本發(fā)明屬于化學檢測領域，具體涉及一種魚精蛋白的檢測方法。

背景技術：

最近20年，隨著科技手段的進步以及人們在尋找天然食品防腐劑方面的積極努力，魚精蛋白因其良好的抗菌活性和天然的活性受到廣泛的關注。魚精蛋白是從魚類新鮮成熟精子中提取出來的一種多聚陽離子肽，具有高效，安全，功能性等特點，是值得開發(fā)的一種天然食品防腐劑。

眾所周知，魚精蛋白具有很多醫(yī)學方面的應用，比如：用于治療因注射方面的肝素過量所引起的出血，是目前體外循環(huán)心臟手術唯一對抗肝素的藥物。魚精蛋白和DNA的復合體-核蛋白體在醫(yī)學上被認為能提高肝功能，有效解除疲勞，具有強精作用，除此之外，魚精蛋白還具有很高的營養(yǎng)性和功能性，能降血壓、助呼吸、促消化等，這些也成為研究的熱點。

目前對魚精蛋白的檢測方法有很多，但是檢測限和靈敏度達不到要求，而且，操作復雜。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種魚精蛋白的檢測方法，使用熒光回升傳感法來檢測魚精蛋白，信號誤差小，檢測限低，選擇性高，靈敏性高，操作簡單。

本發(fā)明提供的一種魚精蛋白的檢測方法，包括以下步驟：

(1)制備GO–NH₂；

(2)制備ANS-PAA復合材料；

(3)將GO–NH₂溶液與ANS-PAA復合材料溶液混合后，得到GO–NH₂/ANS-PAA體系，加入PBS緩沖溶液，然后用去離子水稀釋后，調(diào)節(jié)pH至4.5-6.5，測量其熒光強度；

(4)將GO–NH₂溶液與ANS-PAA復合材料溶液混合后，分別加入不同濃度的魚精蛋白溶液，加入PBS緩沖溶液，然后用去離子水稀釋后，調(diào)節(jié)pH至4.5-6.5，攪拌混勻，靜置，待穩(wěn)定后，分別測量其熒光強度，構建熒光強度與魚精蛋白溶液濃度的線性關系；

(5)將GO–NH₂溶液與ANS-PAA復合材料溶液混合后，加入未知濃度的魚精蛋白溶液，加入PBS緩沖溶液，然后用去離子水稀釋后，調(diào)節(jié)pH至4.5-6.5，攪拌混勻，靜置，待穩(wěn)定后，測量其熒光強度，通過步驟(4)的線性關系得到魚精蛋白溶液濃度。

進一步的，步驟(1)中制備GO–NH₂方法為：

A、在3.5-4℃以下，將濃硫酸、石墨粉和硝酸鈉超聲0.8-1h混勻后，加入高錳酸鉀混合，關閉超聲；在9-10℃下攪拌下反應2-2.3h；

B、步驟A所得混合溶液再水浴加熱至38-39℃超聲下反應0.5-0.6h，再升溫至96-98℃后加入去離子水終止反應；

C、然后，再加入雙氧水，反應后，再加入鹽酸溶液；產(chǎn)物離心、洗滌，得到氧化石墨；

D、然后，將氧化石墨分散在水中，超聲振蕩剝離后離心，上層清液即為氧化石墨烯分散液，烘干后得到氧化石墨烯；

E、將合成的氧化石墨烯分散在PBS溶液中，加入EDC和NHS混合液，孵化后，加入乙二胺，再孵化后，所得混合溶液在3.5-4℃下保存10-14h，用PBS透析移去未反應的乙二胺，最后得到GO–NH₂。

進一步的，步驟(1)中制備GO–NH₂方法具體為：

A、量取23m L濃硫酸放入冰浴中冷卻至3.5-4℃以下，稱取1g石墨粉和0.5g硝酸鈉與濃硫酸混合，開啟超聲，1-1.2h以后緩慢加入3g高錳酸鉀，關閉超聲；在9-10℃攪拌條件下，反應2-2.3h；

B、步驟A所得混合溶液移置38-39℃水浴鍋中，超聲下反應0.5-0.6h，然后溫度升高到96-98℃后加入60mL去離子水中止反應；

C、隨后加入25mL體積濃度為30％-35％的雙氧水，反應15-16min后，再加入40mL體積濃度為10％-12％的鹽酸溶液溶解，8000r/min速度下離心10min后，二次蒸餾水洗滌去除過量的酸及副產(chǎn)物，即得氧化石墨；

D、將洗滌后呈中性的氧化石墨分散水中，超聲振蕩剝離40-41min，然后在2500r.min^-1轉速下離心30-35min，上層液即是氧化石墨烯分散液；在40-50℃下干燥2-3h；獲得氧化石墨烯；

E、將合成的20mg的氧化石墨烯分散在20mL的PBS緩沖溶液中，超聲1h形成均勻分散液，然后加1mL的EDC和NHS的混合液在上述分散液中，30-31min孵化后，加入0.2mL乙二胺，2-2.5h孵化后，將混合液在3.5-4℃下保存10-14h，用PBS透析移去未反應的乙二胺，最后得到GO–NH₂。

步驟E中所述EDC和NHS的混合液的制備方法為：0.5g EDC和0.15g NHS溶解在20mL的二次蒸餾水中,備用。

步驟(2)所述制備ANS-PAA復合材料的方法為：

將PAA溶解在PBS緩沖溶液中，放在冰浴中靜置，然后加入EDC和NHS，攪拌反應，然后加入ANS，冰浴下反應后，于室溫下靜置，然后離心除去未反應的ANS，加入無水乙醇，反應后，產(chǎn)物用無水乙醇洗滌后，即得ANS-PAA。

進一步的，步驟(2)制備ANS-PAA復合材料的方法具體為：

將1g純凈的PAA溶解在5mL的PH＝7.4的PBS緩沖溶液，將之放在冰浴中靜置2h，然后加入20mg EDC和10mg NHS攪拌反應1h，再加入3.4g ANS冰浴反應1h，然后室溫靜置22h，8000r/min下離心20min除去未反應的ANS，加入無水乙醇，3-10min后，用無水乙醇洗滌3-5次，即得ANS-PAA。

步驟(2)中所述ANS是指4-氨基-1-萘磺酸鈉四水合物；PAA是指聚丙烯酸。

步驟(3)、步驟(4)和步驟(5)所得體系中ANS-PAA復合材料終濃度均為1mg.L^-1，GO-NH₂的終濃度均為65mg L^-1。

步驟(3)、步驟(4)和步驟(5)中優(yōu)選的體系pH為5.2。

步驟(4)中魚精蛋白溶液終濃度為：0μg mL^-1、0.5μg mL^-1、1.4μg mL^-1、1.8μg mL^-1、2.5μg mL^-1、3.8μg mL^-1、4μg mL^-1、4.5μg mL^-1、6μg mL^-1、10μg mL^-1、15μg mL^-1和20μg mL^-1。

步驟(4)中構建的熒光強度與魚精蛋白溶液濃度的線性關系為：F＝83.1+34.97C；F為加入魚精蛋白后的熒光強度，C是魚精蛋白的濃度。

本發(fā)明將乙二胺通過化學鍵修飾到氧化石墨烯(GO)表面生成氨基化氧化石墨烯(GO–NH₂)，從而合成了氨基化氧化石墨烯復合材料，該材料包含大量的帶正電荷的氨基基團。將4-氨基-1-萘磺酸鈉四水合物(ANS)接枝到聚丙烯酸(PAA)上合成了一種帶大量負電荷的熒光聚合物ANS-PAA。把氨基化氧化石墨烯加入到ANS-PAA體系中時，ANS-PAA的熒光發(fā)生猝滅。這是由于ANS-PAA和氨基化GO表面間存在非共價鍵作用(包括靜電吸引和π–π作用)，ANS-PAA被吸附到氨基化GO表面從而使體系的熒光猝滅。當往該體系中加入魚精蛋白后，由于魚精蛋白帶有很強的正電荷，它能夠將帶負電荷的ANS-PAA熒光聚合物從氨基化GO表面奪取過來，從而使ANS-PAA的熒光強度得到回升，且熒光強度與所加的魚精蛋白濃度成正比，據(jù)此建立了一種快速檢測魚精蛋白的方法。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的檢測方法操作簡單，檢測限低，能快速準確地對魚精蛋白進行檢測。

附圖說明

圖1A為GO的掃描電鏡圖；

圖1B為GO-NH₂掃描電鏡圖；

圖2為石墨、GO和GO-NH₂的XRD圖譜；

圖3為石墨、GO、GO-NH₂、ANS、PAA和ANS-PAA的FT-IR圖譜；

a-石墨，b-GO，c-GO-NH₂，d-ANS，e-PAA，f-ANS-PAA；

圖4為檢測體系中不同pH(2-7.5)對熒光回升效率的影響；

體系中ANS-PAA濃度為1mg.L^-1，GO-NH₂的濃度為 65mg L^-1，魚精蛋白的濃度為2μg mL-¹；

圖5為ANS-PAA濃度為1mg.L^-1的溶液中加入不同濃度GO-NH₂的熒光光譜圖；

a為 0,b為50mg L^-1，c為65mg.L^-1；d為75mg.L^-1

圖6A為ANS-PAA/GO-NH₂體系中加入不同濃度魚精蛋白后熒光回升圖譜；體系中ANS-PAA終濃度1.0mg.L^-1；GO-NH₂的終濃度為 65mg L^-1，魚精蛋白終濃度分別為0μg mL^-1、0.5μg mL^-1、1.4μg mL^-1、1.8μg mL^-1、2.5μg mL^-1、3.8μg mL^-1、4μg mL^-1、4.5μg mL^-1、6μg mL^-1、10μg mL^-1、15μg mL^-1和20μg mL^-1；

圖6B為熒光強度與魚精蛋白溶液濃度0-20μg mL^-1的關系圖；

圖7為熒光強度與魚精蛋白溶液濃度0-6μg mL^-1的關系線性圖。

具體實施方式

實施例1

一種魚精蛋白的檢測方法，包括以下步驟：

(1)GO–NH₂的制備

本文中采用低中高溫超聲輔助Hummers法合成氧化石墨烯：

A、量取23m L濃硫酸倒入燒杯，燒杯放入冰浴中冷卻至3.5-4℃以下，稱取1g石墨粉和0.5g硝酸鈉放入燒杯，與濃硫酸混合，開啟超聲，1h以后緩慢加入3g高錳酸鉀，加完后，關閉超聲；攪拌下控制溫度9℃，反應2h；

B、然后步驟A制備的混合液移至水浴鍋，開啟超聲，水浴溫度控制在38-39℃反應0.5h；然后溫度升高到98℃后加入60mL去離子水中止反應；

C、隨后加入25mL體積濃度30％的雙氧水，待反應15min后再加入40mL體積濃度10％的鹽酸溶液溶解，然后以低8000r/min速度下離心10min后，二次蒸餾水洗滌去除過量的酸及副產(chǎn)物，即得氧化石墨；

D、將洗滌后呈中性的氧化石墨分散水中，超聲振蕩剝離40min，超聲結束后在2500r.min^-1轉速下離心30min，上層液即是氧化石墨烯分散液；在40-50℃下干燥2-3h；獲得氧化石墨烯；

E、將合成的20mg的氧化石墨烯分散在20mL的PBS通過超聲粉碎1h形成均勻分散液。加1mL的EDC和NHS混合液(制備方法為：0.5g EDC和0.15g NHS溶解在20mL的二次蒸餾水中,備用。)在上述分散液中，孵化3 0min后，加入0.2mL乙二胺，2h孵化后，混合液在4℃下保存12h，用PBS透析移去未反應的乙二胺，最后得到GO–NH₂。

圖1A為GO的掃描電鏡圖；圖1B為GO-NH₂掃描電鏡圖；通過GO的SEM可以看出合成的GO是光滑的平面上有褶皺的條紋，而用氨基改性得氧化石墨烯表面相對粗糙一些，片層也較為松散。這與其他文獻中報道一致，從而可以證明我們成功合成了GO和GO-NH₂。

圖2為GO，GO-NH₂和天然石墨的XRD的表征圖譜，在2θ＝26.4°處的衍射峰對應天然石墨的特征峰，其層間距d＝0.35nm，在2θ＝11.3°處的衍射峰對應GO的特征峰，其層間距d＝0.87nm，而氨基化的GO沒有明顯的特征峰。

(2)將1g純凈的PAA溶解在5mL的PBS緩沖溶液PH＝7.4，將之放在冰浴中靜置2h，然后，加入20mg EDC和10mg NHS，攪拌1h，然后加入3.4g ANS，冰浴1h，接下來室溫靜置22h，8000r/min下離心20min除去未反應的ANS，加入無水乙醇，3-10min后，用無水乙醇洗滌3-5次，即得ANS-PAA復合材料。

圖3為石墨、GO、GO-NH₂、ANS、PAA和ANS-PAA的FT-IR圖譜；從GO的FTIR圖中可以看出，3419cm^-1出現(xiàn)–OH及其吸附的水分子的伸縮振動吸收峰，在1719cm^-1處的吸收峰則對應于羰基和羧基中C＝O的伸縮振動。而未被氧化的sp²雜化碳骨架振動(C＝C)則出現(xiàn)在1622cm^-1處，在1228cm^-1和1043cm^-1處出現(xiàn)的吸收峰均與環(huán)氧基和烷氧基中C＝O振動有關。與石墨的FTIR圖相比，在天然石墨中，除了C＝C的伸縮振動，無其他的官能團特征峰。GO的FTIR圖可以觀察到顯著的變化，這與以前的報道基本一致，表明已經(jīng)成功地制備出氧化石墨。而GO-NH₂在1649cm^-1，1556cm^-1的官能團特征峰明顯減弱。它們含有大量的-COOH，-OH以及C-O-C等含氧官能團。在圖中，1556cm^-1為GO-NH₂中N-H的特征吸收峰；這些表明我們合成了氨基化GO。從PAA的FTIR圖中可以看出，在3410cm^-1和1707cm^-1處的吸收峰分別歸屬于–OH和PAA鏈上羰基(C＝O)伸縮振動吸收峰，在2940cm^-1則出現(xiàn)–CH₂的對稱伸縮振動吸收峰，在1452cm^-1和812cm^-1的吸收峰對應于PAA的C–H平面外彎曲振動。在圖中，1560cm-1為ANS-PAA中N-H的特征吸收峰；這些結果表明我們已成功地合成了ANS-PAA。

熒光猝滅實驗：

取制備的GO-NH₂復合材料0.1g于100mL容量瓶中，超聲分散均勻，待用,制備不同濃度的GO-NH₂溶液待用；

隨后分別取4份相同的熒光聚合物ANS-PAA溶液，然后分別加入不同濃度的GO-NH₂溶液于10mL比色管中，同時各加入1mL濃度為0.2mol/L的PBS緩沖溶液，稀釋至10mL，調(diào)節(jié)pH至5.2。激發(fā)波長設定在327nm，分別測其熒光光譜。體系中ANS-PAA終濃度為1mgL^-1,GO-NH₂溶液終濃度分別為0、50mg L^-1、65mg.L^-1和75mg.L^-1。

如圖5所示熒光聚合物ANS/PAA溶液具有很強的熒光強度，當加入GO-NH₂后，熒光聚合物ANS/PAA的熒光強度隨著GO-NH₂濃度的增加而逐漸降低。說明GO-NH₂對熒光聚合物ANS/PAA的熒光有猝滅作用。加入氨基化氧化石墨烯材料(GO–NH₃⁺)，由于ANS/PAA和GO表面間存在非共價鍵作用(包括靜電吸引和π–π作用)從而使體系的熒光猝滅。

如果加入的氧化石墨烯濃度過大，會使體系熒光基本猝滅，當加入魚精蛋白，體系熒光無法回升，靈敏度過低，當加入的氧化石墨烯濃度過小，會使線性范圍變窄。本實驗中選擇GO-NH₂為65mg.L^-1進行熒光回升實驗。

(3)取制備的GO-NH₂復合材料0.1g于100mL容量瓶中，超聲分散均勻，待用。

取10份熒光聚合物ANS-PAA溶液，然后加入制備的GO-NH₂溶液于10mL比色管中，同時各加入1mL濃度為0.2mol/L的PBS緩沖溶液，稀釋至10mL，調(diào)節(jié)pH至5.2，所得體系中ANS-PAA復合材料終濃度均為1mg.L^-1，GO-NH₂的終濃度均為65mg L^-1；分別測量其熒光強度；

(4)取制備的GO-NH₂復合材料0.1g于100mL容量瓶中，超聲分散均勻，待用。

取10份熒光聚合物ANS-PAA溶液，然后加入制備的GO-NH₂溶液于10mL比色管中，然后，分別加入濃度的魚精蛋白溶液，各加入1mL濃度為0.2mol/L的PBS緩沖溶液，稀釋至10mL，調(diào)節(jié)pH至5.2，所得體系中ANS-PAA復合材料終濃度均為1mg.L^-1，GO-NH₂的終濃度均為65mg L^-1；魚精蛋白溶液終濃度分別為0、0.5、1.4、1.8、2.5、3.8、4、4.5、6、10、15、20μg mL^-1，靜置待穩(wěn)定后，分別測量其熒光強度；熒光回升，且熒光強度與魚精蛋白濃度在0到6.0μg mL^-1濃度范圍內(nèi)呈線性關系，據(jù)此構建魚精蛋白蛋白濃度與熒光強度的線性關系。

加入不同濃度的魚精蛋白(0-20μg.ml^-1)，熒光回升，如圖6A所示；圖6B為熒光強度與魚精蛋白溶液濃度0-20μg mL^-1的關系圖；熒光強度與魚精蛋白濃度在0到6.0μg mL^-1濃度范圍內(nèi)呈線性關系，在直角坐標系中作圖，如圖7，可以看出以魚精蛋白的濃度為x軸與其對應的熒光強度為y軸，從圖中可以看出，魚精蛋白濃度與熒光強度具有很好的線性關系，并且其線性相關系數(shù)為0.9969。根據(jù)此線性關系進而檢測溶液中的魚精蛋白的含量。

具體檢測未知濃度的魚精蛋白溶液：

(5)取制備的GO-NH₂復合材料0.1g于100mL容量瓶中，超聲分散均勻，待用；

取2份熒光聚合物ANS/PAA溶液，然后分別加入GO-NH₂溶液于10mL比色管中，一個比色管中加入20μg魚精蛋白，另外一個不加，然后，向每個比色管中再加入1mL濃度為0.2mol/L的PBS緩沖溶液和2ml自來水，稀釋至10mL，分別測量其熒光強度；2個比色管中ANS/PAA復合材料終濃度均為1mg.L^-1，GO-NH₂的終濃度為均為65mg.L^-1；加入魚精蛋白終濃度是2.0μg mL^-1，不加的為0。

所得熒光強度與步驟(4)的標準曲線對比，得到被檢測的樣品中含有魚精蛋白的濃度。在沒加魚精蛋白的比色管中未檢測到魚精蛋白的含量，在另一比色管中檢測到魚精蛋白的濃度時2.072μg mL^-1，檢測回收率103.6％。重復該實驗8次，標準偏差是1.56％。結果如下表1：表明該方法準確可靠。

表1用標準加入法在自來水樣品中回收魚精蛋白結果

實施例2

探索pH對熒光回升效率的影響；

改變體系pH，其他實驗過程同實施例1步驟(4)，體系中ANS-PAA終濃度為1mg.L^-1，GO-NH₂的終濃度為65mg L^-1，魚精蛋白的終濃度為2μg mL-¹；

結果如圖4，pH值在2-7.5的10個HEPES緩沖溶液來選擇當體系熒光回升效率F/F₀(式中F₀和F分別為ANS-PAA/GO-NH2體系的熒光強度和ANS-PAA/GO-NH₂體系加入魚精蛋白2μg mL^-1時的熒光強度)最大時的最優(yōu)pH值，結果如圖4所示。從圖中可以看出，隨著pH值的增大，體系的熒光回升效率先增大，后減小，在pH＝5.2時體系的熒光回升效率最大。因此，在后續(xù)的熒光滴定實驗中選擇pH＝5.2的HEPES緩沖溶液。