本發(fā)明涉及鐵線蓮檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種鐵線蓮不同藥用部位總黃酮含量的快速檢測方法。

背景技術(shù)：

毛茛科鐵線蓮屬植物為多年生木質(zhì)藤本，少數(shù)為草本、灌木或亞灌木。全球有350多種，我國有約150種，分布于全國各地，以西南地區(qū)為主。本屬植物部分可作藥用，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活血、消腫止痛等功效?！吨袊幍洹钒媸蛰d的有威靈仙、棉團鐵線蓮、東北鐵線蓮、小木通和繡球藤。鐵線蓮屬植物的藥理作用與其化學(xué)成分相關(guān)，鐵線蓮屬植物化學(xué)成分復(fù)雜，主要為皂苷類、黃酮類、木脂素。此外還包括揮發(fā)油、特有成分及花色苷、香豆素、生物堿、有機酸類、烷烴等其他化合物。黃酮類化合物廣泛存在于自然界中，是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4000余種黃酮類化合物，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實中。黃酮類化合物具有抗氧化、消除自由基、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗癌防癌、抗炎免疫及抗衰老等功效，還具有吸收紫外輻射、止咳、祛痰、瀉下、解痙、提高記憶力、抗過敏、活血化瘀、利膽及肝等作用。我國鐵線蓮屬植物資源豐富，因此有必要進一步拓展其研究范圍，檢測不同來源的鐵線蓮黃酮總含量，為其藥用植物資源的開發(fā)利用提供新的理論依據(jù)。線蓮屬不同藥用部位化學(xué)成分的開發(fā)利用和鐵線蓮屬植物資源利用率的進一步提高，為鐵線蓮屬不同藥用種類、不同藥用部位及藥用植物親緣關(guān)系的深入研究提供參考依據(jù)。此外，我國民間作藥用的尚40有余種，通常以根莖和莖藤入藥，存在比較嚴重的混用現(xiàn)象。因此，有必要建立準(zhǔn)確可靠的檢測方法以鑒別此類藥材的來源。

傳統(tǒng)的鐵線蓮總黃酮含量的測定方法根據(jù)GB/T 20574-2006的分光光度比色法，將新鮮材料洗凈、烘干，藥材粉碎成粉末；精密稱取2.000g，置索氏提取器中；加適量乙醚提取至無色，棄去醚液，藥渣揮去乙醚，加適量甲醇繼續(xù)提取至無色，將提取液轉(zhuǎn)移至25m L容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻；精確制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以品蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品，獲得不同的濃度梯度，15min以后于508nm處測定吸光度，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得到方程A＝0.00115C+0.0034，r＝0.9999；以待測試樣本在波長508nm處測定吸光度值，利用方程得到相應(yīng)的濃度。該方法樣本預(yù)處理過程和測量過程費時、費力、化學(xué)消耗品昂貴，且對環(huán)境造成一定污染。因此，急需研究一種簡單、快速、無損的鐵線蓮總黃酮含量的檢測方法和技術(shù)。

中紅外光譜來自分子振動的基頻，具有分子結(jié)構(gòu)的特征性，不同的化合物對紅外吸收光譜有差異性，因此，根據(jù)化合物的光譜，就可以判別、確定該化合物是都存在，從而定性分析有機化合物的組成和結(jié)構(gòu)，根據(jù)物種組分的吸收強度，可實現(xiàn)對化合物的定量分析。光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、石油化工、制藥、飼料等行業(yè)，特別在植物的品質(zhì)檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種鐵線蓮不同藥用部位總黃酮含量的快速檢測方法，解決了現(xiàn)有檢測方法費時、費力、操作復(fù)雜、污染環(huán)境等問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案如下：

一種鐵線蓮不同藥用部位總黃酮含量的快速檢測方法，包括步驟：

(1)將不同來源的鐵線蓮藥用部位的樣本100～110℃徹底烘干后粉碎，得到粉末待測樣本；

(2)將0.02g的粉末樣本與0.98g的溴化鉀(KBr)在研缽中研磨至充分混合，取適量粉末用壓片機制成高透明度、厚度均勻的壓片，優(yōu)選的厚度為5mm，并放置于Jasco FTIR 4100傅立葉變換光譜儀的樣本槽中進行中紅外光譜數(shù)據(jù)的采集；

(3)根據(jù)測試樣本的紅外吸收光譜，提取總黃酮的特征吸收峰的透射率，獲得各個特征吸收峰的吸光度；

(4)建立總黃酮含量與各個吸光度之間的線性回歸模型；

應(yīng)用權(quán)重回歸系數(shù)算法在4 00～4000cm^-1波長范圍內(nèi)進行特征波長的選取，得到的特征波長分別為766cm^-1，818cm^-1，882cm^-1，1186cm^-1，1542cm^-1，1954cm^-1，2313cm^-1，2399cm^-1，3536cm^-1，3682cm^-1和3791cm^-1；將上述波長的反射率值作為多元線性回歸模型的輸入變量，實際測量的總黃酮含量作為輸出變量，計算得到多元線性回歸方程。

(5)獲取待測樣本在總黃酮的特征吸收峰處的吸光度，根據(jù)所述的線性回歸模型，計算得到待測樣品中總黃酮的含量。

中紅外光譜中的指紋區(qū)域包涵了大量集團的彎曲振動，譜帶的性質(zhì)與化合物及其聚合體存在一一對應(yīng)的關(guān)系，可以通過該波段的光譜精確辨認物質(zhì)所含化合物成分。但是單獨通過某一測試樣本的紅外光譜很難準(zhǔn)確的確定總黃酮的特征吸收峰，本發(fā)明步驟(1)中通過對大樣本進行統(tǒng)計學(xué)分析。通常樣本數(shù)量越多，特征吸收峰判定越準(zhǔn)確，但是這樣會導(dǎo)致計算量大，效率低。因此測試樣本的數(shù)量需要根據(jù)實際情況考慮，本發(fā)明樣本由南京植物園苗圃中的總黃酮含量不同的150種鐵線蓮栽培種和30種野生種構(gòu)成。通過Kennard-Stone算法，按照2:1的比例將樣本劃分為建模集和預(yù)測集，分別包含120個與60個樣本；在步驟(4)中采用建模集建立所述的線性回歸模型，在步驟(5)中計算預(yù)測集樣本中總黃酮的含量。

根據(jù)所有測試樣本的紅外吸收光譜，提取總黃酮含量的特征吸收峰，作為優(yōu)選，提取的特征吸收峰的個數(shù)為11個，分別在766cm^-1，818cm^-1，882cm^-1，1186cm^-1，1542cm^-1，1954cm^-1，2313cm^-1，2399cm^-1，3536cm^-1，3682cm^-1，3791cm^-1處。

將上述波長的反射率值作為多元線性回歸模型的輸入變量，實際測量的總黃酮含量作為輸出變量，計算得到多元線性回歸方程。所述的線性回歸模型為：

Y＝-7.16269-1.893λ₁-2.494λ₂+6.932λ₃

-8.180λ₄-1.953λ₅+3.413λ₆-1.341λ₇

-3.2199λ₈+1.321λ₉-6.424λ₁₀-3.565λ₁₁

其中Y為總黃酮含量，單位為％；λ₁～λ₁₁分別為紅外吸收光譜中所對應(yīng)的鐵線蓮粉末樣本的反射率計算所得的吸光度。

利用本發(fā)明的線性回歸模型對若干樣本的總黃酮含量進行預(yù)測，對各個樣本的預(yù)測值與實際值進行線性擬合，該擬合曲線的相關(guān)系數(shù)(R²)達到了0.915，均方根誤差(RMSE)達到了0.039，說明本發(fā)明的線性回歸模型能夠有效的檢測鐵線蓮中總黃酮含量，可大幅縮短檢測的時間，減少了環(huán)境污染，降低了檢測成本。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)操作簡單，避免了傳統(tǒng)總黃酮含量測量的樣品制備的繁瑣過程，為快速有效地實時監(jiān)測鐵線蓮總黃酮含量提供有效手段，具有良好的應(yīng)用前景；

(2)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，易于操作，且系統(tǒng)維護成本低廉，基本實現(xiàn)自動化檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明專利所用的技術(shù)路線圖；

圖2為本發(fā)明建模集樣本預(yù)測結(jié)果散點分布圖；

圖3為本發(fā)明預(yù)測集樣本預(yù)測結(jié)果散點分布圖。

具體實施方式

為所采集的樣本具有代表性和多樣性，隨機收集180種鐵線蓮屬的植物，包括了南京植物園苗圃栽培的150種鐵線蓮栽培品種和30種野生鐵線蓮。鐵線蓮屬不同藥用種類、不同藥用部位的總黃酮含量都有差別，可以使樣本中總黃酮總量具有更大的范圍，使得所建模型具有更好的適應(yīng)性和魯棒性。

下面結(jié)合附圖1-3和實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述：

(1)線性回歸模型的建立：

將鐵線蓮不同藥用部位碾碎成粉末，共獲得180個樣本。將各個測試樣本0.02g與溴化鉀晶體(KBr)0.98g的混合，充分研磨，壓片；對各個測試樣本的壓片在400～4000cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進行紅外掃描，得到透射率，并轉(zhuǎn)換為吸光度值(A)。

同時利用背景技術(shù)所提及的傳統(tǒng)方法測量所有樣本的總黃酮含量。然后利用Kennard-Stone算法選擇120個樣本作為建模集樣本，其余60個作為預(yù)測集樣本，以建模集樣本120個樣本的各特征波長的反射率值作為輸入變量，以相應(yīng)的測量的總黃酮含量作為輸出變量，利用多元線性回歸法(Multiple linearregression，MLR)得到如下多元線性回歸方程：

Y＝-7.16269-1.893λ₁-2.494λ₂+6.932λ₃

-8.180λ₄-1.953λ₅+3.413λ₆-1.341λ₇

-3.2199λ₈+1.321λ₉-6.424λ₁₀-3.565λ₁₁

其中，Y為總黃酮含量；λ₁～λ₁₁分別為766cm^-1，818cm^-1，882cm^-1，1186cm^-1，1542cm^-1，1954cm^-1，2313cm^-1，2399cm^-1，3536cm^-1，3682cm^-1，3791cm^-1處所對應(yīng)的鐵線蓮粉末樣本的吸光度值。

獲取待測樣本在總黃酮的特征吸收峰處的吸光度后，可根據(jù)線性回歸模型，計算得到待測樣品中總黃酮的含量。

(2)線性回歸模型的檢驗：

然后利用上述多元線性回歸方程對建模集和預(yù)測集樣本的總黃酮總量進行預(yù)測，并對預(yù)測結(jié)果進行評價。預(yù)測結(jié)果如下表所示：

鐵線蓮總黃酮含量建模集和預(yù)測集中預(yù)測值與真實化學(xué)方法測量值之間的相關(guān)系數(shù)達到了93.21％和89.47％，獲得了滿意的預(yù)測精度。對建模集和預(yù)測集樣本預(yù)測結(jié)果的散點分布圖如圖2和圖3所示，上述結(jié)果說明應(yīng)用本發(fā)明的方法能夠快速準(zhǔn)確地實現(xiàn)鐵線蓮不同藥用部位中總黃酮含量的有效檢測。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施舉例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。