本發(fā)明涉及紙芯片的分子檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種利用紙芯片比色分析裝置檢測核酸濃度的方法。

背景技術(shù)：

最近，眾多納米材料如金屬氧化物、金屬納米顆粒、碳基納米材料(石墨烯、碳量子點(diǎn)、碳納米管等)和這些材料相互結(jié)合形成的復(fù)合型納米材料等已被證實(shí)具有優(yōu)越的類過氧化物酶活性，并且被廣泛用于各種生物傳感策略中。同時(shí)，由于納米人工酶具有納米材料和天然酶的雙重優(yōu)越特性，在發(fā)展納米酶來替代傳統(tǒng)的蛋白酶生物分析研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，核酸和納米材料之的自組裝體系可以完美地將納米材料自身光學(xué)、電磁學(xué)、以及催化性能與核酸有序組裝特性和序列特異性識(shí)別能力相互融合，能夠在分析檢測中獲得優(yōu)越的信號(hào)識(shí)別和信號(hào)放大效果。

紙基分析設(shè)備(paper-based analytical device，PAD)簡稱紙芯片作為微流控芯片中的最新發(fā)展技術(shù)手段，為環(huán)境監(jiān)測、食品安全控制和醫(yī)療快速診斷提供了新的研究方向和有力手段。紙芯片采用紙質(zhì)材料作為基底，通過對紙材料進(jìn)行各種精細(xì)設(shè)計(jì)和加工后，就會(huì)得到具備特定結(jié)構(gòu)和功能的分析元件。另外，基于這些紙質(zhì)材料元件具備化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)(不參與大多數(shù)生化反應(yīng))、生物相容性優(yōu)越、無需外力驅(qū)動(dòng)反應(yīng)液就可紙質(zhì)上順利流通等良好特性，因而可在一塊簡單微型的紙芯片就可以快速地完成進(jìn)樣、反應(yīng)以及檢測等眾多步驟。目前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室關(guān)于核酸濃度定量的方法和技術(shù)主要是利用電泳手段和紫外分光光度法。在實(shí)際操作中，電泳過程繁瑣耗時(shí)并且操作者還要小心各種劇毒物質(zhì)。另外，紫外分析設(shè)備不具有便攜性并且十分不經(jīng)濟(jì)。本發(fā)明基于紙芯片核酸濃度定量方法可以改進(jìn)這些不足，有效實(shí)現(xiàn)核酸濃度的靈敏、快速、便捷定量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種利用紙芯片比色分析裝置檢測核酸濃度的方法，其可實(shí)現(xiàn)快速、靈敏的核酸濃度的比色檢測。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用紙芯片比色分析裝置檢測核酸濃度的方法，所述紙芯片比色分析裝置包括紙芯片、放置紙芯片的模具基底以及光纖分析設(shè)備，其特征在于，所述檢測核酸濃度的方法包括以下步驟：

步驟a、將紙芯片放置在模具基底上，在紙芯片上預(yù)先滴加TMB/H₂O₂顯色底物溶液；

步驟b、滴加核酸鉑納米復(fù)合材料至紙芯片上，與顯色底物溶液混合后反應(yīng)3-4分鐘；

步驟c、觀測并記錄紙芯片的比色結(jié)果，顯色顏色從無色變化至藍(lán)色，顏色深度與核酸濃度成反比；

步驟d、將步驟c中的紙芯片放置于光纖分析設(shè)備中，進(jìn)一步數(shù)值化精確讀取紙芯片的顏色強(qiáng)度。

優(yōu)選的，所述光纖分析設(shè)備含有一個(gè)可發(fā)射紅色激光的探針，該探針上還組裝可對反射激光強(qiáng)度檢測的探頭元件，探針由導(dǎo)線接通于檢測平臺(tái)并以數(shù)值形式顯示檢測的結(jié)果。

優(yōu)選的，所述紙芯片比色分析裝置的制備步驟如下：制備橢圓柱形的塑料模具基底，所述塑料模具基底的上表面沿著橢圓形的長徑方向上等距離設(shè)置至少2個(gè)圓形空心小孔以放置紙芯片；制備圓形的紙芯片，采用切刻機(jī)對親水性聚偏氟乙烯膜進(jìn)行切割以形成圓形的紙芯片；其中所述紙芯片的直徑比所述圓形空心小孔的直徑大至少3mm。

優(yōu)選的，所述塑料模具基底長為45mm，寬為30mm，高為6mm，所述圓形空心小孔的底部離所述塑料模具基底上表面的距離為0.5～1.5mm，所述圓形空心小孔的數(shù)量為2個(gè)。

優(yōu)選的，所述紙芯片的直徑為11～12mm，所述圓形空心小孔的直徑為7mm。

優(yōu)選的，所述TMB/H₂O₂顯色底物溶液組成如下：20mM MES-HAc(140mMNaAc，PH 4.0)溶液中含有2％v/v TMB(30mM)和2％v/v H₂O₂(30wt％)。

優(yōu)選的，所述核酸鉑納米復(fù)合材料的制備步驟包括：配置反應(yīng)液，置于離心 管中，同時(shí)向離心管中引入目標(biāo)核酸，攪拌混勻5s；滴加鉑前驅(qū)體物質(zhì)到離心管中，離心振蕩5s，并室溫下培育2mi；快速滴加新鮮配制的硼氫化鈉溶液到離心管中，離心振蕩5s，并在室溫下靜置反應(yīng)4-5min，獲得核酸鉑納米復(fù)合材料。

優(yōu)選的，所述目標(biāo)核酸的核苷酸序列為TTACCGAACGAAAAATTCTAGGCTATGTACAACTACGCAAAGGCCCCAACGT(SEQ ID NO.1)，該目標(biāo)核酸選取于阿茲海默疾病(Alzheimer’s disease(AD))相關(guān)聯(lián)的致病基因部分序列片段。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)液含有10mM Tris-HCl，150mM NaCl，25mM MgCl2，pH值為7.5。

優(yōu)選的，所述鉑前驅(qū)體物質(zhì)為濃度為80uM的K₂PtCl₄。

優(yōu)選的，所述光纖分析設(shè)備能夠?qū)崿F(xiàn)對0.0075uM目標(biāo)核酸濃度的檢測。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下機(jī)理：大多數(shù)與鉑納米相關(guān)的材料都具備優(yōu)異類似過氧化氫酶活性，可以快速催化TMB/H₂O₂底物生成藍(lán)色可見的沉淀物。大分子核酸可以通過非公價(jià)相互作用快速與鉑前驅(qū)體分子(K₂PtCl₄)結(jié)合，當(dāng)強(qiáng)還原劑硼氫化鈉加入后會(huì)催化這些鉑前驅(qū)體分子以核酸分子為模板快速生成核酸鉑納米復(fù)合材料(DNA-Pt hybrid naomaterials)。由于核酸大分子的空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致核酸鉑納米復(fù)合材料表面活性位點(diǎn)被大量包覆，使得核酸鉑納米復(fù)合材料的酶催化活性被有效抑制。失去酶活性的核酸鉑納米復(fù)合材料不能夠有效地催化TMB/過氧化氫H₂O₂底物溶液產(chǎn)生顏色響應(yīng)。

本發(fā)明所述的檢測方法主要基于核酸與鉑納米材料自組裝結(jié)合作用來調(diào)控鉑納米材料的類過氧化物酶活性，溶液中不同濃度的目標(biāo)核酸含量直接導(dǎo)致最終核酸鉑納米復(fù)合材料具有不同的酶催化活性。同時(shí)采用一種紙芯片來作為微反應(yīng)器進(jìn)行核酸鉑納米復(fù)合材料催化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)/過氧化氫(H₂O₂)底物顯色反應(yīng)，通過分析紙芯片的顏色響應(yīng)來實(shí)現(xiàn)快速高效定性檢測核酸濃度，根據(jù)肉眼觀察就可判斷紙芯片上的藍(lán)色深度變化與核酸濃度之間的關(guān)系，也可使用光纖分析設(shè)備進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)便捷靈敏核酸濃度分析。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

紙芯片比色分析裝置中模具基底可以用來固定和保存紙芯片，便于攜帶、適用于任意地方目標(biāo)物質(zhì)的快速檢測；紙芯片具備類似微反應(yīng)容器功能，可以在芯 片上進(jìn)行核酸鉑納米復(fù)合材料催化TMB/H₂O₂的顯色反應(yīng)；簡易的光纖分析設(shè)備可通過數(shù)值形式表征紙芯片上顏色的強(qiáng)度，從而便于精確分析紙芯片顯色反應(yīng)結(jié)果；

紙芯片比色分析裝置中，采用橢球型的模具基底，減少了其占用空間，更利于攜帶，并同時(shí)設(shè)置多個(gè)可放置紙芯片的小孔，能較好的保證檢測的同步性，并有效減少檢測時(shí)間；

由于紙芯片具備微型化、集成化、便攜化等優(yōu)勢，因而對于核酸濃度的檢測具有很大的優(yōu)勢，本發(fā)明所述的檢測方法操作簡單，便攜性強(qiáng)，成本較低，具有十分優(yōu)異的經(jīng)濟(jì)效益，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為紙芯片比色分析裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圓心紙質(zhì)芯片安放在塑料模塊基底上的圓形空心小孔中；

圖2為利用紙芯片比色分析裝置檢測核酸濃度的方法流程圖；

圖3為核酸鉑納米復(fù)合材料透射電鏡(Transmission electron microscope，TEM)的表征結(jié)果圖；

圖4為核酸鉑納米復(fù)合材料X射線電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)的表征結(jié)果圖。

圖5a為溶液中目標(biāo)核酸濃度與通過光纖分析設(shè)備的數(shù)值之間的線性關(guān)系圖；

圖5b為不同濃度目標(biāo)核酸在紙芯片上的比色結(jié)果圖。

附圖標(biāo)記為：1、模具基底；2、圓形空心小孔；3、紙芯片3。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下實(shí)施例中所用方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

本發(fā)明所述的檢測方法可進(jìn)行任一核酸分子的濃度檢測，本實(shí)施例僅以下述目標(biāo)核酸的核酸序列舉例說明。

檢測的核酸序列如下：TTACCGAACGAAAAATTCTAGGCTATGTACAACTACGCAAAGGCCCCAACGT(SEQ ID NO.1)。該目標(biāo)核酸選取于阿茲海默疾病(Alzheimer’s disease(AD))相關(guān)聯(lián)的致病基因部分序列片段。

實(shí)施例1

制備紙芯片比色分析裝置。

如圖1所示，本發(fā)明所采用的紙芯片比色分析裝置包括橢圓柱形的塑料模具基底1、圓形空心小孔2以及紙芯片3，其制備步驟為：設(shè)計(jì)一種橢圓柱形的塑料模具基底1，所述塑料模具基底1的上表面沿著橢圓形的長徑方向上等距離設(shè)置至少2個(gè)直徑均為7mm的圓形空心小孔2以放置紙芯片3；在工作電腦上用繪圖軟件繪制直徑為11～12mm圓形紙芯片3的模板，然后通過連接于電腦的切刻機(jī)對親水性聚偏氟乙烯膜(紙芯片3的原材料)進(jìn)行切割，在幾分鐘內(nèi)就會(huì)得到大量規(guī)格同等的紙芯片元件，隨后將其擺放在塑料模塊基底1上的圓形空心小孔2中，干燥常溫下放置待用。

所述紙芯片比色分析裝置還可包括光纖分析設(shè)備，所述光纖分析設(shè)備含有一個(gè)可發(fā)射紅色激光的探針，該探針上還組裝可對反射激光強(qiáng)度檢測的探頭元件，探針由導(dǎo)線接通于檢測平臺(tái)并以數(shù)值形式顯示檢測的結(jié)果。

實(shí)施例2

核酸鉑納米復(fù)合材料的制備，其制備的核酸濃度包括0.5uM、0.3uM、0.15uM、0.05uM、0.025uM、0.012uM、0.0075uM。

其制備步驟如下：

a.配置50ul反應(yīng)溶液中(反應(yīng)液含有10mM Tris-HCl，150mM NaCl，25mMMgCl₂，pH 7.5)分別置于500ul的離心管中，同時(shí)分別向各反應(yīng)溶液中引入不同濃度的目標(biāo)核酸，5s攪拌混勻。

b.隨后滴加2.5ul的80uM鉑前驅(qū)體物質(zhì)(K₂PtCl₄)到含不同濃度的目標(biāo)核酸的反應(yīng)溶液中，渦旋離心振蕩5s,并室溫下培育2min左右。

c.緊接著快速滴加10ul新鮮配制的硼氫化鈉溶液(25mM)到反應(yīng)溶液中，渦旋離心振蕩5s，并在室溫下靜置反應(yīng)4-5min，獲得核酸鉑納米復(fù)合材料，不需要任何離心清洗操作。

實(shí)施例3

采用實(shí)施例1制備的紙芯片比色分析裝置檢測核酸濃度以及確定檢測限。

TMB/H₂O₂顯色底物溶液組成如下：20mM MES-HAc(140mM NaAc PH 4.0)溶液中含有2％v/v TMB(30mM)和2％v/v H₂O₂(30wt％)。TMB由無水乙醇溶解，TMB和H₂O₂溶液均需保證現(xiàn)配現(xiàn)用。

采用紙芯片比色分析裝置檢測目標(biāo)核酸濃度的示意圖如圖2所示。具體步驟如下：首先將紙芯片3放置在塑料模具基底1上的圓形空心小孔2中，在紙芯片3上滴加10ul TMB/H₂O₂顯色底物溶液，隨后滴加實(shí)施例2制備的10ul核酸鉑納米復(fù)合材料溶液進(jìn)入紙芯片3中。紙芯片3上的微反應(yīng)器在室溫下靜置3-4分鐘確保反應(yīng)完全，隨后用數(shù)碼相機(jī)或智能手機(jī)對紙芯片3進(jìn)行拍照來記錄比色結(jié)果，比色結(jié)果如圖5b所示。

當(dāng)制備核酸鉑納米復(fù)合材料的反應(yīng)液中不含核酸分子時(shí)，最終紙芯片上可以看到藍(lán)色很深沉淀物出現(xiàn)，這是由于鉑納米材料具有良好的類過氧化物酶催化活性，可以催化TMB/H₂O₂底物快速反應(yīng)。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)制備反應(yīng)液中核酸分子濃度逐漸增加時(shí)，最終紙芯片藍(lán)色沉淀物逐漸變淡，這表明了核酸濃度的提高有效地抑制了核酸鉑納米復(fù)合材料的類過氧化物酶活性，顏色的深度與核酸的濃度成反比。

同時(shí)將其放置到光纖分析設(shè)備的探頭下進(jìn)一步用數(shù)值方式精確地讀取芯片上顏色強(qiáng)度，最終結(jié)果如圖5a所示。光纖檢測的數(shù)值與核酸的濃度對數(shù)值之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，從光纖分析設(shè)備的結(jié)果中可以證實(shí)本方法最低可實(shí)現(xiàn)對0.0075uM目標(biāo)核酸的濃度檢測。

同時(shí)對核酸鉑納米復(fù)合材料進(jìn)行透射電鏡表征和X射線電子能譜表征，其結(jié)果分別如圖3、圖4所示。

對比例1

采用專利CN105973879A所制備的紙芯片比色分析裝置進(jìn)行檢測核酸含量的比色檢測，其余步驟均與實(shí)施例3相同。

對比例1完成比色檢測的時(shí)間需要將近1個(gè)小時(shí)，實(shí)施例3完成所有核酸濃度檢測的時(shí)間僅為25分鐘，其有效縮短了檢測時(shí)間。

通過上述實(shí)施例可知，本發(fā)明所述的檢測方法可以實(shí)現(xiàn)快速、靈敏的目標(biāo)核酸的紙芯片比色檢測，操作簡單，便攜性強(qiáng)，成本較低，具有十分優(yōu)異的經(jīng)濟(jì)效 益，具有良好的應(yīng)用前景。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

<110> 復(fù)旦大學(xué)；上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司

<120> 一種利用紙芯片比色分析裝置檢測核酸濃度的方法

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<212> DNA

<213> 阿茲海默疾?。ˋlzheimer’s disease）相關(guān)聯(lián)的致病基因部分序列片段

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<223> 目標(biāo)核酸

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