本發(fā)明涉及的一種方法，尤其涉及一種建立膿腫分枝桿菌RUO數據庫和構建亞型的超級圖譜的方法。
背景技術：
膿腫分枝桿菌感染近年來呈明顯的上升態(tài)勢。過去的十幾年中，盡管全球范圍內結核病的防治已使其傳播和流行有所控制，但非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)感染的發(fā)病率卻迅速增長，尤其是免疫功能低下，以及內鏡、手術、移植等侵入性操作增加，患者NTM感染率上升，成為臨床不可忽視的疾病。NTM分為快速生長型(rapidly growing mycobacteria，RGM)和緩慢生長型，其中RGM被認為是更重要的人類致病菌。RGM感染中約65-80％是由膿腫分枝桿菌感染引起的。
美國的研究顯示超過80％的RGM是由膿腫分枝桿菌引起，臺灣地區(qū)、韓國NTM臨床分離菌株中膿腫分枝桿菌在RGM中居首。膿腫分枝桿菌感染主要包括肺部和皮膚軟組織感染。另外淋巴結、神經系統(tǒng)和骨關節(jié)感染也有報道。更為嚴重的是膿腫分枝桿菌可以導致手術后傷口的暴發(fā)感染，以及肺囊性纖維化患者的移植后播散性感染，2004年至2008年間，巴西政府報道了約2000名患者手術部位膿腫分枝桿菌感染，一度出現膿腫分枝桿菌暴發(fā)流行。
膿腫分枝桿菌不僅致病性和播散性極強，也是RGM中耐藥性最強的病原體，被稱為“抗生素的噩夢(antibiotic nightmare)”，它對大多數一線抗生素耐藥，對抗結核藥物天然耐藥，一度缺乏有效的治療手段。
新一代的大環(huán)內酯類藥物克拉霉素是目前較為公認的膿腫分枝桿菌感染治療的核心藥物，也是唯一證明口服有效的抗生素，2007年美國胸科醫(yī)師協(xié)會(American Thoracic Society，ATS)關于膿腫分枝桿菌感染的治療指南中，克拉霉素被推薦作為治療膿腫分枝桿菌感染聯(lián)合用藥的基礎，如克拉霉素聯(lián)合阿米卡星、頭孢西丁、利奈唑胺等。因此在膿腫分枝桿菌復合耐藥機制當中，對大環(huán)內酯類抗生素的耐藥性尤其值得注意。
目前的研究表明，膿腫分枝桿菌對以克拉霉素為代表的大環(huán)內酯類的獲得性耐藥往往與23SrRNA基因的突變有關，而其對克拉霉素的天然耐藥則主要與紅霉素甲基化酶(erythromycin methylase，erm)基因相關。因此目前認為其相關基因表達決定了其藥物敏感性，而膿腫分枝桿菌復合群的抗生素耐藥與它的生物分類學密切相關。
膿腫分枝桿菌復合群可被分為3個亞型，分別為：膿腫分枝桿菌馬賽亞種，膿腫分枝桿菌bolletii亞種，和膿腫分枝桿菌膿腫亞種。在基因方面，3個亞種間最值得關注的區(qū)別在于，膿腫亞種和bolletii亞種具有完整的erm基因，而馬賽亞種所具有的erm基因在兩個位置發(fā)生了276bps的缺失突變，使它的erm基因相較另2個亞種是不完整的。在藥物敏感性方面，3個亞種都會因為23S rRNA基因A2085位置的突變而產生獲得性克拉霉素耐藥，這一突變在馬賽亞種中更為常見。然而，馬賽亞種由于其具有的不完整而無法被激活的erm基因，不會在應用大環(huán)內酯類抗生素后產生誘導性耐藥，而膿腫亞種則會在暴露于大環(huán)內酯類抗生素一段時間后發(fā)生誘導性耐藥。因此，對于不同的亞種所導致的肺部疾病，應用以大環(huán)內酯類抗生素為基礎的治療方案會取得截然不同的治療效果。由此可知，在膿腫分枝桿菌的治療策略的制定中，深入到亞種層面的菌種鑒定和體外藥敏實驗同樣非常重要。
但是，目前為止，將膿腫分枝桿菌復合群鑒定到亞種層面依舊是個頗具爭論性的議題。雖然現在使用PCR方法對erm基因進行擴增，已經可以將馬賽亞種與膿腫亞種和bolletii亞種區(qū)分開來，但仍然需要應用各種分子學方法對幾個管家基因，如rpoB基因、hsp65基因等進行序列分析。
這些以基因分析為基礎的分子學分型方法，都比較昂貴且需要較長的時間得出結果，所以在一般的微生物實驗室中顯得不是非常實用且難以普及。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的是解決現有技術中的問題，提供一種建立膿腫分枝桿菌RUO(研究用)數據庫和構建亞型的超級圖譜的方法。
本發(fā)明的技術方案是：建立膿腫分枝桿菌RUO數據庫和構建亞型的超級圖譜的方法，其特征在于：包括如下步驟：
步驟1：膿腫分枝桿菌菌株收集和DNA抽提
1-1、膿腫分枝桿菌菌株的收集
收集膿腫分枝桿菌菌株300株，菌株由痰標本和肺泡灌洗液中分離并收集；
從患者處獲得的檢測樣本在經過NaOH簡化處理后，被接種到斜面羅氏培養(yǎng)基上，生長出的菌落在顯微鏡下確認為抗酸桿菌；
接下來，篩選出的陽性菌落轉接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，并在37℃條件下培養(yǎng)3至7天；
1-2、DNA抽提
將10微升生長在羅氏培養(yǎng)基上的菌環(huán)轉移到含有1毫升TE【即10毫摩爾的三(羥甲基)氨基甲烷與1毫摩爾的乙二胺四乙酸組成的混合液】和玻璃念珠的離心管中；將離心管置于漩渦振蕩機上振蕩10分鐘使細菌充分懸浮；吸取400微升的細菌懸液至新的離心管中，加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，在溫度為37℃的環(huán)境下過夜；
加入70微升十二烷基硫酸鈉和10微升蛋白分解酶，在溫度為65℃的環(huán)境下孵育20分鐘，加入100微升十六烷基三甲基溴化銨和氯化鈉的混合物，然后迅速加入100μ微升氯化鈉；
吹打懸液至牛奶狀，然后在溫度為65℃的環(huán)境下孵育10分鐘；加入750微升氯仿-異戊醇(24:1)的混合液，漩渦振蕩，室溫13000轉離心5分鐘；
吸取上清至新的離心管中，加入0.6倍體積的異戊醇，在-20℃孵育20分鐘，然后13000轉離心15分鐘；棄上清，用乙醇洗滌，13000轉離心5分鐘；
用200微升TE溶解沉淀，使用微量分光光度計對DNA進行定量，OD260/280值在1.8～2.0區(qū)間，濃度>6ug的DNA用來擴增使用；
步驟2：基因文庫制備和illumina HiSeq(illumina是公司名字，HiSeq是高通量測序的簡寫，代表測序平臺，這兩個在一起就代表這個公司的測序平臺)測序
至少3μg DNA用來Illumina雙末端測序的文庫制備，據Illumina標準的基因DNA文庫制備流程，400bp長度的DNA片段用來雙末端測序；
利用樣品處理系統(tǒng)將DNA剪切成需要的DNA小片段；然后對DNA片段的3’末端添加一個“A”，兩端加接頭；DNA片段可以通過凝膠電泳提純，并且通過PCR(聚合酶鏈式反應)擴增以達到上樣量；最后，對定量的Illumina雙末端文庫進行Illumina Hiseq測序；
步驟3：基因組建立與系統(tǒng)進化樹構建
計算實驗菌株與標準菌株之間的基因差異；菌種的系統(tǒng)生成樹則應用非加權組平均法構建而成；通用標準株序列ATCC19977、CIP18297和CIP108541作為膿腫分枝桿菌亞型的參照序列，而H37Rv則作為其他菌種的參照序列；
步驟4：樣本準備和對菌株的檢測
吸取1微升含分枝桿菌的羅氏培養(yǎng)基至含有800微升乙醇和250微升玻璃念珠的微量離心管中；
將混懸液轉移至新的離心管中，13000轉離心5分鐘；移除上清，干燥10分鐘，用10微升甲酸溶解沉淀，室溫孵育2到5分鐘；加入10微升乙腈，10000轉離心3分鐘；吸取1微升上清液至目標板上，充分干燥，并用1微升CHCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)基質液覆蓋；
每一塊樣本板在進行檢測之前，都提前使用大腸桿菌的標準株進行儀器參數校準和器械調整；在收集到質譜圖信號后，數據即由收集站傳輸至分析系統(tǒng)，數據由此以峰值信號的形式展現出來；收集到的質譜圖數據與RUO數據庫進行比對后，生成菌種的鑒定結果；
在收集到的臨床菌株質譜數據中，經過挑選的40株膿腫亞種和20株馬賽亞種的圖譜數據分別按照亞種分組并輸入RUO數據庫中；在數據庫原有的微生物分類樹中的膿腫分枝桿菌下新建了2個亞種的文件夾，并分別將導入的質譜數據加入新建的文件夾中；
隨后，分別在2個亞種間，挑選出40個100％出現在亞種圖譜數據之內的峰值信號， 以此為基礎創(chuàng)建了2個亞種的超級圖譜，所有新導入的圖譜數據和新構建的超級圖譜都被激活以用于隨后的鑒定工作；
步驟5：準確性的確認
更新后的數據庫，包括了新導入的質譜圖數據組和2個新創(chuàng)建的超級圖譜，準確性的評估由余下的240株臨床菌株的盲測完成；此300株臨床菌株樣本，包括已導入數據庫的60株和240株盲測菌株，都通過WGS(全基因組測序)鑒定到亞種層面。
本發(fā)明通過分析明確膿腫分枝桿菌亞種；通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測亞種信息，建立RUO數據庫和構建出的超級圖譜，并通過菌株盲測檢驗其敏感性和特異性，制定用于亞種層面實驗室鑒定的操作流程及診斷標準，并加入微生物標準體外診斷流程的工作鏈，提高了各微生物實驗室對膿腫分枝桿菌亞型鑒定的效率。
具體實施方式
為了使本發(fā)明實現的技術手段、技術特征、發(fā)明目的與技術效果易于明白了解，下面進一步闡述本發(fā)明。
建立膿腫分枝桿菌RUO數據庫和構建亞型的超級圖譜的方法，其特征在于：包括如下步驟：
步驟1：菌株收集和DNA抽提
1.1菌株收集
收集膿腫分枝桿菌菌株300株，菌株由痰標本和肺泡灌洗液中分離并收集。
收集的臨床菌株均以MGIT960培養(yǎng)基和對硝基甲苯酸(PNB)試驗篩選為非結核分枝桿菌，所有樣本均通過rpoB基因測序分析進一步堅定為膿腫分枝桿菌復合群。
從患者處獲得的檢測樣本在經過4％NaOH簡化處理后，被接種到斜面羅氏培養(yǎng)基(L-J medium)上，生長出的菌落在顯微鏡下確認為抗酸桿菌。
接下來，篩選出的陽性菌落轉接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，并在37℃條件下培養(yǎng)3至7天，用于隨后的DNA抽提分析和MALDI-TOF MS鑒定檢測。
1.2DNA抽提
將10微升生長在羅氏培養(yǎng)基(L-J培養(yǎng)基)上的菌環(huán)轉移到含有1毫升TE(10mMTris10,1mMEDTA[pH 8.0])和250微升0.5mm玻璃念珠的離心管中。
將離心管置于漩渦振蕩機上振蕩10分鐘使細菌充分懸浮。
吸取400微升的細菌懸液至新的離心管中，加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，37°過夜。
加入70微升10％十二烷基硫酸鈉和10微升蛋白分解酶K(10mg/ml)，65°孵育20分鐘。加入100微升,十六烷基三甲基溴化銨(10％CTAB)和氯化鈉(0.7M)的混合物，然后迅速加入100μ微升氯化鈉(0.5M)。
吹打懸液至牛奶狀，然后65°孵育10分鐘。加入750微升氯仿-異戊醇(24:1)的混合液，漩渦振蕩，室溫13000轉離心5分鐘。
吸取上清至新的離心管中，加入0.6倍體積的異戊醇。-20°孵育20分鐘，然后13000轉離心15分鐘。棄上清，用70％乙醇洗滌，13000轉離心5分鐘。
用200微升TE(10mMTris 10,1mMEDTA[pH 8.0])溶解沉淀。使用微量分光光度計(NanoDrop？2000/2000c Spectrophotometers(Thermo Fisher Scientific.,Delaware,USA))對DNA進行定量。OD260/280值在1.8～2.0區(qū)間，濃度>6ug的DNA用來擴增(350to450bp)使用。
步驟2：基因文庫制備和illumina HiSeq測序
至少3μgDNA用來Illumina雙末端測序的文庫制備。根據Illumina標準的基因DNA文庫制備流程，400bp長度的DNA片段用來雙末端測序。
利用高性能樣品處理系統(tǒng)將DNA剪切成需要的DNA小片段，用T4DNA聚合酶 將DNA鏈突出末端平滑化。然后對平滑化的DNA片段的3’末端添加一個“A”，兩端加接頭。DNA片段可以通過凝膠電泳提純，并且通過PCR擴增以達到上樣量。最后，對定量的Illumina雙末端文庫進行Illumina Hiseq測序(150*2)。
步驟3：基因組建立與系統(tǒng)進化樹構建
利用相關軟件計算實驗菌株與標準菌株之間的基因差異。菌種的系統(tǒng)生成樹則應用非加權組平均法(UPGMA)構建而成。通用標準株序列ATCC19977、CIP18297和CIP108541作為膿腫分枝桿菌亞型的參照序列，而H37Rv則作為其他菌種的參照序列。
步驟4：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)
4.1樣本準備
首先制備樣本，吸取1微升含分枝桿菌的羅氏培養(yǎng)基(L-J培養(yǎng)基)至含有800微升70％乙醇和250微升玻璃念珠的微量離心管中。漩渦振蕩15分鐘，然后室溫孵育10分鐘，漩渦振蕩10s。將混懸液轉移至新的離心管中，13000轉離心5分鐘。移除上清，干燥10分鐘，用10微升70％甲酸溶解沉淀，室溫孵育2到5分鐘。加入10微升乙腈，10000轉離心3分鐘。吸取1微升上清液至目標板上，充分干燥，并用1微升CHCA基質液覆蓋。
4.2采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)對菌株的檢測對菌株的檢測
使用Vitek MS Plus system(bioMérieux SA,Marcy l’Etoile,France)系統(tǒng)進行檢測。Vitek MS系統(tǒng)應用50Hz線性正離子模式的激光收集2000至20000m/z的圖譜數據。每一塊樣本板在進行檢測之前，都提前使用大腸桿菌的標準株ACTT8739進行儀器參數校準和器械調整。在收集到質譜圖信號后，數據即由Vitek MS收集站傳輸至SARAMIS分析系統(tǒng)，數據由此以峰值信號的形式展現出來。收集到的質譜圖數據與SARAMIS 4.12research use only(RUO)數據庫進行比對后，生成菌種的鑒定結果。
4.3質譜數據庫的更新
質譜圖的分析應用research-use-only(RUO)Saramis Knowledge Base(bioMérieuxSA) database V.4.12數據庫完成。在收集到的臨床菌株質譜數據中，經過挑選的40株膿腫亞種和20株馬賽亞種的圖譜數據分別按照亞種分組并輸入RUO數據庫中。我們在數據庫原有的微生物分類樹中的膿腫分枝桿菌下新建了2個亞種的文件夾，并分別將導入的質譜數據加入新建的文件夾中。隨后，我們分別在2個亞種間，挑選出40個100％出現在亞種圖譜數據之內的峰值信號，以此為基礎創(chuàng)建了2個亞種的超級圖譜(Superspectrum)。所有新導入的圖譜數據和新構建的超級圖譜都被激活以用于隨后的鑒定工作。
步驟5：準確性確認
更新后的數據庫，包括了新導入的質譜圖數據組和2個新創(chuàng)建的超級圖譜，準確性的評估由余下的240株臨床菌株的盲測完成。此300株臨床菌株樣本，包括已導入數據庫的60株和240株盲測菌株，都通過WGS鑒定到亞種層面。
本發(fā)明通過分析明確膿腫分枝桿菌亞種；通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測亞種信息，建立RUO數據庫和構建出的超級圖譜，并通過菌株盲測檢驗其敏感性和特異性，制定用于亞種層面實驗室鑒定的操作流程及診斷標準，并加入微生物標準體外診斷流程的工作鏈，提高了各微生物實驗室對膿腫分枝桿菌亞型鑒定的效率。
綜上所述僅為本發(fā)明較佳的實施例，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內容所作的等效變化及修飾，皆應屬于本發(fā)明的技術范疇。