本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)殺螟硫磷農(nóng)藥殘留的高靈敏電化學(xué)方法，屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，有機(jī)磷農(nóng)藥的大量使用，一方面提高了農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，另一方面也帶來了嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留問題。殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥一方面可以通過飲食、接觸、呼吸等方式進(jìn)入人體，與神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶相互作用，形成磷酸化的乙酰膽堿酯酶復(fù)合物，該復(fù)合物很難水解，這便會(huì)引起膽堿酯酶活性的喪失。失活的膽堿酯酶使底物乙酰膽堿無法降解，導(dǎo)致乙酰膽堿在神經(jīng)突觸上大量積累，干擾神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳導(dǎo)，使神經(jīng)系統(tǒng)無法正?；顒?dòng)，最終嚴(yán)重威脅人民群眾的身體健康和生命安全。另一方面，農(nóng)藥施用后，除一部分作用于靶標(biāo)生物外，大部分會(huì)進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)尤其是土壤、水、空氣中而造成污染，從而對(duì)我國(guó)的環(huán)境也造成了極大的影響。所以，先進(jìn)的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)顯得十分重要。

目前傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)有：氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）等方法。這些方法雖能有效的對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行痕量分析，但也都有以下缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴、對(duì)操作人員技術(shù)要求高、樣品預(yù)處理要求嚴(yán)格、檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高等。因此，新型的電化學(xué)分析方法便應(yīng)運(yùn)而生。與傳統(tǒng)方法相比，電化學(xué)檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，更能實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的就地檢測(cè)，因而被廣泛使用。

納米材料是指三維空間中至少有一維處于納米尺度（1~100nm）范圍或者由該尺度范圍的物質(zhì)為基本結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的材料的總稱。納米材料在光、電、磁、熱、力學(xué)、機(jī)械等方面性能與普通材料大不相同，使其能在各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。其中金屬納米粒子一直被廣泛地用于電化學(xué)分析檢測(cè)中。金納米棒（AuNRs）由大量的貴金屬粒子金組合而成，其作為一種一維金納米材料，由于可調(diào)的長(zhǎng)徑、短徑、長(zhǎng)徑比以及分布范圍，使它具備了不同于普通金納米粒子的電化學(xué)性質(zhì)。此外，金納米棒具有優(yōu)良的導(dǎo)電性，將其用于電化學(xué)檢測(cè)能大大增加檢測(cè)靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便，快速，靈敏的檢測(cè)殺螟硫磷農(nóng)藥殘留的電化學(xué)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種快速檢測(cè)殺螟硫磷農(nóng)藥殘留的高靈敏電化學(xué)方法，按照下述步驟進(jìn)行：

(1)殼聚糖溶液的制備

醋酸加入到二次蒸餾水中，制備體積濃度為1% 醋酸溶液。取1% 醋酸溶液，加入殼聚糖，超聲攪拌，直至其溶解，制得質(zhì)量與體積比為1% 的殼聚糖溶液（W/V），并置于4 ℃的冰箱中保存。

(2) AuNRs /CS混合液的合成

將AuNRs 溶液和上述殼聚糖溶液混合，超聲30 min，使其混合均勻，并置于4 ℃的冰箱中保存。

其中步驟（2）中AuNRs長(zhǎng)寬比值約為3.4、濃度為185.1μg mL^-1，AuNRs 溶液與殼聚糖溶液的體積比為5:1。

(3) 工作電極預(yù)處理

將裸玻碳電極（GCE）依次用粒徑為0.3 μm、0.05 μm的氧化鋁粉末反復(fù)打磨至鏡面，再依次用體積比為1:1 的HNO₃水溶液、質(zhì)量濃度為95% 的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗5 min。然后用0.5 M H₂SO₄對(duì)裸電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描范圍為0.5-1.5 V，直至電極的循環(huán)伏安圖穩(wěn)定。再用質(zhì)量濃度為95% 的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗5 min，最后用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

(4) 工作電極的修飾

將（2）中所得AuNRs /CS混合液滴涂于玻碳電極表面，并置于4 ℃的冰箱中干燥保存。

其中步驟（4）中滴涂于電極表面的AuNRs /CS混合液體積為7μL。

(5) 傳感器的制備及殺螟硫磷的檢測(cè)

將（4）中已制備好的電極置于一定濃度的殺螟硫磷溶液中，用轉(zhuǎn)子進(jìn)行攪拌吸附。

其中步驟（5）中AuNRs /CS/GCE在殺螟硫磷溶液中攪拌吸附的時(shí)間為5 min。

(6) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將（5）中制得的殺螟硫磷/ AuNRs/ CS/ GCE電極作為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，組成三電極體系。將該三電極體系置于KCl 電解質(zhì)溶液中進(jìn)行方波伏安法（SWV）檢測(cè)。以殺螟硫磷濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰電流為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而獲得相應(yīng)的線性回歸方程。

其中步驟（6）中KCl 電解質(zhì)溶液的pH 值為6.5。

其中步驟（6）中SWV檢測(cè)的條件是：掃描電位-0.5 V至0.6 V，電位階差4 mv，頻率25 HZ，振幅60 mv。

其中步驟（6）中不同濃度殺螟硫磷的濃度分別為濃度分別為5，20，60，100，140，180，250，300 ng mL^-1。

(7) 樣品的檢測(cè)

在超市購(gòu)買生菜、油菜做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分別稱取0.5 g切碎的蔬菜樣品，向其中加入1 mL 95％乙醇進(jìn)行萃取，超聲處理30 min。然后高速離心（10 min，4000 rpm），取上清液直接進(jìn)行農(nóng)藥含量測(cè)定。然后向上清液樣品中分別加入10 ng，20 ng 殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，再次進(jìn)行農(nóng)藥含量測(cè)定，進(jìn)而獲得殺螟硫磷的回收率。

采用上述的快速檢測(cè)殺螟硫磷農(nóng)藥殘留的高靈敏電化學(xué)方法后，其特征在于：電化學(xué)傳感器工作曲線的建立以及對(duì)實(shí)際蔬菜樣品的檢測(cè)；所制備的電化學(xué)傳感器的工作曲線為：當(dāng)殺螟硫磷農(nóng)藥濃度為5~300 ng mL^-1時(shí)，其線性方程為：y = 0.66714 x + 0.01605，檢測(cè)限為：1.74 ng mL^-1。

原理：許多農(nóng)藥或其衍生物含有硝基、苯環(huán)以及鹵素等具有電化學(xué)活性的基團(tuán)，它們?cè)陔姌O表面具有良好的氧化還原性。該技術(shù)利用殺螟硫磷本身的電化學(xué)活性，以及AuNRs吸附能力強(qiáng)、導(dǎo)電性好等特點(diǎn)，集殺螟硫磷的富集和檢測(cè)于一體。在對(duì)殺螟硫磷農(nóng)藥進(jìn)行SWV電化學(xué)檢測(cè)的過程中，在電催化的作用下，殺螟硫磷在某個(gè)特定電位會(huì)出現(xiàn)氧化還原的信號(hào)，不同濃度的殺螟硫磷產(chǎn)生信號(hào)的大小不同。根據(jù)所得數(shù)據(jù)可獲得相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程，進(jìn)而測(cè)定待測(cè)樣品中殺螟硫磷農(nóng)藥殘留的濃度。如圖1，圖2所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

（1）納米材料具有比表面積大、表面反應(yīng)活性高、催化效率高、吸附能力強(qiáng)等特點(diǎn)，可用來改善傳感器的各方面性能。AuNRs作為新型的納米材料，具有特殊的電學(xué)穩(wěn)定性，并且具有毒性低、生物相容性好、易于生物交聯(lián)和水溶性好的優(yōu)點(diǎn)。因此，AuNRs在電學(xué)傳感器設(shè)計(jì)中具有極大的應(yīng)用前景。

（2）本發(fā)明中構(gòu)建的無酶電化學(xué)傳感器是基于AuNRs材料修飾電極，利用殺螟硫磷本身的電化學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)，因此，傳感器檢測(cè)性能受外界環(huán)境的影響較小，穩(wěn)定性較好。此外，在此電化學(xué)傳感器構(gòu)建過程中，由于修飾電極的方法和納米材料的用量可控，因此其重現(xiàn)性較高。相比于傳統(tǒng)的分析檢測(cè)方法，該技術(shù)用于食品中殺螟硫磷的檢測(cè)大大縮短了分析時(shí)間、操作簡(jiǎn)單、敏度高、成本低，能夠更好的滿足食品安全與衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中快速檢測(cè)殺螟硫磷農(nóng)藥殘留的要求。

附圖說明

圖1是檢測(cè)不同濃度殺螟硫磷的SWV曲線圖，從下至上濃度依次為5，20，60，100，140，180，250，300 ng mL^-1；

圖2是不同濃度殺螟硫磷SWV峰電流的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，具體操作方法如下：

（1）1% 殼聚糖溶液的制備

0.5 mL醋酸加入到49.5 mL二次水中，制備1% 醋酸溶液。取2 mL 1% 醋酸溶液，加入0.02 g 殼聚糖，超聲攪拌，直至其溶解，制得1% 殼聚糖（W/V），并置于4 ℃的冰箱中保存。

(2) AuNRs /CS混合液的合成

將AuNRs 溶液和1% 殼聚糖溶液混合，超聲30 min，使其混合均勻，并置于4 ℃的冰箱中保存。

其中步驟（2）中AuNRs溶液長(zhǎng)寬比為3.4、濃度為185.13μg mL^-1。

其中步驟（2）中AuNRs 溶液及 1% 殼聚糖溶液的體積比為5:1。

（3）工作電極預(yù)處理

將裸玻碳電極依次用粒徑為0.3 μm、0.05 μm的氧化鋁粉末反復(fù)打磨至鏡面，再依次用1:1 HNO₃、95% 乙醇、二次水分別超聲清洗5 min。然后用0.5 M H₂SO₄對(duì)裸電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描范圍為0.5 V—1.5 V，直至電極的循環(huán)伏安圖穩(wěn)定。再用95% 乙醇、去離子水分別超聲清洗5 min，最后用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

（4）工作電極的修飾

將（2）中所得AuNRs /CS混合液滴涂于玻碳電極表面，并置于4 ℃的冰箱中干燥保存。

其中步驟（4）中滴涂于電極表面的AuNRs /CS混合液體積為7μL。

（5）傳感器的制備及殺螟硫磷的檢測(cè)

將（4）中已制備好的電極置于一定濃度的殺螟硫磷溶液中，用轉(zhuǎn)子進(jìn)行攪拌吸附。

其中步驟（5）中AuNRs /CS/GCE在殺螟硫磷溶液中攪拌吸附的時(shí)間為5 min。

（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將（5）中制得的殺螟硫磷/ AuNRs/ CS/ GCE電極作為工作電極，鉑絲電極為輔助電

極，飽和甘汞電極為參比電極，組成三電極體系。將該三電極體系置于pH 6.5 的KCl 電解質(zhì)溶液中進(jìn)行SWV檢測(cè)（掃描電位-0.5 V至0.6 V，電位階差4 mv，頻率25 HZ，振幅60 mv）。以殺螟硫磷濃度為橫坐標(biāo)（濃度分別為5，20，60，100，140，180，250，300 ng mL^-1），對(duì)應(yīng)的峰電流為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而獲得相應(yīng)的線性回歸方程。結(jié)果如下：當(dāng)殺螟硫磷農(nóng)藥濃度為5~300 ng mL^-1時(shí)，其線性方程為：y = 0.66714 x + 0.01605，檢測(cè)限為：1.74 ng mL^-1。

（7）蔬菜樣品的檢測(cè)

在超市購(gòu)買生菜、油菜做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分別稱取0.5 g切碎的蔬菜樣品，向其中加入1 mL 95％乙醇進(jìn)行萃取，超聲處理30 min。然后高速離心（10 min，4000 rpm），取上清液直接進(jìn)行農(nóng)藥含量測(cè)定。然后向上清液樣品中分別加入10 ng，20 ng 殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，再次進(jìn)行農(nóng)藥含量測(cè)定。測(cè)得兩種蔬菜樣品的回收率分別為87.3％,101.9％，93.8％,99.6％。結(jié)果表明該傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)效果良好，可以用于蔬菜中殺螟硫磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

（8）特異性驗(yàn)證試驗(yàn)

選取其他三種溶液：100 ng mL^-1 毒死蜱 、0.1 M SO₄^2-、 0.1 M NO₃^-，作為干擾物質(zhì)來測(cè)定該傳感器的特異性，分別向其中加入100 ng mL^-1 的殺螟硫磷，對(duì)其進(jìn)行SWV檢測(cè)，將所得響應(yīng)電流與檢測(cè)100 ng mL^-1 殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液所得的響應(yīng)電流進(jìn)行對(duì)比。100 ng mL^-1 殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的響應(yīng)電流為2.2735μA，加入其他三種干擾物質(zhì)后，響應(yīng)電流分別為2.1065μA，2.5315μA，2.355μA。結(jié)果表明，該無酶?jìng)鞲衅鲗?duì)殺螟硫磷具有極高的選擇性。

上述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的內(nèi)容，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。