本發(fā)明涉及表面等離子共振譜儀抗污染芯片制備領(lǐng)域，特別是涉及一種基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法。

背景技術(shù)：

表面等離子共振(surfaceplasmonresonance，簡稱spr)儀是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種生物傳感器技術(shù)，當(dāng)入射光從高折射率介質(zhì)入射到低折射率介質(zhì)時，會發(fā)生全反射，此時若在介質(zhì)交界面處鍍一層金屬薄膜(金或銀)，入射光產(chǎn)生的漸逝波會引起金屬表面自由電子發(fā)生集體振蕩，進而形成等離子體，當(dāng)漸逝波與表面等離子體振蕩的頻率和波數(shù)相等時，即產(chǎn)生共振現(xiàn)象(spr)，導(dǎo)致能量從漸逝波轉(zhuǎn)移到表面等離子波中，使反射光的強度大大減弱，呈現(xiàn)衰減全反射現(xiàn)象，當(dāng)反射光的強度為零時的入射角稱為共振角。共振角與金屬薄膜界面介質(zhì)折射率有關(guān)，而折射率又隨結(jié)合在金屬薄膜表面的分子質(zhì)量而變化，故可通過分析共振角來獲得分子間相互作用的信息，由于其具有檢測快速且無需標(biāo)記等特點，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物研發(fā)、臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，并且顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

spr芯片是表面等離子共振儀最為核心的組件，提供產(chǎn)生spr信號的必須物理條件，主要包括耦合器件、金屬膜和表面基質(zhì)。然而，應(yīng)用表面等離子共振儀進行分析測試時，傳感芯片的表面污染是一個普遍存在的問題，來自樣品中的生物分子或微生物的非特異性吸附將降低定量檢測的準(zhǔn)確性，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，開發(fā)有效抵抗非特異性吸附的表面是提高表面等離子共振傳感器靈敏度和精確度的首要問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸的表面等離子共振儀芯片的制備方法，包括以下步驟：

a)裸金芯片制備

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在基底上涂覆一層2-3nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層45-50nm厚的金膜，得到裸金芯片；

b)裸金芯片預(yù)處理

將步驟a)獲得的裸金芯片浸入食人魚洗液中，常溫下浸泡1-3h，取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干；

c)兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體的合成

將24.98mmol半胱氨酸用20ml去離子水溶解后，向其中加入27.47mmol2-丙烯酸-2-羥基-1,3-丙二酯以及29.4μmol二甲苯基磷，于20-30℃下攪拌反應(yīng)2-4h，反應(yīng)后的溶液用乙酸乙酯萃取一次，二氯甲烷萃取兩次，凍干后得到白色粉末狀的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體；

d)裸金芯片表面多巴胺聚合

用ph＝8.5的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制1-3mg/ml多巴胺溶液，將b)步驟得到的裸金芯片浸入其中，于40-60℃下孵育1-2h，取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干；

e)聚多巴胺芯片表面溴代異丁酰溴引發(fā)劑修飾

將d)步驟得到的芯片的基底浸入20ml含有1.0ml三乙胺的二氯甲烷中，在冰浴且攪拌條件下逐滴加入10ml含有0.9ml溴代異丁酰溴的二氯甲烷，室溫下攪拌反應(yīng)12-24h，取出用乙醇和去離子水依次清洗3次后用氮氣吹干；

f)裸金芯片表面聚甲基丙烯基半胱氨酸合成

將e)步驟得到的芯片放入預(yù)先三次循環(huán)脫氣并充氮氣的施倫克瓶中；將c)步驟得到的5mmol單體溶解于4ml去離子水中，用氮氣脫氣10-30min，向其中加入0.5mmol聯(lián)吡啶、0.167mmol溴化亞銅和0.083mmol溴化銅，用氮氣脫氣10-30min后用超聲處理5-10min，將得到的溶液移入施倫克瓶，使得溶液將瓶中的芯片浸沒，于氮氣條件下反應(yīng)2-4h后取出芯片，用乙醇和去離子水依次清洗3次后用氮氣吹干。

而且，上述的基底為玻璃片基底或光纖基底。

而且，上述的金膜還可為銀膜或銀/金符合膜。

而且，上述的食人魚洗液為98wt.％濃硫酸與30wt.％雙氧水的混合溶液，濃硫酸與雙氧水的體積比為7:3。

本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果是：

1)本發(fā)明制備的基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片具有很好的抗污染性能；

2)本發(fā)明制備的基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片具有生物功能化作用，如可通過固載羊免疫球蛋白抗體進而檢測其抗原；

3)本發(fā)明制備的基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片具有高的穩(wěn)定性，在干燥狀態(tài)下儲存1個月或在ph為7.4的磷酸鹽緩沖液中儲存7天后，抗污染性能無變化；

4)本發(fā)明基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法具有一定的普適性，不受基底材料性質(zhì)的限制。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2a為本發(fā)明基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片對單一蛋白體系(1mg/ml的溶菌酶(lysozyme)、牛血清蛋白(bsa)、纖維蛋白原(fibrinogen))中蛋白的非特異性吸附量；

圖2b為本發(fā)明基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片對復(fù)雜體系(100％人血清(bloodserum)、豆?jié){(soybeanmilk)、牛奶(cowmilk))中蛋白的非特異性吸附量；

其中：

1、玻璃片基底；2、鉻層；3、金膜層；4、聚多巴胺耦合引發(fā)劑層；5、兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸層。

具體實施方式

本發(fā)明通過以下實施例進一步詳述。需要說明的是：下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在bk7玻璃基底上涂覆一層2nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層48nm厚的金膜，得到裸金芯片；將上述裸金芯片浸入98％濃硫酸與30％雙氧水的混合溶液中，98％濃硫酸與30％雙氧水的體積比為7:3，于常溫下浸泡2h。然后取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干備用。

將24.98mmol半胱氨酸用20ml去離子水溶解后，向其中加入27.47mmol2-丙烯酸-2-羥基-1,3-丙二酯以及29.4μmol二甲苯基磷，于20℃下攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)后的溶液用乙酸乙酯萃取一次，二氯甲烷萃取兩次，凍干后得到白色粉末狀的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體；

用ph＝8.5的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制2mg/ml多巴胺溶液，將上述吹干備用的裸金芯片浸入其中，于40℃下孵育2h，取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干；將修飾有聚多巴胺的基底浸入包含有1.0ml三乙胺的20ml二氯甲烷中，在冰浴且攪拌條件下逐滴加入10ml包含有0.9ml溴代異丁酰溴的二氯甲烷，然后在室溫下攪拌條件反應(yīng)24h，取出用乙醇和去離子水依次清洗3次后用氮氣吹干，將得到的芯片放入預(yù)先三次循環(huán)脫氣充氮氣的施倫克瓶中，取上述凍干后得到的白色粉末狀兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體5mmol溶解于4ml去離子水中，用氮氣脫氣15min，向其中加入0.5mmol聯(lián)吡啶、0.167mmol溴化亞銅和0.083mmol溴化銅，再用氮氣脫氣10min，后用超聲處理5min，將得到的將溶液移入施倫克瓶中并將芯片浸沒，于氮氣條件下反應(yīng)2h后取出芯片，依次用乙醇和去離子水各清洗3次，用氮氣吹干備用。

將上述獲得的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上，以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，選擇流速為10μl/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中分別注入100μl1mg/ml的蛋白溶液：牛血清白蛋白、溶菌酶、纖維蛋白原、100％血清、豆?jié){上清液和牛奶上清液，經(jīng)流動相推動上述各蛋白溶液到達芯片表面，由表面等離子共振系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線，20min后讀取表面等離子共振角變化值，并計算非特異性吸附量，分別為1.40ng/cm²、0.81ng/cm²、1.89ng/cm²、12.81ng/cm²、6.08ng/cm²、7.15ng/cm²，其蛋白吸附量遠低于裸金表面各蛋白的非特異性吸附量。

實施例2

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在bk7玻璃基底上涂覆一層3nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層47nm厚的金膜，得到裸金芯片；將上述裸金芯片浸入98％濃硫酸與30％雙氧水的混合溶液中，98％濃硫酸與30％雙氧水的體積比為7:3，于常溫下浸泡1h。然后取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干備用。

將24.98mmol半胱氨酸用20ml去離子水溶解后，向其中加入27.47mmol2-丙烯酸-2-羥基-1,3-丙二酯以及29.4μmol二甲苯基磷，于30℃下攪拌反應(yīng)2h，反應(yīng)后的溶液用乙酸乙酯萃取一次，二氯甲烷萃取兩次，凍干后得到白色粉末狀的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體；

用ph＝8.5的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制3mg/ml多巴胺溶液，將上述吹干備用的裸金芯片浸入其中，于60℃下孵育1h，取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干；將修飾有聚多巴胺的基底浸入包含有1.0ml三乙胺的20ml二氯甲烷中，在冰浴且攪拌條件下逐滴加入10ml包含有0.9ml溴代異丁酰溴的二氯甲烷，然后在室溫下攪拌條件反應(yīng)18h，取出用乙醇和去離子水依次清洗3次后用氮氣吹干，將得到的芯片放入預(yù)先三次循環(huán)脫氣充氮氣的施倫克瓶中，取上述凍干后得到的白色粉末狀兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體5mmol溶解于4ml去離子水中，用氮氣脫氣20min，向其中加入0.5mmol聯(lián)吡啶、0.167mmol溴化亞銅和0.083mmol溴化銅，再用氮氣脫氣20min，后用超聲處理10min，將得到的溶液移入施倫克瓶中并將芯片浸沒，于氮氣條件下反應(yīng)3h后取出芯片，依次用乙醇和去離子水各清洗3次，用氮氣吹干備用。

將上述獲得的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上，以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，選擇流速為10μl/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中分別注入100μl1mg/ml的蛋白溶液：牛血清白蛋白、溶菌酶、纖維蛋白原、100％血清、豆?jié){上清液和牛奶上清液，經(jīng)流動相推動上述各蛋白溶液到達芯片表面，由表面等離子共振系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線，20min后讀取表面等離子共振角變化值，并計算非特異性吸附量，分別為1.95ng/cm²、1.02ng/cm²、2.20ng/cm²、14.25ng/cm²、6.95ng/cm²、9.05ng/cm²，其蛋白吸附量遠低于裸金表面各蛋白的非特異性吸附量。

實施例3

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在bk7玻璃基底上涂覆一層2nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層48nm厚的金膜，得到裸金芯片；將上述裸金芯片浸入98％濃硫酸與30％雙氧水(體積比7:3)的混合溶液中，98％濃硫酸與30％雙氧水的體積比為7:3，于常溫下浸泡2h。然后取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干備用。

將24.98mmol半胱氨酸用20ml去離子水溶解后，向其中加入27.47mmol2-丙烯酸-2-羥基-1,3-丙二酯以及29.4μmol二甲苯基磷，于20℃下攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)后的溶液用乙酸乙酯萃取一次，二氯甲烷萃取兩次，凍干后得到白色粉末狀的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體；

用ph＝8.5的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制2mg/ml多巴胺溶液，將上述吹干備用的裸金芯片浸入其中，于40℃下孵育2h，取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干；將修飾有聚多巴胺的基底浸入包含有1.0ml三乙胺的20ml二氯甲烷中，在冰浴且攪拌條件下逐滴加入10ml包含有0.9ml溴代異丁酰溴的二氯甲烷，然后在室溫下攪拌條件反應(yīng)24h，取出用乙醇和去離子水依次清洗3次后用氮氣吹干，將得到的芯片放入預(yù)先三次循環(huán)脫氣充氮氣的施倫克瓶中，取上述凍干后得到的白色粉末狀兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體5mmol溶解于4ml去離子水中，用氮氣脫氣15min，向其中加入0.5mmol聯(lián)吡啶、0.167mmol溴化亞銅和0.083mmol溴化銅，再用氮氣脫氣10min，后用超聲處理5min，將得到的將溶液移入施倫克瓶中并將芯片浸沒，于氮氣條件下反應(yīng)2h后取出芯片，依次用乙醇和去離子水各清洗3次，用氮氣吹干備用。

將上述獲得的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上，以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，選擇流速為10μl/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中內(nèi)注入100μl1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(edc，濃度為0.4m)和n-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhs，濃度為0.1m)的混合溶液，經(jīng)流動相推動上述混合溶液到達芯片表面。15min后注入100μl羊免疫球蛋白(anti-igg，1mg/ml)溶液，經(jīng)流動相推動羊免疫球蛋白溶液到達芯片表面，再經(jīng)乙醇胺封閉，30min后獲得固載羊免疫球蛋白的表面等離子共振傳感芯片。

將上述獲得的固載羊免疫球蛋白的表面等離子共振傳感芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上。以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，選擇流速為10μl/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中分別注入100μl蛋白溶液：溶菌酶(1mg/ml)、豆?jié){(10mg/ml)、牛奶(30mg/ml)和100％血清，經(jīng)流動相推動上述各蛋白溶液到達芯片表面，由表面等離子共振系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線，20min后讀取表面等離子共振角變化值，并計算非特異性吸附量，分別為1.21ng/cm²、6.88ng/cm²、8.35ng/cm²、14.51ng/cm²。

實施例4

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在bk7玻璃基底上涂覆一層2nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層48nm厚的金膜，得到裸金芯片；將上述裸金芯片浸入98％濃硫酸與30％雙氧水(體積比7:3)的混合溶液中，98％濃硫酸與30％雙氧水的體積比為7:3，于常溫下浸泡2h。然后取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干備用。

將24.98mmol半胱氨酸用20ml去離子水溶解后，向其中加入27.47mmol2-丙烯酸-2-羥基-1,3-丙二酯以及29.4μmol二甲苯基磷，于20℃下攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)后的溶液用乙酸乙酯萃取一次，二氯甲烷萃取兩次，凍干后得到白色粉末狀的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體；

用ph＝8.5的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制2mg/ml多巴胺溶液，將上述吹干備用的裸金芯片浸入其中，于40℃下孵育2h，取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干；將修飾有聚多巴胺的基底浸入包含有1.0ml三乙胺的20ml二氯甲烷中，在冰浴且攪拌條件下逐滴加入10ml包含有0.9ml溴代異丁酰溴的二氯甲烷，然后在室溫下攪拌條件反應(yīng)24h，取出用乙醇和去離子水依次清洗3次后用氮氣吹干，將得到的芯片放入預(yù)先三次循環(huán)脫氣充氮氣的施倫克瓶中，取上述凍干后得到的白色粉末狀兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體5mmol溶解于4ml去離子水中，用氮氣脫氣15min，向其中加入0.5mmol聯(lián)吡啶、0.167mmol溴化亞銅和0.083mmol溴化銅，再用氮氣脫氣10min，后用超聲處理5min，將得到的溶液移入施倫克瓶中并將芯片浸沒，于氮氣條件下反應(yīng)2h后取出芯片，依次用乙醇和去離子水各清洗3次，用氮氣吹干備用。

將上述獲得的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上。以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，選擇流速為10μl/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中內(nèi)注入100μl1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(edc，濃度為0.4m)和n-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhs，濃度為0.1m)的混合溶液，經(jīng)流動相推動上述混合溶液到達芯片表面。15min后注入100μl羊免疫球蛋白(anti-igg，1mg/ml)溶液，經(jīng)流動相推動羊免疫球蛋白溶液到達芯片表面，再經(jīng)乙醇胺封閉，30min后即獲得固載羊免疫球蛋白的表面等離子共振傳感芯片，分別注入100μl不同濃度的蛋白溶液：溶菌酶(1mg/ml)、豆?jié){(10mg/ml)、羊免疫球蛋白(15nm)、羊免疫球蛋白(75nm)、羊免疫球蛋白(150nm)、羊免疫球蛋白(300nm)、羊免疫球蛋白(450nm)、羊免疫球蛋白(700nm)、羊免疫球蛋白(15nm)和溶菌酶(1mg/ml)的混合液以及羊免疫球蛋白(15nm)和豆?jié){(10mg/ml)的混合液，通過spr響應(yīng)信號以獲得羊免疫球蛋白(igg)檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本發(fā)明制備的基于兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片具有很好的抗污染性能；具有生物功能化作用，可通過固載羊免疫球蛋白抗體進而檢測其抗原；具有高的穩(wěn)定性，在干燥狀態(tài)下儲存1個月或在ph為7.4的磷酸鹽緩沖液中儲存7天后，抗污染性能無變化；并且制備方法具有一定的普適性，不受基底材料性質(zhì)的限制。

以上對本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費創(chuàng)造性勞動的等同替換均落入本發(fā)明的保護范圍。