本發(fā)明屬于生物樣品分析分離
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種在紙基分析裝置上等電聚焦和分離兩性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：：等電聚焦是電泳分離方法的主要模式之一，廣泛應(yīng)用于復(fù)雜蛋白質(zhì)的分離、提純以及等電點(diǎn)的表征。借助載體兩性電解質(zhì)形成pH梯度，可使目標(biāo)兩性樣品在其等電點(diǎn)處聚焦，從而實(shí)現(xiàn)兩性樣品的分離?；贗PG（ImmobilizedpHgradient）膠條的等電聚焦法是目前廣泛應(yīng)用的等電聚焦電泳方法，利用膠條上形成的固定的pH梯度進(jìn)行等電聚焦分離。但市售的IPG膠條具有價(jià)格高，在應(yīng)用中分離時(shí)間較長，并且有些蛋白難以回收等缺陷。基于毛細(xì)管的等電聚焦法[1]是通過自由載體兩性電解質(zhì)溶液在毛細(xì)管中形成動(dòng)態(tài)的pH梯度來實(shí)現(xiàn)等電聚焦分離。由于毛細(xì)管的內(nèi)徑?。〝?shù)十微米），進(jìn)行等電聚焦的樣品制備量小，難以滿足后續(xù)分析的需要。此外，無論是基于IPG膠條還是基于毛細(xì)管的等電聚焦過程，均需要借助昂貴的儀器才能實(shí)現(xiàn)。以紙為基底的紙電泳于上世紀(jì)三十年代被提出，擁有悠久的歷史。隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，區(qū)帶電泳、等速電泳等電泳模式被應(yīng)用在紙電泳中。隨著毛細(xì)管電泳和色譜等高效分離分析技術(shù)的發(fā)展，紙基電泳技術(shù)越來越少被人關(guān)注。直到2007年哈佛大學(xué)的Whitesides[2]課題組首次提出以紙為基體材料的微流控裝置，由于紙基本身的特點(diǎn)，紙基分析技術(shù)近期又得到重視并成為一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。紙基微流控裝置是在紙的表面加工出具有一定結(jié)構(gòu)的微流體通道的微型分析器件，同時(shí)具備微流控分析芯片的試劑消耗量小、分析速度快和紙的來源豐富、成本低、加工簡單、易攜帶以及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。樣品預(yù)處理是紙基微流控裝置的重要應(yīng)用，通過濃集機(jī)理的引入還可以有效提高分析檢測的靈敏度。例如離子濃度極化[3]、等速電泳[4]等電動(dòng)濃集和分離方法已經(jīng)被引入紙基微流控裝置中。然而等電聚焦作為一種重要的電堆積和電泳分離模式，在紙基微流控中還未見應(yīng)用。參考文獻(xiàn)[1]Rodriguez‐DiazR,WehrT,ZhuM.Capillaryisoelectricfocusing[J].Electrophoresis,1997,18(12‐13):2134-2144.[2]MartinezAW,PhillipsST,ButteMJ,WhitesidesGM.Patternedpaperasaplatformforinexpensive,low-volume,portablebioassays.AngewandteChemie,2007,46:1318-20.[3]YangRJ,PuHH,WangHL.Ionconcentrationpolarizationonpaper-basedmicrofluidicdevicesanditsapplicationtopreconcentratedilutesamplesolutions[J].Biomicrofluidics,2015,9(1):014122.[4]MoghadamBY,ConnellyKT,PosnerJD.Isotachophoreticpreconcenetrationonpaper-basedmicrofluidicdevices[J].Analyticalchemistry,2014,86(12):5829-5837.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種在紙基分析裝置上等電聚焦和分離兩性物質(zhì)的方法，可以有效降低等電聚焦的成本，同時(shí)具有操作方便、速度快以及樣品易于回收等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種在紙基分析裝置上等電聚焦和分離兩性物質(zhì)的方法，采用紙基材料、酸性溶液、堿性溶液、兩性物質(zhì)樣品溶液、兩個(gè)電極以及直流電源組成回路，其中兩個(gè)電極分別插入酸性溶液和堿性溶液中，紙基材料采用兩性物質(zhì)樣品溶液潤濕后其兩端分別與酸性溶液和堿性溶液接觸，兩個(gè)電極通過導(dǎo)線與直流電源連接。上述方法中，所述紙基材料采用兩性物質(zhì)樣品溶液潤濕后還可在其表面覆蓋一層礦物油，再將其兩端分別與酸性溶液和堿性溶液接觸。上述方法中，當(dāng)兩性物質(zhì)為無色蛋白質(zhì)時(shí)，樣品在紙基材料上聚焦結(jié)束后還需進(jìn)行染色處理，所述染色方法包括：染料染色法、銀染法、負(fù)染法以及熒光染色法。上述方法中，所述兩性物質(zhì)樣品溶液為兩性樣品與載體兩性電解質(zhì)的混合溶液。上述方法中，所述酸性溶液選用濃度為5~20mM的H3PO4溶液，堿性溶液選用濃度為5~20mM的NaOH溶液。上述方法中，所述紙基材料的長度為5mm~15cm，寬度為100μm~10mm，材質(zhì)為親水性非解離纖維。上述方法中，施加于紙基材料上的電場強(qiáng)度為15~300V/cm。上述方法中，樣品在紙基材料上聚焦結(jié)束后，將聚焦的兩性物質(zhì)樣品帶裁剪后溶解回收分離后的兩性物質(zhì)樣品。本發(fā)明的原理如下：載體兩性電解質(zhì)和待分析的兩性物質(zhì)組分混合后將紙基材料潤濕，當(dāng)紙條兩端分別與酸性和堿性溶液液接觸時(shí)，接通直流電壓，載體兩性電解質(zhì)在直流電場的作用下在紙條上形成pH梯度，同時(shí)樣品組分依據(jù)其所帶電性向陰極或陽極移動(dòng)，當(dāng)組分遷移到與其等電點(diǎn)（pI）相同的pH位置時(shí)所帶凈電荷為零而在該點(diǎn)聚焦，達(dá)到使復(fù)雜樣品中不同等電點(diǎn)組分聚焦和分離的目的。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明具有工藝成本低、操作簡單、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，針對(duì)兩性樣品可以實(shí)現(xiàn)快速聚焦分離（在同等電場強(qiáng)度下，比毛細(xì)管等電聚焦和基于IPG膠條的等電聚焦的分離速度更快），并且由于等電聚焦具有富集能力，可以降低兩性樣品（蛋白質(zhì)）檢出限，聚焦帶經(jīng)裁剪后溶解即可實(shí)現(xiàn)樣品的回收。此外，本發(fā)明還可以與質(zhì)譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳等分析方法聯(lián)用。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1采用的紙基分析裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例2采用的紙基分析裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1等電聚焦和分離牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C混合樣品的聚焦分離結(jié)果。圖4為對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1中牛血紅蛋白分離回收后再次等電聚焦和分離的聚焦結(jié)果。圖5為對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1中細(xì)胞色素C分離回收后再次等電聚焦和分離的聚焦結(jié)果。圖6為本發(fā)明實(shí)施例2等電聚焦和分離牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C混合樣品的聚焦分離結(jié)果。圖7為本發(fā)明實(shí)施例3等電聚焦和分離六種預(yù)染色蛋白質(zhì)marker混合樣品的聚焦分離結(jié)果。圖8為本發(fā)明實(shí)施例3中紙基材料上形成的pH梯度結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。實(shí)施例1在圖1所示的開放式紙基分析裝置上等電聚焦和分離牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C混合樣品的方法，在陽極儲(chǔ)液池中加入濃度為10mM的H3PO4溶液，插入電極作為陽極，在陰極儲(chǔ)液池中加入濃度為10mM的NaOH溶液，插入電極作為陰極，兩電極通過導(dǎo)線與直流電源連接；將醋酸纖維膜裁剪為長度30mm，寬度3mm的紙條，將紙條用含有2.5mg/mL牛血紅蛋白、2.5mg/mL細(xì)胞色素C、及2%載體兩性電解質(zhì)的混合溶液潤濕，再將紙條搭在兩個(gè)儲(chǔ)液池上并使紙條兩端分別與儲(chǔ)液池里的酸溶液和堿溶液接觸，形成回路；接通電源，施加200V的直流電壓，在電場驅(qū)動(dòng)下，范圍為pH3~10的載體兩性電解質(zhì)可以在紙條上形成pH梯度，牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C依據(jù)其所帶電性向陰極或陽極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子遷移到與其等電點(diǎn)（pI）相同的pH位置時(shí)所帶凈電荷為零，該蛋白質(zhì)分子將聚集在該點(diǎn)，達(dá)到使牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C聚焦分離的目的。采用臺(tái)式顯微鏡觀察整個(gè)聚焦過程，每隔10s用手機(jī)拍照成像記錄聚焦過程，聚焦分離結(jié)果如圖3所示，當(dāng)電泳時(shí)間達(dá)到300s時(shí)，牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C完成聚焦分離。聚焦完成后，對(duì)紙條上聚焦的牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C進(jìn)行回收，回收步驟為：（1）分別裁剪牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C聚焦帶放入兩個(gè)離心管；（2）每個(gè)離心管均加入15μL去離子水；（3）離心管放入離心機(jī)離心，離心后保留上清液，即得到回收樣品。將上述牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C的回收樣品分別在圖1所示的開放式紙基分析裝置上再次等電聚焦，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4和圖5所示，證明本實(shí)施例的方法還可以實(shí)現(xiàn)樣品的回收。實(shí)施例2在圖2所示的油封式紙基分析裝置上等電聚焦和分離牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C混合樣品的方法，所述油封式紙基分析裝置電泳槽的兩端儲(chǔ)液池相距30mm，在陽極儲(chǔ)液池中加入濃度為15mM的H3PO4，插入電極作為陽極，在陰極儲(chǔ)液池中加入濃度為15mM的NaOH溶液，插入電極作為陰極，兩電極通過導(dǎo)線與直流電源連接；將醋酸纖維膜裁剪為長度30mm，寬度3mm的紙條，再將紙條用含有2.5mg/mL牛血紅蛋白、2.5mg/mL細(xì)胞色素C、及2%載體兩性電解質(zhì)的混合溶液潤濕，潤濕后覆蓋一層礦物油，再將紙條搭在兩個(gè)儲(chǔ)液池上并使紙條兩端分別與儲(chǔ)液池里的酸溶液和堿溶液接觸，形成回路；接通電源，施加300V的直流電壓，在電場驅(qū)動(dòng)下，范圍為pH3~10的載體兩性電解質(zhì)在電場驅(qū)動(dòng)下可以在紙條上形成pH梯度，牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C依據(jù)其所帶電性向陰極或陽極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子遷移到與其等電點(diǎn)（pI）相同的pH位置時(shí)凈電荷為零，該蛋白質(zhì)分子將聚集在該點(diǎn)，達(dá)到使牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C聚焦分離的目的。采用臺(tái)式顯微鏡觀察整個(gè)聚焦過程，用手機(jī)拍照成像記錄聚焦結(jié)果，聚焦分離結(jié)果如圖6所示，當(dāng)電泳時(shí)間達(dá)到200s時(shí)，牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C完成聚焦分離。實(shí)施例3：在圖1所示的開放式紙基分析裝置上等電聚焦和分離預(yù)染色蛋白質(zhì)marker的方法，在陽極儲(chǔ)液池中加入18mM的H3PO4，插入電極作為陽極，在陰極儲(chǔ)液池中加入18mM的NaOH溶液，插入電極作為陰極，兩電極通過導(dǎo)線與直流電源連接；將醋酸纖維膜裁剪為長度6cm，寬度3mm的紙條，將紙條用含有0.1mg/mL的6種預(yù)染色蛋白質(zhì)marker、及2%載體兩性電解質(zhì)的混合溶液潤濕，再將紙條搭在兩個(gè)儲(chǔ)液池上并使紙條兩端分別與儲(chǔ)液池里的酸溶液和堿溶液接觸，形成回路；接通電源，施加300V的直流電壓，在電場驅(qū)動(dòng)下，范圍為pH3~10的載體兩性電解質(zhì)可以在紙條上形成連續(xù)的pH梯度，如圖8所示，樣品組分依據(jù)其所帶電性向陰極或陽極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子遷移到與其等電點(diǎn)（pI）相同的pH位置時(shí)凈電荷為零，該蛋白質(zhì)分子將聚集在該點(diǎn)，達(dá)到使預(yù)染色蛋白質(zhì)marker混合溶液中各蛋白質(zhì)聚焦分離的目的。采用臺(tái)式顯微鏡觀察整個(gè)聚焦過程，每隔10s用手機(jī)拍照成像記錄聚焦過程，聚焦分離結(jié)果如圖7所示，當(dāng)電泳時(shí)間達(dá)到300s時(shí)，6種預(yù)染色蛋白質(zhì)marker完成聚焦分離。實(shí)施例4在圖1所示的開放式紙基分析裝置上等電聚焦和分離牛血清白蛋白和卵白蛋白的方法，在陽極儲(chǔ)液池中加入濃度為7mM的H3PO4，插入電極作為陽極，在陰極儲(chǔ)液池中加入濃度為7mM的NaOH溶液，插入電極作為陰極，兩電極通過導(dǎo)線與直流電源連接；將醋酸纖維膜裁剪為長度30mm，寬度3mm的紙條，將紙條用含有0.1mg/mL的牛血清白蛋白和卵白蛋白、及2%載體兩性電解質(zhì)的混合溶液潤濕，再將紙條搭在兩個(gè)儲(chǔ)液池上并使紙條兩端分別與儲(chǔ)液池里的酸溶液和堿溶液接觸，形成回路；接通電源，施加200V的直流電壓，在電場驅(qū)動(dòng)下，范圍為pH3~10的載體兩性電解質(zhì)可以在紙條上形成pH梯度，牛血清白蛋白和卵白蛋白依據(jù)其所帶電性向陰極或陽極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子遷移到與其等電點(diǎn)（pI）相同的pH位置時(shí)凈電荷為零，該蛋白質(zhì)分子將聚集在該點(diǎn)，達(dá)到使牛血清白蛋白和卵白蛋白聚焦分離的目的。聚焦完成后，對(duì)紙條進(jìn)行染色處理，染色過程如下：（1）配制1%麗春紅、5%乙酸水溶液；（2）將聚焦完成的醋酸纖維素膜浸沒在麗春紅染色液中，搖動(dòng)5~10分鐘，取出醋酸纖維膜用去離子水漂洗2~3次可出現(xiàn)清晰條帶。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3