本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體是一種牛奶中腹瀉性貝類(lèi)毒素含量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

當(dāng)前，我國(guó)用于腹瀉性貝類(lèi)毒素(diarrheticshellfishpoisoning，DSP)的檢測(cè)方法主要有小鼠生物法及酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)。小鼠生物法的檢測(cè)原理：貝類(lèi)樣品用丙酮、乙醚提取后，經(jīng)減壓蒸干，以1％吐溫-60生理鹽水溶解后注射入小鼠腹腔，觀察小鼠存活情況，計(jì)算其毒力。ELISA的檢測(cè)原理：測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，微孔板包被有針對(duì)大田軟海綿酸(okadaicacid，OA)(DSP的主要成分)抗體的捕捉抗體，加入標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液及OA酶標(biāo)記物，游離OA與OA酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)OA抗體，同時(shí)OA抗體與捕捉抗體連接。洗滌后，將底物和發(fā)色劑加入到孔中并且孵育。加入終止液后，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。小鼠生物法是當(dāng)前我國(guó)腹瀉性貝類(lèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，但其不足之處顯而易見(jiàn)，如：(1)動(dòng)物使用帶來(lái)的倫理問(wèn)題，受到動(dòng)物保護(hù)組織的強(qiáng)烈反對(duì)；(2)靈敏度低，可比性和重復(fù)性差，檢測(cè)結(jié)果與小鼠的品系、體重及狀態(tài)等有關(guān)，難以形成統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；(3)準(zhǔn)確性差，該方法只能檢測(cè)出毒力的大小，無(wú)法確定毒素的成分和含量，容易因高濃度的鋅或不飽和脂肪酸的存在導(dǎo)致假陽(yáng)性；(4)樣品提取過(guò)程復(fù)雜。ELISA法主要存在以下不足：抗體往往只針對(duì)主要成分，其類(lèi)似物可能會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性或?qū)Χ拘缘墓烙?jì)不準(zhǔn)確；(2)單克隆抗體的制備困難，試劑盒價(jià)格昂貴。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種牛奶中腹瀉性貝類(lèi)毒素含量檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種牛奶中腹瀉性貝類(lèi)毒素含量檢測(cè)方法，包括步驟：A)培養(yǎng)人HL-7702肝細(xì)胞，選用不同濃度的大田軟海綿酸(okadaicacid，OA)染毒細(xì)胞，檢測(cè)OA作用細(xì)胞后F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)解聚效應(yīng)大小，從而建立OA誘導(dǎo)HL-7702肝細(xì)胞F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B)根據(jù)HL-7702肝細(xì)胞的F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行OA濃度的計(jì)算，建立腹瀉性貝類(lèi)毒素的細(xì)胞F-actin檢測(cè)方法，確定可能的檢出限范圍；C)選擇與腹瀉性貝類(lèi)毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、軟骨藻酸(domoicacid，DA)、蝦夷扇貝毒素(yessotoxin，YTX)中的一種或幾種，分別以不同濃度作用HL-7702肝細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)其破壞HL-7702肝細(xì)胞F-actin聚合能力的大小確定該方法測(cè)定OA含量的特異性；D）將活化好的生物素溶解于DMSO中，使其濃度為2.5mg/mL，分裝后，置于-20℃保存；每2mL濃度為5mg/mL的毒素單克隆抗體，在0.1MpH8.5的碳酸鹽緩沖液中，透析過(guò)夜，第二天取出，備用；取透析好的毒素單克隆抗體1.6mL，約8mg，加1MpH8.5碳酸鹽緩沖液300uL，混勻后，再加生物素500uL，室溫?cái)嚢?h；加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，4℃攪拌0.5小時(shí)；離心，棄上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，5-10℃攪拌1~2小時(shí)；棄上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，終體積為4mL，PAGE及ELISA檢測(cè)產(chǎn)物效價(jià)。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：還包括如下步驟：同步使用小鼠生物法、ELISA法及細(xì)胞F-actin檢測(cè)法對(duì)采集的貝類(lèi)樣品分別進(jìn)行腹瀉性貝類(lèi)毒素檢測(cè)，并進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：采用雙抗體夾心法原理定量檢測(cè)樣品中生物毒素；用制備的試紙條檢測(cè)樣品中的生物毒素，每一種毒素檢測(cè)試紙條上均有對(duì)照線C和檢測(cè)線T，不同毒素檢測(cè)判斷的原則相同。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟C)選用不同濃度石房蛤毒素、蝦夷扇貝毒素中的一種或幾種濃度。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明牛奶中腹瀉性貝類(lèi)毒素含量檢測(cè)方法能有效檢測(cè)牛奶中的腹瀉性貝類(lèi)毒素含量，相比于背景技術(shù)中提及的方法，具有操作簡(jiǎn)單，成本低的優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

本發(fā)明實(shí)施例中，一種牛奶中腹瀉性貝類(lèi)毒素含量檢測(cè)方法，包括步驟：A)培養(yǎng)人HL-7702肝細(xì)胞，選用不同濃度的大田軟海綿酸(okadaicacid，OA)染毒細(xì)胞，檢測(cè)OA作用細(xì)胞后F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)解聚效應(yīng)大小，從而建立OA誘導(dǎo)HL-7702肝細(xì)胞F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B)根據(jù)HL-7702肝細(xì)胞的F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行OA濃度的計(jì)算，建立腹瀉性貝類(lèi)毒素的細(xì)胞F-actin檢測(cè)方法，確定可能的檢出限范圍；C)選擇與腹瀉性貝類(lèi)毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、軟骨藻酸(domoicacid，DA)、蝦夷扇貝毒素(yessotoxin，YTX)中的一種或幾種，分別以不同濃度作用HL-7702肝細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)其破壞HL-7702肝細(xì)胞F-actin聚合能力的大小確定該方法測(cè)定OA含量的特異性；D）將活化好的生物素溶解于DMSO中，使其濃度為2.5mg/mL，分裝后，置于-20℃保存；每2mL濃度為5mg/mL的毒素單克隆抗體，在0.1MpH8.5的碳酸鹽緩沖液中，透析過(guò)夜，第二天取出，備用；取透析好的毒素單克隆抗體1.6mL，約8mg，加1MpH8.5碳酸鹽緩沖液300uL，混勻后，再加生物素500uL，室溫?cái)嚢?h；加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，4℃攪拌0.5小時(shí)；離心，棄上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，5-10℃攪拌1~2小時(shí)；棄上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，終體積為4mL，PAGE及ELISA檢測(cè)產(chǎn)物效價(jià)。還包括如下步驟：同步使用小鼠生物法、ELISA法及細(xì)胞F-actin檢測(cè)法對(duì)采集的貝類(lèi)樣品分別進(jìn)行腹瀉性貝類(lèi)毒素檢測(cè)，并進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。采用雙抗體夾心法原理定量檢測(cè)樣品中生物毒素；用制備的試紙條檢測(cè)樣品中的生物毒素，每一種毒素檢測(cè)試紙條上均有對(duì)照線C和檢測(cè)線T，不同毒素檢測(cè)判斷的原則相同。所述步驟C)選用不同濃度石房蛤毒素、蝦夷扇貝毒素中的一種或幾種濃度。

實(shí)施例1：

本發(fā)明牛奶中腹瀉性貝類(lèi)毒素含量檢測(cè)方法，包括步驟：A)培養(yǎng)人HL-7702肝細(xì)胞，選用不同濃度的大田軟海綿酸(okadaicacid，OA)染毒細(xì)胞，檢測(cè)OA作用細(xì)胞后F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)解聚效應(yīng)大小，從而建立OA誘導(dǎo)HL-7702肝細(xì)胞F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B)根據(jù)HL-7702肝細(xì)胞的F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行OA濃度的計(jì)算，建立腹瀉性貝類(lèi)毒素的細(xì)胞F-actin檢測(cè)方法，確定可能的檢出限范圍；C)選擇與腹瀉性貝類(lèi)毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、軟骨藻酸(domoicacid，DA)、蝦夷扇貝毒素(yessotoxin，YTX)中的一種或幾種，分別以不同濃度作用HL-7702肝細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)其破壞HL-7702肝細(xì)胞F-actin聚合能力的大小確定該方法測(cè)定OA含量的特異性；D）將活化好的生物素溶解于DMSO中，使其濃度為2.5mg/mL，分裝后，置于-20℃保存；每2mL濃度為5mg/mL的毒素單克隆抗體，在0.1MpH8.5的碳酸鹽緩沖液中，透析過(guò)夜，第二天取出，備用；取透析好的毒素單克隆抗體1.6mL，約8mg，加1MpH8.5碳酸鹽緩沖液300uL，混勻后，再加生物素500uL，室溫?cái)嚢?h；加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，4℃攪拌0.5小時(shí)；離心，棄上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，5℃攪拌1小時(shí)；棄上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，終體積為4mL，PAGE及ELISA檢測(cè)產(chǎn)物效價(jià)。還包括如下步驟：同步使用小鼠生物法、ELISA法及細(xì)胞F-actin檢測(cè)法對(duì)采集的貝類(lèi)樣品分別進(jìn)行腹瀉性貝類(lèi)毒素檢測(cè)，并進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。采用雙抗體夾心法原理定量檢測(cè)樣品中生物毒素；用制備的試紙條檢測(cè)樣品中的生物毒素，每一種毒素檢測(cè)試紙條上均有對(duì)照線C和檢測(cè)線T，不同毒素檢測(cè)判斷的原則相同。所述步驟C)選用不同濃度石房蛤毒素、蝦夷扇貝毒素中的一種或幾種濃度。

實(shí)施例2：

本發(fā)明牛奶中腹瀉性貝類(lèi)毒素含量檢測(cè)方法，包括步驟：A)培養(yǎng)人HL-7702肝細(xì)胞，選用不同濃度的大田軟海綿酸(okadaicacid，OA)染毒細(xì)胞，檢測(cè)OA作用細(xì)胞后F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)解聚效應(yīng)大小，從而建立OA誘導(dǎo)HL-7702肝細(xì)胞F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B)根據(jù)HL-7702肝細(xì)胞的F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行OA濃度的計(jì)算，建立腹瀉性貝類(lèi)毒素的細(xì)胞F-actin檢測(cè)方法，確定可能的檢出限范圍；C)選擇與腹瀉性貝類(lèi)毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、軟骨藻酸(domoicacid，DA)、蝦夷扇貝毒素(yessotoxin，YTX)中的一種或幾種，分別以不同濃度作用HL-7702肝細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)其破壞HL-7702肝細(xì)胞F-actin聚合能力的大小確定該方法測(cè)定OA含量的特異性；D）將活化好的生物素溶解于DMSO中，使其濃度為2.5mg/mL，分裝后，置于-20℃保存；每2mL濃度為5mg/mL的毒素單克隆抗體，在0.1MpH8.5的碳酸鹽緩沖液中，透析過(guò)夜，第二天取出，備用；取透析好的毒素單克隆抗體1.6mL，約8mg，加1MpH8.5碳酸鹽緩沖液300uL，混勻后，再加生物素500uL，室溫?cái)嚢?h；加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，4℃攪拌0.5小時(shí)；離心，棄上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，10℃攪拌2小時(shí)；棄上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，終體積為4mL，PAGE及ELISA檢測(cè)產(chǎn)物效價(jià)。還包括如下步驟：同步使用小鼠生物法、ELISA法及細(xì)胞F-actin檢測(cè)法對(duì)采集的貝類(lèi)樣品分別進(jìn)行腹瀉性貝類(lèi)毒素檢測(cè)，并進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。采用雙抗體夾心法原理定量檢測(cè)樣品中生物毒素；用制備的試紙條檢測(cè)樣品中的生物毒素，每一種毒素檢測(cè)試紙條上均有對(duì)照線C和檢測(cè)線T，不同毒素檢測(cè)判斷的原則相同。所述步驟C)選用不同濃度石房蛤毒素、蝦夷扇貝毒素中的一種或幾種濃度。

實(shí)施例3：

本發(fā)明牛奶中腹瀉性貝類(lèi)毒素含量檢測(cè)方法，包括步驟：A)培養(yǎng)人HL-7702肝細(xì)胞，選用不同濃度的大田軟海綿酸(okadaicacid，OA)染毒細(xì)胞，檢測(cè)OA作用細(xì)胞后F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)解聚效應(yīng)大小，從而建立OA誘導(dǎo)HL-7702肝細(xì)胞F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B)根據(jù)HL-7702肝細(xì)胞的F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行OA濃度的計(jì)算，建立腹瀉性貝類(lèi)毒素的細(xì)胞F-actin檢測(cè)方法，確定可能的檢出限范圍；C)選擇與腹瀉性貝類(lèi)毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、軟骨藻酸(domoicacid，DA)、蝦夷扇貝毒素(yessotoxin，YTX)中的一種或幾種，分別以不同濃度作用HL-7702肝細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)其破壞HL-7702肝細(xì)胞F-actin聚合能力的大小確定該方法測(cè)定OA含量的特異性；D）將活化好的生物素溶解于DMSO中，使其濃度為2.5mg/mL，分裝后，置于-20℃保存；每2mL濃度為5mg/mL的毒素單克隆抗體，在0.1MpH8.5的碳酸鹽緩沖液中，透析過(guò)夜，第二天取出，備用；取透析好的毒素單克隆抗體1.6mL，約8mg，加1MpH8.5碳酸鹽緩沖液300uL，混勻后，再加生物素500uL，室溫?cái)嚢?h；加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，4℃攪拌0.5小時(shí)；離心，棄上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入飽和硫酸銨，使硫酸銨飽和度為50％，10℃攪拌1.5小時(shí)；棄上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，終體積為4mL，PAGE及ELISA檢測(cè)產(chǎn)物效價(jià)。還包括如下步驟：同步使用小鼠生物法、ELISA法及細(xì)胞F-actin檢測(cè)法對(duì)采集的貝類(lèi)樣品分別進(jìn)行腹瀉性貝類(lèi)毒素檢測(cè)，并進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。采用雙抗體夾心法原理定量檢測(cè)樣品中生物毒素；用制備的試紙條檢測(cè)樣品中的生物毒素，每一種毒素檢測(cè)試紙條上均有對(duì)照線C和檢測(cè)線T，不同毒素檢測(cè)判斷的原則相同。所述步驟C)選用不同濃度石房蛤毒素、蝦夷扇貝毒素中的一種或幾種濃度。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。