本發(fā)明屬于檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種可以同時(shí)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三種離子的熒光生物探針、包含該熒光生物探針的生物檢測(cè)系統(tǒng)及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

隨著科技的發(fā)展，土壤、水源、食品等逐漸被工業(yè)廢氣、廢水、廢渣所污染，土壤中汞(Hg²⁺)、銅(Cu²⁺)、鉛(Pb²⁺)、鎂(Mg²⁺)等多種金屬污染物大量富集、累積，并通過(guò)食物鏈在生物體內(nèi)累積，給人們帶來(lái)了嚴(yán)重的健康危害，如鉛(Pb²⁺)，作為對(duì)人體危害最大的重金屬，即使在很低的濃度下，對(duì)人體各系統(tǒng)也有著嚴(yán)重的毒害作用，并對(duì)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育影響極大，嚴(yán)重影響兒童的智力發(fā)育和行為；鎂(Mg²⁺)可引起過(guò)敏性皮炎或濕疹，久而不愈，對(duì)眼睛和粘膜有很強(qiáng)的刺激性，對(duì)皮膚有中度刺激性，吸入還可導(dǎo)致肺栓塞和肝損害，鎂(Mg²⁺)中毒嚴(yán)重者甚至威脅到生命安全；銅(Cu²⁺)具有抗生育作用，低濃度的Cu²⁺即對(duì)男性精子表現(xiàn)出毒害作用等。因此，有必要發(fā)展一種高選擇性和高靈敏性的分析方法用于環(huán)境中金屬離子的檢測(cè)。脫氧核酸酶由于高催化活性、高穩(wěn)定性、能與某種特定的金屬離子特異性結(jié)合等特點(diǎn)，通過(guò)結(jié)合一些信號(hào)轉(zhuǎn)換策略，發(fā)展了許多不同的金屬檢測(cè)方法，如比色法、熒光法、拉曼、電化學(xué)法等。但現(xiàn)有的基于脫氧核酸酶技術(shù)的金屬檢測(cè)方法大多只能檢測(cè)一種金屬離子，Li L等人[Li L,Feng J,Fan Y,et al.Simultaneous imaging of Zn²⁺and Cu²⁺in living cells based on DNAzyme modified gold nanoparticle[J]報(bào)道了將兩種不同的脫氧核酸酶固定在納米金粒子表面，可以同時(shí)檢測(cè)Zn²⁺和Cu²⁺兩種離子的濃度，但由于納米金粒子體積較大，會(huì)干擾固定于其表面的脫氧核酸酶的催化活性，影響金屬檢測(cè)靈敏度等。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠同時(shí)檢測(cè)多種金屬及其濃度、且靈敏度高、操作方便的高效率金屬檢測(cè)方法，具有重要的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種熒光生物探針，本發(fā)明的熒光生物探針可以同時(shí)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三種金屬離子，且靈敏度高、操作簡(jiǎn)單快捷、成本低廉，能夠廣泛應(yīng)用于藥品、食品安全、臨床和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于同時(shí)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三種金屬離子濃度的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于包括本發(fā)明的熒光生物探針和氧化石墨烯(GO)。

本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三種金屬離子濃度的生物檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，提供以下技術(shù)方案：

一種熒光生物探針，由三種核酸片段S1、S2和S3組成，S1、S2和S3的堿基序列見(jiàn)圖2，其中S1、S2和S3的5’端分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，S1、S2和S3通過(guò)堿基互補(bǔ)形成”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的熒光生物探針的工作原理見(jiàn)圖1，每種核酸片段包含一種金屬酶鏈和另一種金屬底物鏈，當(dāng)環(huán)境中不存在Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺時(shí)，三種核酸片段S1、S2和S3通過(guò)堿基互補(bǔ)形成如圖1的”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)，難以吸附于氧化石墨烯表面而發(fā)出熒光信號(hào)，當(dāng)環(huán)境中存在Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺中的至少一種金屬離子時(shí)，相應(yīng)的金屬酶鏈會(huì)在該金屬離子的作用下，對(duì)其底物鏈進(jìn)行剪切，形成游離的底物鏈吸附于氧化石墨烯表面，相應(yīng)的熒光信號(hào)淬滅。如當(dāng)環(huán)境中存在Cu²⁺時(shí)，包含Cu²⁺酶鏈的核酸片段在Cu²⁺作用下，對(duì)包含Cu²⁺底物鏈的核酸片段進(jìn)行剪切，游離出5-’末端標(biāo)記了熒光基團(tuán)的Cu²⁺底物鏈，吸附于氧化石墨烯表面，相應(yīng)的熒光信號(hào)淬滅；又如當(dāng)環(huán)境中同時(shí)存在Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三種離子時(shí)，三種核酸片段分別在Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺作用下，對(duì)其底物鏈進(jìn)行剪切，游離出三種5-’末端標(biāo)記了不同熒光基團(tuán)的Cu²⁺底物鏈、Mg²⁺底物鏈和Pb²⁺底物鏈，吸附于氧化石墨烯表面，所有的熒光信號(hào)淬滅。

根據(jù)本發(fā)明，所述的熒光生物探針S1、S2和S3組成的”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)可以通過(guò)95℃下攪拌5min獲得。

根據(jù)本發(fā)明，所述的熒光基團(tuán)選自FAM、Cy5和ROX。

第二方面，本發(fā)明提供一種用于同時(shí)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，包括本發(fā)明的熒光生物探針和氧化石墨烯，其特征在于所述的熒光生物探針由三種核酸片段S1、S2和S3組成，S1、S2和S3的堿基序列見(jiàn)圖2，其中S1、S2和S3的5’端分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，S1、S2和S3通過(guò)堿基互補(bǔ)形成”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)；所述的氧化石墨烯可以采用修飾的Hummer法等方法合成制備。

在Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺存在時(shí)，本發(fā)明的熒光生物探針S1、S2和S3通過(guò)堿基互補(bǔ)形成如圖1的”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)，難以吸附于氧化石墨烯表面而發(fā)出熒光信號(hào)，當(dāng)環(huán)境中存在Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺中的至少一種金屬離子時(shí)，相應(yīng)的金屬酶鏈會(huì)在該金屬離子的作用下，對(duì)其底物鏈進(jìn)行剪切，形成游離的底物鏈吸附于氧化石墨烯表面，相應(yīng)的熒光信號(hào)淬滅。

根據(jù)本發(fā)明的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，所述的熒光生物探針S1、S2和S3組成的”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)可以通過(guò)95℃下攪拌5min獲得。

根據(jù)本發(fā)明的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，其中熒光生物探針S1、S2和S3組成的5’-末端標(biāo)記的熒光基團(tuán)選自FAM、Cy5和ROX。

根據(jù)本發(fā)明的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，其中氧化石墨烯(GO)可以采用修飾的Hummer方法制備。

根據(jù)本發(fā)明的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，其中熒光生物探針S1、S2和S3為濃度50nM的S1、S2和S3Tris-HCl緩沖溶液，氧化石墨烯(GO)為濃度60-100ug/mL Tris-HCl緩沖溶液。

根據(jù)本發(fā)明的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，其中熒光生物探針S1、S2和S3為濃度50nM的S1、S2和S3Tris-HCl緩沖溶液，氧化石墨烯(GO)為濃度80-100ug/mL Tris-HCl緩沖溶液。

根據(jù)本發(fā)明的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，其中熒光生物探針S1、S2和S3為濃度50nM的S1、S2和S3Tris-HCl緩沖溶液，氧化石墨烯(GO)為濃度100ug/mL Tris-HCl緩沖溶液。

根據(jù)本發(fā)明的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，其中Tris-HCl緩沖溶液為濃度50mmol/L，pH7.5，含50mmol/L MgCl₂的溶液。

第三方面，本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺三種金屬離子濃度的生物檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟：

(1)室溫下，將待測(cè)品、熒光生物探針S1、S2和S3的Tris-HCl緩沖溶液混合均勻后，孵化時(shí)間T1，加入氧化石墨烯混合均勻后，孵化時(shí)間T2；

(2)測(cè)定步驟(1)所得物的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度-Cu²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)樣品的Cu²⁺濃度值，根據(jù)熒光強(qiáng)度-Mg²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)樣品的Mg²⁺濃度值，根據(jù)熒光強(qiáng)度-Pb²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)樣品的Pb²⁺濃度值。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(1)中熒光生物探針S1、S2和S3在使用前加熱至95℃反應(yīng)5min，然后逐漸冷卻至室溫。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(1)中的氧化石墨烯可以采用修飾的Hummer方法制備。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(1)中的待測(cè)品可以根據(jù)需要進(jìn)行稀釋或濃縮操作。優(yōu)選地，步驟(1)中的待測(cè)品可以根據(jù)需要進(jìn)行稀釋操作。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(1)中熒光生物探針S1、S2和S3的Tris-HCl緩沖溶液濃度為50nmol/L，氧化石墨烯(GO)為濃度60-100ug/mL Tris-HCl緩沖溶液。優(yōu)選地，步驟(1)中熒光生物探針S1、S2和S3的Tris-HCl緩沖溶液濃度為50nmol/L，氧化石墨烯(GO)為濃度80-100ug/mL Tris-HCl緩沖溶液。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(1)中熒光生物探針S1、S2和S3的Tris-HCl緩沖溶液濃度為50nmol/L，氧化石墨烯(GO)為濃度100ug/mL Tris-HCl緩沖溶液。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(1)中Tris-HCl緩沖溶液為50mmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl₂。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(1)中的孵化時(shí)間T1為5-60min。優(yōu)選地，步驟(1)中的孵化時(shí)間T1為5-20min。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(1)中的孵化時(shí)間T1為5-10min。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(1)中的孵化時(shí)間T2為15-50min。優(yōu)選地，步驟(1)中的孵化時(shí)間T2為20-30min。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(1)中的孵化時(shí)間T2為25min。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(2)中的檢測(cè)條件為FAM的激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為492nm，掃描范圍505-600nm，掃描步長(zhǎng)為1nm；Cy5的激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為640nm，掃描范圍650-750nm，掃描步長(zhǎng)為1nm；ROX的激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為580nm，掃描范圍590-700nm，掃描步長(zhǎng)為1nm。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(2)中的熒光強(qiáng)度-Cu²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是通過(guò)將一系列濃度的Cu²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品、熒光生物探針S1、S2和S3的Tris-HCl緩沖溶液混合搖勻后，孵化時(shí)間T1后，加入氧化石墨烯混合均勻，孵化時(shí)間T2，測(cè)得熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度，并以濃度為橫坐標(biāo)，熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度為縱坐標(biāo)制備得到，所述Cu²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍為0.5-100uM。

根據(jù)本發(fā)明的生物測(cè)試方法，步驟(2)中的熒光強(qiáng)度-Mg²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熒光強(qiáng)度-Pb²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可以采用和熒光強(qiáng)度-Pb²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相同的方法得到，所述的Mg²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍為20-2000uM，所述的Pb²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍為1-500nM。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的一種同時(shí)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三種離子濃度的生物檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟：

(1)室溫下，將一系列濃度的Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品、熒光生物探針S1、S2和S3的Tris-HCl緩沖溶液混合均勻，孵化時(shí)間T1，加入氧化石墨烯混合均勻后，孵化時(shí)間T2；

(2)測(cè)定步驟(1)所得物的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度，制備熒光強(qiáng)度-Cu²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、熒光強(qiáng)度-Mg²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熒光強(qiáng)度-Pb²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

(3)室溫下，取待測(cè)樣品，重復(fù)步驟(1)；

(4)測(cè)定步驟(3)所得物的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度-Cu²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、熒光強(qiáng)度-Mg²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熒光強(qiáng)度-Pb²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)樣品的Cu²⁺濃度、Mg²⁺濃度和Pb²⁺濃度。

在一些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的一種同時(shí)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三種離子濃度的生物檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟：

(1)配制一系列濃度的Cu²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品，如0.5uM、5uM、10uM、20uM、50uM和100uM；配制一系列濃度的Mg²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品，如20uM、100uM、500uM、1000uM、1500uM和2000uM；配制一系列濃度的Pb²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品，如1nM、20nM、100nM、200nM、300nM和500nM；

(2)室溫下，分別將步驟(1)配制的Cu²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品、Mg²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品和Pb²⁺溶液標(biāo)準(zhǔn)品、熒光生物探針S1、S2和S3的Tris-HCl緩沖溶液混合均勻，孵化5-20min，加入氧化石墨烯混合均勻后，孵化20-30min，其中，所述的熒光生物探針S1、S2和S3的Tris-HCl緩沖溶液的濃度為50nM，所述的Tris-HCl緩沖溶液為濃度50mmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl₂的溶液，所述的氧化石墨烯通過(guò)修飾Hummer方法制備，濃度80-100μg/mL；

(3)測(cè)定步驟(1)所得物的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度，制備熒光強(qiáng)度-Cu²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、熒光強(qiáng)度-Mg²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熒光強(qiáng)度-Pb²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

(4)室溫下，取待測(cè)樣品，重復(fù)步驟(2)；

(5)測(cè)定步驟(4)所得物的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度-Cu²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、熒光強(qiáng)度-Mg²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熒光強(qiáng)度-Pb²⁺濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)樣品的Cu²⁺濃度、Mg²⁺濃度和Pb²⁺濃度。

本發(fā)明提供的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)設(shè)計(jì)含有不同金屬酶鏈和金屬底物鏈的三種核酸片段堿基互補(bǔ)組裝生成的”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)，難以吸附于氧化石墨烯表面，發(fā)出熒光信號(hào)，而在特定金屬存在下，金屬酶鏈對(duì)其金屬底物鏈進(jìn)行剪切游離出5’-端標(biāo)記熒光基團(tuán)的金屬底物鏈吸附于氧化石墨烯表面，熒光信號(hào)猝滅的原理同時(shí)測(cè)定樣品中Cu²⁺濃度、Mg²⁺濃度和Pb²⁺濃度，選擇性強(qiáng)，靈敏度高，Cu²⁺的線(xiàn)性范圍為0.5-100uM，最低檢出限為0.1uM，Mg²⁺的線(xiàn)性范圍為20-2000uM，最低檢出限為5uM，Pb²⁺的線(xiàn)性范圍為1-500nM，最低檢出限為0.3nM，且重復(fù)性好，檢測(cè)效率高，方法簡(jiǎn)單可靠，成本低廉。

術(shù)語(yǔ)解釋

本發(fā)明所述的“pM”是指濃度單位pmol/L，所述的“nM”是指濃度單位nmol/L，所述的“uM”是指濃度單位umol/L。

本發(fā)明所述的“金屬酶鏈”是指與某種金屬具有高度親和力、在相應(yīng)金屬存在下能夠?qū)εc其互補(bǔ)的堿基進(jìn)行剪切的堿基序列。

本發(fā)明所述的“金屬底物鏈”是指與相應(yīng)的金屬酶鏈呈互補(bǔ)關(guān)系、能夠被金屬酶鏈剪切的堿基序列。

本發(fā)明所述的“rA”和序列表中的“ra”是指腺嘌呤核糖核苷酸，所述的“A”和序列表中的“a”是指腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，所述的“T”和序列表中的“t”是指胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸，所述的“C”和序列表中的“c”是指胞嘧啶脫氧核糖核苷酸，所述的“G”和序列表中的“g”是指鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷酸。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺的原理示意圖。

圖2是本發(fā)明生物熒光探針S1、S2和S3的堿基序列。

圖3是實(shí)施例2中Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺的熒光發(fā)射光譜。

圖4是實(shí)施例5熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)的選擇性分析結(jié)果。

圖5是本發(fā)明熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)的參數(shù)測(cè)定結(jié)果。

圖6a和6b是50nmol/L S1、S2、S3和100μg/mL GO的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，Ph7.5，含50mmol/L MgCl₂)中的不同濃度Cu²⁺的熒光發(fā)射光譜和不同濃度Cu²⁺的熒光強(qiáng)度與Cu²⁺濃度關(guān)系的曲線(xiàn)圖。

圖7a和7b是50nmol/L S1、S2、S3和100μg/mL GO的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，Ph7.5，含50mmol/L MgCl₂)中的不同濃度Mg²⁺的熒光發(fā)射光譜和不同濃度Mg²⁺的熒光強(qiáng)度與Mg²⁺濃度關(guān)系的曲線(xiàn)圖。

圖8a和8b是50nmol/L S1、S2、S3和100μg/mL GO的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，Ph7.5，含50mmol/L MgCl₂)中的不同濃度Pb²⁺的熒光發(fā)射光譜和不同濃度Pb²⁺的熒光強(qiáng)度與Pb²⁺濃度關(guān)系的曲線(xiàn)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但并不因此限制本發(fā)明。本文中使用的原料、試劑均可以通過(guò)商購(gòu)或本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備。

實(shí)施例1氧化石墨烯(GO)的制備

稱(chēng)取2g石墨粉末溶于50mL濃硫酸中，攪拌2h；20℃條件下緩慢加入10g高錳酸鉀，然后轉(zhuǎn)移至35℃水浴中強(qiáng)烈攪拌4h；加入600mL超純水稀釋反應(yīng)液；逐漸滴加20mL 30％H₂O₂溶液；將反應(yīng)混合物分別依次用0.1mol/L HCl和超純水洗滌5次，超聲分散1h；以5000rpm的速度離心GO混合物10min，取上清液作為實(shí)驗(yàn)備用GO。

實(shí)施例2本發(fā)明熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)的有效性分析

見(jiàn)圖3，組1是分別測(cè)定只含有本發(fā)明單個(gè)核酸片段S1、S2或S3的熒光強(qiáng)度值；組2是測(cè)定含有本發(fā)明的熒光生物探針的熒光強(qiáng)度值(本發(fā)明核酸片段S1、S2和S3的混合物，加熱至95℃反應(yīng)5min，然后逐漸冷卻至室溫)；組3是組1加入100ug/mL的氧化石墨烯測(cè)得的熒光強(qiáng)度值；組4是組2加入100ug/mL的氧化石墨烯測(cè)得的熒光強(qiáng)度值；組5是組2僅加入某一種金屬后，再加入100ug/mL的氧化石墨烯測(cè)得的熒光強(qiáng)度值；組6是組2加入三種金屬后，再加入100ug/mL的氧化石墨烯測(cè)得的熒光強(qiáng)度值。

由組1與組2對(duì)比可以看出，本發(fā)明形成”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)的熒光生物探針的熒光強(qiáng)度未受影響；由組1和組3、組2和組4的對(duì)比可以看出，與單個(gè)核酸片段相比，本發(fā)明的熒光生物探針由于形成”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)，加入氧化石墨烯后熒光猝滅率顯著降低；由組5與組6的對(duì)比可以看出，多種金屬存在下并不影響本發(fā)明熒光生物系統(tǒng)檢測(cè)Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺的專(zhuān)屬性。本發(fā)明提供的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)可以同時(shí)地、專(zhuān)屬地檢測(cè)環(huán)境中的Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺三種金屬離子。

實(shí)施例3本發(fā)明熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)的選擇性分析

分別將目標(biāo)離子100μMCu²⁺濃度、2000μMMg²⁺濃度和500nM Pb²⁺，干擾離子100μM的Mn²⁺,Ca²⁺,Hg²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Sn²⁺溶液與本發(fā)明熒光生物探針S1、S2、S3(均為50nmol/L)的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl₂)混合均勻，室溫下孵化5min，隨后加入100μg/mL GO的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5，含50mmol/L MgCl2)混合均勻后，孵化25min。用熒光光度計(jì)檢測(cè)熒光發(fā)射光譜。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，該系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)離子Cu²⁺,Mg²⁺，Pb²⁺具有良好的熒光信號(hào)響應(yīng)，干擾離子(Mn²⁺,Ca²⁺,Hg²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Sn²⁺)的熒光信號(hào)響應(yīng)不明顯，因此，本發(fā)明提供的熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)具高度的靈敏性和選擇性，可以從復(fù)雜的金屬離子樣品中高度靈敏和選擇地檢測(cè)出Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺及其濃度。

實(shí)施例4本發(fā)明熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)的參數(shù)測(cè)定

室溫下，將熒光生物探針S1、S2和S3的Tris-HCl緩沖溶液(50nmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl₂)混合均勻，孵化10min，測(cè)定熒光強(qiáng)度值F₀，加入實(shí)施例1方法制得的不同濃度的氧化石墨烯混合均勻，孵化25min，測(cè)定熒光強(qiáng)度值F，以猝滅效率Q＝(F₀-F)/F₀為縱坐標(biāo)，以氧化石墨烯濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)定氧化石墨烯濃度對(duì)本發(fā)明熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6，其中熒光生物探針S1、S2和S3在使用前均加熱至95℃反應(yīng)5min，然后逐漸冷卻至室溫，以便形成”Y”字形剛性雙鏈結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明，氧化石墨烯對(duì)三種熒光基團(tuán)的猝滅效率基本相似，隨著氧化石墨烯濃度的升高，本熒光生物檢測(cè)系統(tǒng)的熒光猝滅效率逐漸增高，并趨于穩(wěn)定，當(dāng)氧化石墨烯濃度為60ug/mL時(shí)，熒光猝滅效率超過(guò)80％，當(dāng)氧化石墨烯濃度為100ug/mL時(shí)，熒光猝滅效率趨近90％。

實(shí)施例5Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺濃度的測(cè)定

步驟a：分別配制Cu²⁺濃度為0.5uM、5uM、10uM、20uM、50uM和100uM的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、Mg²⁺濃度為20uM、100uM、500uM、1000uM、1500uM和2000uM的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、Pb²⁺濃度為1nM、20nM、100nM、200nM、300nM和500nM的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

步驟b：分別將不同Cu²⁺濃度、Mg²⁺濃度和Pb²⁺濃度的溶液與本發(fā)明熒光生物探針S1、S2、S3(均為50nmol/L)的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl2)混合均勻，室溫下孵化5min，隨后加入100μg/mL GO的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5，含50mmol/L MgCl2)混合均勻后，孵化25min。用熒光光度計(jì)檢測(cè)熒光發(fā)射光譜，結(jié)果見(jiàn)圖6a、7a和8a，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)6b、7b和8b，Cu²⁺濃度在0.5-100uM(R²＝0.994)的范圍內(nèi)，Mg²⁺濃度在20-2000uM(R²＝0.995)的范圍內(nèi)、Pb²⁺濃度在1-500nM(R²＝0.993)的范圍內(nèi)，本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，Cu²⁺的最低檢出限為0.1uM(3倍空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差)，Mg²⁺的最低檢出限為5uM(3倍空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差)，Pb²⁺的最低檢出限為0.3nM(3倍空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

步驟c：將待測(cè)品用步驟b的生物檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定待測(cè)品中的Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺濃度。

以上描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種變型，這些變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 重慶工商大學(xué)

<120> 一種同時(shí)檢測(cè)Cu2+、Mg2+和Pb2+三種離子的熒光生物探針及其檢測(cè)方法

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttctctctra ggacaaaaca tctcttctcc gagccggtcg aaatagtgag t 50

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actcactatra ggaagagatg ggtaagcctg ggcctctttc tttttaagaa agaac 55

<210> 3

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcttctttc taatacggct taccttttgt cagcgatccg gaacggcacc catgtgagag 60

aa 62