chǔ)中有對多肽的明確定義。

一般肽中含有的氨基酸的數(shù)目為二到九,根據(jù)肽中氨基酸的數(shù)量的不同,肽有多種不同的稱呼:由兩個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽,同理類推還有三肽、四肽、五肽等,一直到九肽。通常由10-100氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫多肽,它們的分子量低于10,000da(dalton,道爾頓),能透過半透膜,不被三氯乙酸及硫酸銨所沉淀。也有文獻(xiàn)把由2-10個(gè)氨基酸組成的肽稱為寡肽(小分子肽);10-50個(gè)氨基酸組成的肽稱為多肽;由50個(gè)以上的氨基酸組成的肽就稱為蛋白質(zhì),換言之,蛋白質(zhì)有時(shí)也被稱為多肽。多肽也簡稱為肽,是20世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)的。

分子量是蛋白質(zhì)主要的特征參數(shù)之一,近年來其測試方法發(fā)展十分迅速。目前蛋白質(zhì)分子量測定中最常用的幾種方法,包括粘度法、凝膠過濾層析法、凝膠滲透色譜法、sds-凝膠電泳法、滲透壓法、電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)、光散射法、超速離心沉降法。常用的方法為凝膠過濾法和sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法:凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大?。坏鞍踪|(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子的大小、分子形狀和所帶電荷的多少,遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)所測樣品的相對遷移率,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出其分子質(zhì)量。然后以上方法對多肽分子量的測定過程復(fù)雜,影響因素較多,因此能快速的測定多肽分子量且能得到準(zhǔn)確的結(jié)果是目前科研工作者研究的難題之一。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種水解膠原蛋白粉多肽分子量的快速測定方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種水解膠原蛋白粉多肽分子量的快速測定方法,所述的測定方法主要包括以下步驟:

(1)將水解膠原蛋白粉和超純水按照1:5的體積比混合,攪拌30min,然后在5-10℃下,10000~12000r/min條件下離心1h,取出上清液,將上清液使用uf膜進(jìn)行超濾濃縮,濃縮前后的體積比為5:1-2,將超濾濃縮后的粉濃縮液通過使用緩沖液經(jīng)離子交換層析進(jìn)行復(fù)溶,得到的復(fù)溶液經(jīng)含sephadexg-100凝膠色譜柱,以0.3-0.5ml/min流速進(jìn)行分離純化,檢測波長為280nm,收集檢測器上顯示的各個(gè)峰的峰值管,洗脫,在5-10℃下收集洗脫液在在真空環(huán)境下濃縮,濃縮前后體積比為5:1,然后進(jìn)行噴霧干燥,得到分離純化的多肽,備用;

(2)將步驟(1)分離純化的多肽使用水解的酶解液混合溶解,攪拌后得到混合溶液,使用固形物含量檢測儀檢測混合溶液中的固形物含量,繼續(xù)添加酶解液并攪拌使混合溶液中固形物含量為3%并過濾,得到澄清的過濾液,將一部分澄清的過濾液備用,在另外一部分澄清過濾液中加入質(zhì)量濃度為40%三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最終濃度為15%,混和均勻后,在常溫、轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm條件下離心15min,然后在300nm條件下進(jìn)行透光率檢測,與所述的未經(jīng)過三氯乙酸處理的澄清過濾液作對比,使用分光光度計(jì)檢測透光率所占比例,從而判定得到的分離純化的多肽含量;

(3)采用水溶性體積排阻色譜柱,將緩沖液作為流動(dòng)相,以0.8-1.4ml/min的流速,在合適的色譜檢測條件下,對從步驟(1)得到的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品測定,建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜,并由標(biāo)準(zhǔn)圖譜中分子的保留時(shí)間與分子量對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系,所述的線性關(guān)系為:y=-0.525x+8.2036,其中x為多肽在色譜柱中的保留時(shí)間y為多肽的分子量的相對數(shù)值,實(shí)現(xiàn)對多肽的分子量測算,同時(shí)利用所述色譜檢測條件對水解膠原蛋白粉樣品進(jìn)行檢測,并依據(jù)檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)圖譜的對比,來快速檢測出多肽分子量。

進(jìn)一步的,所述的步驟(1)中的緩沖液為0.05mol/lph7-7.5的tris-硼酸平衡緩沖液。

進(jìn)一步的,所述的步驟(3)中的色譜檢測條件為:溫度為15-30℃,采用ph值為6.0-7.0的,濃度為100-200mm的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相,且流速為0.8-1.2ml/min,檢測波長范圍設(shè)于260-300nm。

進(jìn)一步的,所述的步驟(2)中的酶解液制備方法為:將洗凈、粉碎的魚鱗、蒸餾水、蛋白酶按照5:1000:3的質(zhì)量比置入反應(yīng)器中,攪拌5-10min后,調(diào)節(jié)ph值為6-7,加熱升溫,反應(yīng)溫度在60-70℃酶解3-5h,酶解結(jié)束后升溫至90-100℃滅酶5-10min,滅酶結(jié)束后降溫至30-40℃,室溫下靜置30-60min,60目篩網(wǎng)過濾,濾除殘?jiān)?,收集濾液即為所述的酶解液。

進(jìn)一步的,所述的多肽的分子量的對數(shù)值y與小分子多肽在色譜柱中的保留時(shí)間x之間的線性關(guān)系中相關(guān)系數(shù)r2=0.8657。

進(jìn)一步的,所述的水溶性體積排阻色譜柱優(yōu)選為美國-srt體積排阻色譜柱,ph范圍2-8.5。

與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的友誼效果體現(xiàn)在:本發(fā)明的多肽分子量的快速測定方法通過將水解膠原蛋白粉的多肽分離純化:將水解膠原蛋白粉通過攪拌、離心、超濾濃縮,再用離子交換層析復(fù)溶,通過凝膠色譜柱,得到分離純化的多肽,將多肽使用水解的酶解液混合溶解,進(jìn)行透光率檢測,從而判定得到的分離純化的多肽含量,采用標(biāo)準(zhǔn)圖譜中分子的保留時(shí)間與分子量對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系,利用粉樣品檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的對比,來快速檢測出多肽分子量。本發(fā)明的測定方法設(shè)計(jì)合理,科學(xué)嚴(yán)密,易于操作,準(zhǔn)確性高。

附圖說明

圖1為分子量矯正曲線

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1:一種水解膠原蛋白粉多肽分子量的快速測定方法,所述的測定方法主要包括以下步驟:

(1)將水解膠原蛋白粉和超純水按照1:5的體積比混合,攪拌30min,然后在5℃下,10000r/min條件下離心1h,取出上清液,將上清液使用uf膜進(jìn)行超濾濃縮,濃縮前后的體積比為5:1,將超濾濃縮后的粉濃縮液通過使用緩沖液經(jīng)離子交換層析進(jìn)行復(fù)溶,得到的復(fù)溶液經(jīng)含sephadexg-100凝膠色譜柱,以0.3ml/min流速進(jìn)行分離純化,檢測波長為280nm,收集檢測器上顯示的各個(gè)峰的峰值管,洗脫,在5℃下收集洗脫液在在真空環(huán)境下濃縮,濃縮前后體積比為5:1,然后進(jìn)行噴霧干燥,得到分離純化的多肽,備用;

(2)將步驟(1)分離純化的多肽使用水解的酶解液混合溶解,攪拌后得到混合溶液,使用固形物含量檢測儀檢測混合溶液中的固形物含量,繼續(xù)添加酶解液并攪拌使混合溶液中固形物含量為3%并過濾,得到澄清的過濾液,將一部分澄清的過濾液備用,在另外一部分澄清過濾液中加入質(zhì)量濃度為40%三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最終濃度為15%,混和均勻后,在常溫、轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm條件下離心15min,然后在300nm條件下進(jìn)行透光率檢測,與所述的未經(jīng)過三氯乙酸處理的澄清過濾液作對比,使用分光光度計(jì)檢測透光率所占比例,從而判定得到的分離純化的多肽含量;

(3)采用水溶性體積排阻色譜柱,將緩沖液作為流動(dòng)相,以0.8ml/min的流速,在合適的色譜檢測條件下,對從步驟(1)得到的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品測定,建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜,并由標(biāo)準(zhǔn)圖譜中分子的保留時(shí)間與分子量對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系,所述的線性關(guān)系為:y=-0.525x+8.2036,其中x為多肽在色譜柱中的保留時(shí)間y為多肽的分子量的相對數(shù)值,實(shí)現(xiàn)對多肽的分子量測算,同時(shí)利用所述色譜檢測條件對水解膠原蛋白粉樣品進(jìn)行檢測,并依據(jù)檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)圖譜的對比,來快速檢測出多肽分子量。

其中,所述的步驟(1)中的緩沖液為0.05mol/lph7的tris-硼酸平衡緩沖液。所述的步驟(3)中的色譜檢測條件為:溫度為15℃,采用ph值為6.0的,濃度為100mm的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相,且流速為0.8ml/min,檢測波長范圍設(shè)于260nm。所述的步驟(2)中的酶解液制備方法為:將洗凈、粉碎的魚鱗、蒸餾水、蛋白酶按照5:1000:3的質(zhì)量比置入反應(yīng)器中,攪拌5min后,調(diào)節(jié)ph值為6,加熱升溫,反應(yīng)溫度在60℃酶解3h,酶解結(jié)束后升溫至90℃滅酶5min,滅酶結(jié)束后降溫至30℃,室溫下靜置30min,60目篩網(wǎng)過濾,濾除殘?jiān)?,收集濾液即為所述的酶解液。所述的多肽的分子量的對數(shù)值y與小分子多肽在色譜柱中的保留時(shí)間x之間的線性關(guān)系中相關(guān)系數(shù)r2=0.8657。所述的水溶性體積排阻色譜柱優(yōu)選為美國-srt體積排阻色譜柱。

實(shí)施例2:一種水解膠原蛋白粉多肽分子量的快速測定方法,所述的測定方法主要包括以下步驟:

(1)將水解膠原蛋白粉和超純水按照1:5的體積比混合,攪拌30min,然后在7.5℃下,11000r/min條件下離心1h,取出上清液,將上清液使用uf膜進(jìn)行超濾濃縮,濃縮前后的體積比為5:1.5,將超濾濃縮后的粉濃縮液通過使用緩沖液經(jīng)離子交換層析進(jìn)行復(fù)溶,得到的復(fù)溶液經(jīng)含sephadexg-100凝膠色譜柱,以0.4ml/min流速進(jìn)行分離純化,檢測波長為280nm,收集檢測器上顯示的各個(gè)峰的峰值管,洗脫,在7.5℃下收集洗脫液在在真空環(huán)境下濃縮,濃縮前后體積比為5:1,然后進(jìn)行噴霧干燥,得到分離純化的多肽,備用;

(2)將步驟(1)分離純化的多肽使用水解的酶解液混合溶解,攪拌后得到混合溶液,使用固形物含量檢測儀檢測混合溶液中的固形物含量,繼續(xù)添加酶解液并攪拌使混合溶液中固形物含量為3%并過濾,得到澄清的過濾液,將一部分澄清的過濾液備用,在另外一部分澄清過濾液中加入質(zhì)量濃度為40%三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最終濃度為15%,混和均勻后,在常溫、轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm條件下離心15min,然后在300nm條件下進(jìn)行透光率檢測,與所述的未經(jīng)過三氯乙酸處理的澄清過濾液作對比,使用分光光度計(jì)檢測透光率所占比例,從而判定得到的分離純化的多肽含量;

(3)采用水溶性體積排阻色譜柱,將緩沖液作為流動(dòng)相,以1.1ml/min的流速,在合適的色譜檢測條件下,對從步驟(1)得到的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品測定,建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜,并由標(biāo)準(zhǔn)圖譜中分子的保留時(shí)間與分子量對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系,所述的線性關(guān)系為:y=-0.525x+8.2036,其中x為多肽在色譜柱中的保留時(shí)間y為多肽的分子量的相對數(shù)值,實(shí)現(xiàn)對多肽的分子量測算,同時(shí)利用所述色譜檢測條件對水解膠原蛋白粉樣品進(jìn)行檢測,并依據(jù)檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)圖譜的對比,來快速檢測出多肽分子量。

其中,所述的步驟(1)中的緩沖液為0.05mol/lph7.25的tris-硼酸平衡緩沖液。所述的步驟(3)中的色譜檢測條件為:溫度為22.5℃,采用ph值為6.5的,濃度為150mm的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相,且流速為1ml/min,檢測波長范圍設(shè)于280nm。所述的步驟(2)中的酶解液制備方法為:將洗凈、粉碎的魚鱗、蒸餾水、蛋白酶按照5:1000:3的質(zhì)量比置入反應(yīng)器中,攪拌7.5min后,調(diào)節(jié)ph值為6.5,加熱升溫,反應(yīng)溫度在65℃酶解4h,酶解結(jié)束后升溫至95℃滅酶7.5min,滅酶結(jié)束后降溫至35℃,室溫下靜置45min,60目篩網(wǎng)過濾,濾除殘?jiān)?,收集濾液即為所述的酶解液。所述的多肽的分子量的對數(shù)值y與小分子多肽在色譜柱中的保留時(shí)間x之間的線性關(guān)系中相關(guān)系數(shù)r2=0.8657。所述的水溶性體積排阻色譜柱優(yōu)選為美國-srt體積排阻色譜柱。

實(shí)施例3:一種水解膠原蛋白粉多肽分子量的快速測定方法,所述的測定方法主要包括以下步驟:

(1)將水解膠原蛋白粉和超純水按照1:5的體積比混合,攪拌30min,然后在10℃下,12000r/min條件下離心1h,取出上清液,將上清液使用uf膜進(jìn)行超濾濃縮,濃縮前后的體積比為5:2,將超濾濃縮后的粉濃縮液通過使用緩沖液經(jīng)離子交換層析進(jìn)行復(fù)溶,得到的復(fù)溶液經(jīng)含sephadexg-100凝膠色譜柱,以0.5ml/min流速進(jìn)行分離純化,檢測波長為280nm,收集檢測器上顯示的各個(gè)峰的峰值管,洗脫,在10℃下收集洗脫液在在真空環(huán)境下濃縮,濃縮前后體積比為5:1,然后進(jìn)行噴霧干燥,得到分離純化的多肽,備用;

(2)將步驟(1)分離純化的多肽使用水解的酶解液混合溶解,攪拌后得到混合溶液,使用固形物含量檢測儀檢測混合溶液中的固形物含量,繼續(xù)添加酶解液并攪拌使混合溶液中固形物含量為3%并過濾,得到澄清的過濾液,將一部分澄清的過濾液備用,在另外一部分澄清過濾液中加入質(zhì)量濃度為40%三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最終濃度為15%,混和均勻后,在常溫、轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm條件下離心15min,然后在300nm條件下進(jìn)行透光率檢測,與所述的未經(jīng)過三氯乙酸處理的澄清過濾液作對比,使用分光光度計(jì)檢測透光率所占比例,從而判定得到的分離純化的多肽含量;

(3)采用水溶性體積排阻色譜柱,將緩沖液作為流動(dòng)相,以1.4ml/min的流速,在合適的色譜檢測條件下,對從步驟(1)得到的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品測定,建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜,并由標(biāo)準(zhǔn)圖譜中分子的保留時(shí)間與分子量對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系,所述的線性關(guān)系為:y=-0.525x+8.2036,其中x為多肽在色譜柱中的保留時(shí)間y為多肽的分子量的相對數(shù)值,實(shí)現(xiàn)對多肽的分子量測算,同時(shí)利用所述色譜檢測條件對水解膠原蛋白粉樣品進(jìn)行檢測,并依據(jù)檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)圖譜的對比,來快速檢測出多肽分子量。

其中,所述的步驟(1)中的緩沖液為0.05mol/lph7.5的tris-硼酸平衡緩沖液。所述的步驟(3)中的色譜檢測條件為:溫度為30℃,采用ph值為7.0的,濃度為200mm的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相,且流速為1.2ml/min,檢測波長范圍設(shè)于300nm。所述的步驟(2)中的酶解液制備方法為:將洗凈、粉碎的魚鱗、蒸餾水、蛋白酶按照5:1000:3的質(zhì)量比置入反應(yīng)器中,攪拌10min后,調(diào)節(jié)ph值為7,加熱升溫,反應(yīng)溫度在70℃酶解5h,酶解結(jié)束后升溫至100℃滅酶10min,滅酶結(jié)束后降溫至40℃,室溫下靜置60min,60目篩網(wǎng)過濾,濾除殘?jiān)?,收集濾液即為所述的酶解液。所述的多肽的分子量的對數(shù)值y與小分子多肽在色譜柱中的保留時(shí)間x之間的線性關(guān)系中相關(guān)系數(shù)r2=0.8657。所述的水溶性體積排阻色譜柱優(yōu)選為美國-srt體積排阻色譜柱。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證:分別采用實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3所述的水解膠原蛋白粉多肽分子量的測定方法,采用水溶性體積排阻色譜柱,在色譜檢測條件下,試用三種方法對多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測定,建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜,并由標(biāo)準(zhǔn)圖譜中分子的保留時(shí)間與分子量對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系,所述的線性關(guān)系為:y=-0.525x+8.2036,其中x為多肽在色譜柱中的保留時(shí)間y為多肽的分子量的相對數(shù)值,如圖1所示,從中選擇時(shí)間為5、8、10分鐘實(shí)現(xiàn)對多肽的分子量測算,同時(shí)利用所述色譜檢測條件對水解膠原蛋白粉樣品進(jìn)行檢測,并依據(jù)檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)圖譜的對比,來快速檢測出多肽分子量。

以上所述,僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并非是對本發(fā)明作其它形式的限制,任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容,依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型,仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。

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