本發(fā)明涉及分析化學領域，是一種判別煙草代謝組學研究所用的新鮮煙葉樣品質量是否滿足代謝組學研究需要的判別方法。
背景技術：
：植物代謝組學是通過考察植物受刺激或擾動后期代謝產物的變化或其隨時間的變化，來研究植物體的一種技術。在代謝組學輪廓分析的流程中，典型樣品的采集是首要并且極其重要的步驟，獲得合格樣品，以真實客觀的反映樣品的代謝狀態(tài)，是代謝組學分析進行的基礎和前提。植物新鮮煙葉樣品的采集，需要在低溫下淬滅以停止其生理活動以保證其停止在采樣時的代謝狀態(tài)，標準做法為采摘植物樣品后，錫紙包裹，置于-196℃液氮冷凍，用于新鮮煙葉分析或者凍干后用干粉樣品分析。在樣品采摘到分析前的這一段過程，需保證新鮮煙葉在液氮中保存且在液氮條件下研磨，否則會造成新鮮煙葉的酶促褐變。由于煙葉樣品保存不當而導致的質量發(fā)生變化，代謝物水平不能反映煙葉樣品真實狀態(tài)的情況時有發(fā)生。急需一種簡單、快速的分析方法對植物代謝組學研究中的煙葉樣品質量進行判別。煙草生物堿作為煙草中一類最重要的化學成分之一，其組成和含量對煙葉的吃味、刺激性和香氣都有直接的影響，其它糖、氮類物質和形成綜合香氣成分物質對煙草的質量處于輔助和從屬地位，但各類物質與生物堿的比例和協(xié)調關系又在很大程度上左右煙草的質量。近年來有關煙草中生物堿的提取、檢測等方法的報道層出不窮，但未曾有人提出將新鮮煙葉中的生物堿含量或含量比值用于代謝組學新鮮煙葉樣品質量的判別。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種基于生物堿的煙草代謝組學中新鮮煙葉樣品質量的判別方法。本發(fā)明的方法利用新鮮煙葉中煙堿烯和4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值對代謝組學研究中的新鮮煙葉樣品質量進行判別，該法操作簡單快速，結果準確可靠。本發(fā)明的目的可通過下述技術措施來實現(xiàn)：本發(fā)明的基于生物堿的煙草代謝組學中新鮮煙葉樣品質量的判別方法，其特征在于：通過檢測新鮮煙葉中煙堿烯和4,4'-二聯(lián)吡啶含量，計算其比值，對代謝組學研究中的新鮮煙葉樣品質量進行判別；具體步驟如下：a、稱取新鮮煙葉凍干樣品100~150mg，加入0.83~1.75mL5％氫氧化鈉溶液，濕潤試樣，靜置15min，加入10mL0.01%的三乙胺的甲基叔丁基醚溶液和含內標的提取溶劑，加蓋后置于搖床上室溫振蕩萃取1.5~2小時后離心，移取4~7mL上清液（有機相）并濃縮10倍，進GC/MS分析，采用保留時間和選擇離子（SIM）模式定性，檢測生物堿的含量；b、GC/MS分析方法的氣相色譜參數(shù)：色譜柱：DB-35MS(30m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)；程序升溫：以8℃/min的速度從100℃升至260℃（10min）；載氣：氦氣；柱流速：1.0mL/min；進樣口溫度：250℃；進樣量2μL，分流進樣，分流比10:1；c、GC/MS分析方法的質譜參數(shù)：溶劑延遲：8min；電離電壓：70ev；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；掃描方式：選擇離子模式（SIM），選擇離子如下：2-甲基喹啉（IS）（143），煙堿（84），降煙堿（119），麥斯明（146），假木賊堿（84），煙堿烯（158），新煙堿（160），2,3′-二聯(lián)吡啶（156），4,4′-二聯(lián)吡啶（156），可的寧（176），N-甲?；禑焿A（176），煙堿-1-氧代（84），D8-二聯(lián)吡啶(IS)（164）。本發(fā)明中所述內標為2-甲基喹啉和D8-二聯(lián)吡啶，其含量分別為180μg/mL和12μg/mL；所述的提取溶劑為含0.01%的三乙胺的甲基叔丁基醚溶液；所述新鮮煙葉與含內標的提取溶劑按質量（mg）/體積（mL）比為10~20:1。本發(fā)明中所述新鮮煙葉凍干樣品由大田采摘的新鮮煙葉，于-196℃液氮罐保存運輸，液氮冷凍研磨，低溫凍干，-80℃冰箱保存待用的煙末。本發(fā)明采用氣相色譜串聯(lián)質譜GC-MS對新鮮煙葉樣品中煙堿烯及4,4′-二聯(lián)吡啶進行絕對定量分析，計算比值以煙堿烯及4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值為指標，建立區(qū)分代謝組學合格樣品及變質的不合格樣品的標準，分析步驟如下：GC-MS分析數(shù)據(jù)可定性新鮮煙葉樣品中的煙堿烯及4,4′-二聯(lián)吡啶，通過繪制標準曲線可對所測得的煙堿烯和4,4′-二聯(lián)吡啶進行絕對定量：將煙堿烯及4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值作為區(qū)分代謝組學合格樣品及變質的不合格樣品的標準，即待測樣品中煙堿烯及4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值在1.1以下的為合格樣品，可用于代謝組學分析，煙堿烯及4,4′-二聯(lián)吡啶的比值在1.1以上的為變質的不合格樣品，不可用于代謝組學分析。本發(fā)明經過大量新鮮煙葉樣品的分析研究，發(fā)現(xiàn)新鮮煙葉如果保存不當，其生物堿含量會發(fā)生變化，煙堿烯及4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值也會明顯升高，此類樣品將不能用于代謝組學分析。因此可以以煙堿烯及4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值作為一個標準對代謝組學研究中的新鮮煙葉樣品質量進行判別。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明利用新鮮煙葉樣品中煙堿烯及4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值和樣品質量的相關性，對代謝組學新鮮煙葉樣品質量進行判別，具有以下特點：1）操作簡單快速；2）結果準確可靠；3）樣品用量少，可為煙草代謝特征分析及相關煙草代謝組學研究提供借鑒。具體實施方式本發(fā)明以下將結合實施例作進一步描述：實施例1采用GC-MS方法測定新鮮煙葉樣品中的生物堿含量，發(fā)現(xiàn)褐化樣品的煙堿烯和4,4′-二聯(lián)吡啶含量比值明顯升高。待測樣品包括福建、貴州、湖南、河南、云南等省份的6個品種、17個產地的新鮮煙葉樣品116份（每個點有5-7個生物學重復）。其中包括92份合格樣品（樣品在采集、運送及預處理過程中均嚴格控制在-80℃），24份褐變樣品（由于儲運過程中液氮不足等原因已發(fā)生褐變）。樣品分析步驟如下所述：1）由大田采摘的新鮮煙葉，于-196℃液氮罐保存運輸，液氮冷凍研磨，低溫凍干，-80℃冰箱保存待后續(xù)進行代謝組學分析。準確稱取新鮮煙葉凍干樣150mg（精確至0.1mg）于15mL離心管中，準確加入1.75mL5％氫氧化鈉溶液，濕潤試樣，靜置15min，加入10mL0.01%的三乙胺的甲基叔丁基醚溶液(內標2-甲基喹啉和D8-二聯(lián)吡啶，其含量分別為180μg/mL和12μg/mL)，加蓋后置于搖床上室溫振蕩萃取2小時，然后在6000轉/min條件下離心5min。準確移取7mL有機相濃縮到0.7mL，進GC/MS分析，檢測生物堿含量。氣相色譜條件：色譜柱：DB-35MS(30m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)；程序升溫：以8℃/min的速度從100℃升至260℃（10min）；載氣：氦氣；柱流速：1.0mL/min；進樣口溫度：250℃；進樣量2μL，分流進樣，分流比10:1。質譜條件：溶劑延遲：8min；電離電壓：70ev；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；掃描方式：選擇離子模式（SIM），選擇離子如下：煙堿（84），降煙堿（119），麥斯明（146），假木賊堿（84），煙堿烯（158），新煙堿（160），2,3′-二聯(lián)吡啶（156），4,4′-二聯(lián)吡啶（156），可的寧（176），N-甲?；禑焿A（176），煙堿-1-氧代（84），D8-二聯(lián)吡啶(IS)（164）。繪制了煙堿烯（0.32-40μg/mL）與4,4′-二聯(lián)吡啶（0.33-41.6μg/mL）的標準曲線。以目標物峰面積與內標物峰面積（D8-二聯(lián)吡啶）的比值為縱坐標Y，質量濃度X（μg/mL）為橫坐標，計算其標準曲線及相關系數(shù)，測定結果如下：Y（煙堿烯）=0.782X，Y（4,4′-二聯(lián)吡啶）=1.077X，相關系數(shù)分別為0.9993和0.9991。在上述條件下獲得了116份新鮮煙葉中煙堿與降煙堿等11種生物堿的絕對含量，發(fā)現(xiàn)煙堿烯與4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值變化顯著，詳細數(shù)據(jù)見表1。表1實施例1中煙葉樣品信息及煙堿烯與4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值樣品編號產地品種重復數(shù)煙堿烯/4,4′-二聯(lián)吡啶是否合格HZ10河南許昌中煙10051.28-2.84不合格C23Y貴州畢節(jié)云9761.26-1.47不合格C01K云南昆明K32650.57-0.81合格C02K云南玉溪K32660.67-0.9合格C03C云南曲靖云8760.53-0.75合格C04Y云南紅河云9760.62-0.78合格C05Y云南普洱云8760.60-0.76合格C06Y云南大理云8750.54-0.68合格C09Y貴州黔西南云9760.42-0.71合格C12C河南平頂山中煙10060.43-0.55合格C13C河南南陽中煙10050.71-0.80合格C14C河南駐馬店中煙10060.73-0.85合格C15K廣東韶關K32660.70-0.95合格C17K湖南郴州K32660.62-0.72合格C25N貴州銅仁南江3號60.42-0.61合格C26Y湖北恩施云8760.41-0.64合格YH10云南大理紅花大金元50.57-0.96合格GK10貴州遵義K32660.59-0.92合格HH10河南許昌紅花大金元71.23-1.56不合格HK10河南許昌K32661.15-1.3不合格經過以上實驗，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)褐化樣品中的煙堿烯與4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值顯著升高。本發(fā)明將煙堿烯與4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值作為區(qū)分代謝組學正常樣品與變質樣品的標準。即待測樣品中煙堿烯與4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值在1.1以下的為正常樣品，可用于代謝組學分析，煙堿烯與4,4′-二聯(lián)吡啶含量的比值在1.1以上的為變質樣品，不可用于代謝組學分析。當前第1頁1 2 3