一種硫酸魚精蛋白的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種硫酸魚精蛋白的純化方法。該純化方法包括下述步驟：(1)將硫酸魚精蛋白粗提物溶解于水中得溶液，加入酸，調(diào)節(jié)溶液pH值為1～2；(2)加入吸附劑，攪拌，過濾，得到濾液；(3)加入堿，調(diào)節(jié)濾液pH值為10～12，再加入吸附劑，攪拌，過濾；(4)加入有機(jī)溶劑，離心除去上清液，將沉淀物真空干燥，即得；其中，步驟(2)與步驟(3)中所述的吸附劑為硅藻土、活性礬土、皂土、骨炭、活性炭和硅膠中的一種或多種。本發(fā)明采用吸附劑直接吸附純化硫酸魚精蛋白的精制方法，不僅操作簡單，而且成本遠(yuǎn)低于色譜法，生產(chǎn)規(guī)模也遠(yuǎn)高于色譜法，產(chǎn)品純度與色譜法得到的產(chǎn)品純度相當(dāng)，很適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種硫酸魚精蛋白的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)精制【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種硫酸魚精蛋白的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]魚精蛋白是從魚類精子細(xì)胞中提取的一種多聚陽離子肽的硫酸鹽，在臨床上，是唯一可以用來拮抗心臟手術(shù)中肝素過量的藥物，同時(shí)硫酸魚精蛋白還可以用于配制長效胰島素和長效促皮質(zhì)素。因?yàn)榱蛩狒~精蛋白具有抗菌作用，在食品行業(yè)，硫酸魚精蛋白也可用于制作食品防腐劑。
[0003]生產(chǎn)硫酸魚精蛋白主要采用提取、分離及精制三個(gè)步驟。通常，經(jīng)過提取和分離，能從魚白中得到魚精蛋白粗提物。但是不論采取何種提取方法，最后得到的魚精蛋白粗提物都需要經(jīng)過最后的精制步驟。
[0004]魚精蛋白的提取一般是將成熟魚類的魚白絞碎，加入稀醋酸溶液，分離出凝聚的精子核，然后采用有機(jī)溶劑沉淀，之后加入無機(jī)酸攪拌一定時(shí)間，棄去廢渣，提取液采用有機(jī)溶劑沉淀，得到魚精蛋白無機(jī)酸鹽粗品。在分離步驟，最常用的方法就是有機(jī)溶劑和硫酸反復(fù)沉淀溶解，逐步去除不同的雜質(zhì)。也有采用蛋白沉淀劑如鎢酸，偏磷酸，磺基水楊酸等進(jìn)行沉淀分離的。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)最常用的蛋白質(zhì)精制方法是采用色譜柱進(jìn)行純化，結(jié)合魚精蛋白本身的特性，純化魚精蛋白，主要是采用離子交換層析和肝素親和層析。但是，不管是離子交換層析還是肝素親和層析，需要投入的成本都很大，且單次純化量有限，操作要求高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)中采用離子交換層析法、或肝素親和層析法純化硫酸魚精蛋白所存在的成本高、單次純化量有限、操作要求高、不適合工業(yè)化生產(chǎn)的缺陷，提供一種硫酸魚精蛋白的純化方法。本發(fā)明采用吸附劑直接吸附純化硫酸魚精蛋白的精制方法，不僅操作簡單，而且成本遠(yuǎn)低于色譜法，生產(chǎn)規(guī)模也遠(yuǎn)高于色譜法，產(chǎn)品純度與色譜法得到的產(chǎn)品純度相當(dāng)，很適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的:
[0008]本發(fā)明提供了一種硫酸魚精蛋白的純化方法，其包括下述步驟:
[0009](I)將硫酸魚精蛋白粗提物溶解于水中得溶液，加入酸，調(diào)節(jié)溶液pH值為I~2 ;
[0010](2)加入吸附劑，攪拌，過濾，得到濾液；
[0011](3)加入堿，調(diào)節(jié)濾液pH值為10~12，再加入吸附劑，攪拌，過濾；
[0012](4)加入有機(jī)溶劑，離心除去上清液，將沉淀物真空干燥，即得；
[0013]其中，步驟(2)與步驟(3)中所述的吸附劑為硅藻土、活性礬土、皂土、骨炭、活性炭和硅膠中的一種或多種。
[0014]其中，所述的硫酸魚精蛋白粗提物可為本領(lǐng)域的常規(guī)硫酸魚精蛋白粗提物，本發(fā)明優(yōu)選購于上海第一生化藥業(yè)有限公司的硫酸魚精蛋白粗提物。優(yōu)選所述的硫酸魚精蛋白粗提物通過下述方法制得:將魚白與純化水的混合物勻漿后，加入醋酸調(diào)節(jié)pH為3.5~
4.5，沉淀物用硫酸溶解，離心后上清液用無水乙醇沉淀，沉淀物溶于純化水，O~4°C靜置，下層油狀物溶于純化水中，硫酸調(diào)節(jié)PH為1.5~2.5，加入無水乙醇沉淀，沉淀物干燥，即得硫酸魚精蛋白粗提物。
[0015]步驟(1)中，所述的水較佳地為純化水；所述的硫酸魚精蛋白粗提物與所述的水的質(zhì)量比較佳地為1: (10~30)。
[0016]步驟(1)中，所述的酸較佳地為硫酸。
[0017]步驟⑵中，所述的吸附劑與所述的溶液的質(zhì)量比較佳地為5: (1000~100)。
[0018]步驟(2)中，所述的攪拌較佳地為在水浴條件下攪拌，所述的水浴的溫度較佳地為30~50°C。所述的攪拌的時(shí)間較佳地為I~3小時(shí)。
[0019]步驟(3)中，所述的堿較佳地為氫氧化鈉和/或氫氧化鉀。
[0020]步驟(3)中，所述的吸附劑與所述的溶液的質(zhì)量比較佳地為5: (1000~100)。
[0021]步驟(3)中，所述的攪拌較佳地為在水浴條件下攪拌，所述的水浴的溫度較佳地為60~85°C。所述的攪拌 的時(shí)間較佳地為I~3小時(shí)。
[0022]其中，所述的有機(jī)溶劑可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的各種有機(jī)溶劑，更佳地為乙醇、乙醚、丙酮和甲醇中的一種或多種，最佳地為O~4°C放置過夜的無水乙醇。所述的有機(jī)溶劑與所述的溶液的質(zhì)量比較佳地為(1.0~3.5):1。
[0023]其中，所述的離心的轉(zhuǎn)速較佳地為3000~5000rpm，所述的離心的時(shí)間較佳地為10 ~20min。
[0024]其中，所述的真空干燥的真空度較佳地為0.08~0.1MPa，所述的真空干燥的時(shí)間較佳地為24~30小時(shí)。
[0025]其中，所述的真空干燥較佳地在放入五氧化二磷的真空干燥箱中進(jìn)行。
[0026]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0027]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0028]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明采用吸附劑結(jié)合特定的pH值來直接吸附純化硫酸魚精蛋白的精制方法，不僅操作簡單，而且成本遠(yuǎn)低于色譜法，生產(chǎn)規(guī)模也遠(yuǎn)高于色譜法，產(chǎn)品純度與色譜法得到的產(chǎn)品純度相當(dāng)，很適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為精制純化前，硫酸魚精蛋白粗提物的陽離子交換層析圖譜圖，其中，左側(cè)縱坐標(biāo)為220nm刻度，右側(cè)縱坐標(biāo)為260nm刻度，線條I為220nm檢測線(代表多肽)。
[0030]圖2為實(shí)施例1精制純化后，硫酸魚精蛋白精制品的陽離子交換層析圖譜圖，其中，左側(cè)縱坐標(biāo)為220nm刻度，右側(cè)縱坐標(biāo)為260nm刻度，線條I為220nm檢測線(代表多肽)。
[0031]圖3為硫酸魚精蛋白進(jìn)口原料藥的陽離子交換層析圖譜圖，其中，左側(cè)縱坐標(biāo)為220nm刻度，右側(cè)縱坐標(biāo)為260nm刻度，線條I為220nm檢測線(代表多肽)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0032]下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0033]下述實(shí)施例中采用的硫酸魚精蛋白粗提物均由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供，其制備方法為:取冰凍的魚白10kg，加40kg純化水勻漿后，采用弱酸(醋酸)調(diào)節(jié)pH至
4.0，靜置5h，棄去上清液，沉淀用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的硫酸IOL攪拌溶解，離心后上清液加入30kg無水乙醇沉淀蛋白，離心后，沉淀復(fù)溶于IOL純化水，0-4°C靜置24h，下層油狀物復(fù)溶于IOL純化水，用硫酸調(diào)節(jié)pH至2.0，加入30kg無水乙醇，沉淀在真空干燥箱，置入五氧化二磷，保真空狀態(tài)48h，即可制得硫酸魚精蛋白粗提物。
[0034]對(duì)照品(硫酸魚精蛋白進(jìn)口原料藥)由日本Yuki Gosei Kogyo Co Ltd提供。
[0035]實(shí)施例1
[0036]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0037](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0038]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到5L純化水中，35°C水浴30min，待完全溶解后，用硫酸調(diào)節(jié)pH至1.8 ;
[0039](2)第一次吸附
[0040]稱取硅藻土 150g，加入到上述硫酸魚精蛋白溶液中，30°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去硅藻土，濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.0 ;
[0041](3)第二次吸附
[0042]稱取硅藻土 100g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，80°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去硅藻土 ；
[0043](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0044]取濾液,加入6.0kgO-fC放置過夜的無水乙醇，4000rpm離心10min,棄去上清液；
[0045](5)干燥
[0046]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~0.1MPa，干燥 24h。
[0047](6)收率
[0048]將干媒后的硫Ife魚精蛋白精品稱重，得到硫Ife魚精蛋白精制品256g,收率51.2%。
[0049](7)質(zhì)量控制
[0050]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法見效果實(shí)施)。
[0051]對(duì)比實(shí)施例1
[0052]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0053](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0054]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到5L純化水中，35°C水浴30min，待完全溶解后，用硫酸調(diào)節(jié)pH至4.0 ;
[0055](2)第一次吸附
[0056] 稱取硅藻土 150g，加入到硫酸魚精蛋白溶液中，30°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去硅藻土，濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.0 ;
[0057](3)第二次吸附
[0058]稱取娃藻土 100g,加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，80°C水浴,攪拌吸附3h，過濾除去硅藻土 ；
[0059](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0060]取濾液，加入等量0-4°C放置過夜的無水乙醇，4000rpm，離心10min，棄去上清液；
[0061](5)干燥
[0062]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~0.1MPa，干燥 24h。
[0063](6)收率
[0064]將干燥后的硫酸魚精蛋白精品稱重，得到硫酸魚精蛋白精制品178g,收率35.6%。
[0065](7)質(zhì)量控制
[0066]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法如效果實(shí)施例)。
[0067]對(duì)比實(shí)施例2
[0068]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0069](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0070]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到5L純化水中，35°C水浴30min，待完全溶解后，用硫酸調(diào)節(jié)pH至1.8 ;
[0071](2)第一次吸附
[0072]稱取硅藻土 150g，加入到硫酸魚精蛋白溶液中，30°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去硅藻土，濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.0 ;
[0073](3)第二次吸附
[0074]稱取硅藻土 100g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，80°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去硅藻土 ；
[0075](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0076]取濾液，加入等量0-4°C放置過夜的無水乙醇，4000rpm，離心10min，棄去上清液；
[0077](5)干燥
[0078]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~0.1MPa，干燥 24h。
[0079](6)收率
[0080]將干媒后的硫 Ife魚精蛋白精品稱重，得到硫Ife魚精蛋白精制品134g,收率26.8%。
[0081](7)質(zhì)量控制
[0082]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法如效果實(shí)施例)。
[0083]對(duì)比實(shí)施例3
[0084]硫酸魚精蛋白粗提物精制[0085](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0086]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到5L純化水中，35°C水浴30min，待完全溶解后，用2.5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)pH至5.0 ;
[0087](2)第一次吸附
[0088]稱取硅藻土 150g，加入到上述硫酸魚精蛋白溶液中，40°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去娃藻土，濾液用2.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.5 ; [0089](3)第二次吸附
[0090]稱取硅藻土 100g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，70°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去硅藻土 ；
[0091](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0092]取濾液,加入6.0kgO-fC放置過夜的無水乙醇，4000rpm離心10min,棄去上清液；
[0093](5)干燥
[0094]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~0.1MPa，干燥 24h。
[0095](6)收率
[0096]將干媒后的硫Ife魚精蛋白精品稱重，得到硫Ife魚精蛋白精制品123g,收率
24.6%。
[0097](7)質(zhì)量控制
[0098]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法見效果實(shí)施例)。
[0099]實(shí)施例2
[0100]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0101](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0102]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到IOL純化水中，30°C水浴30min，待完全溶解后，用硫酸調(diào)節(jié)pH至1.2。
[0103](2)第一次吸附
[0104]稱取皂土 150g，加入到硫酸魚精蛋白溶液中，30°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去阜土，濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至11.0。
[0105](3)第二次吸附
[0106]稱取皂土 100g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，85°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去皂土。
[0107](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0108]取濾液，加入等量0-4°C放置過夜的無水乙醇，4000rpm，離心10min，棄去上清液。
[0109](5)干燥
[0110]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~0.1MPa，干燥 24h。
[0111](6)收率
[0112]將干燥后的硫酸魚精蛋白精品稱重，得到硫酸魚精蛋白精制品298g,收率59.6%。[0113](7)質(zhì)量控制
[0114]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法如效果實(shí)施例)。
[0115]對(duì)比實(shí)施例4
[0116]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0117](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0118]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到IOL純化水中，30°C水浴30min，待完全溶解后，用硫酸調(diào)節(jié)pH至3.2。
[0119](2)第一次吸附
[0120]稱取皂土 150g，加入到硫酸魚精蛋白溶液中，30°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去阜土，濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.5。
[0121](3)第二次吸附
[0122]稱取皂土 100g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，85°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去皂土。
[0123](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0124]取濾液，加入等量0-4°C放置過夜的無水乙醇，4000rpm，離心10min，棄去上清液。
[0125](5)干燥
[0126]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~0.1MPa，干燥 24h。
[0127](6)收率
[0128]將干媒后的硫Ife魚精蛋白精品稱重，得到硫Ife魚精蛋白精制品153g,收率30.6%。
[0129](7)質(zhì)量控制
[0130]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法如效果實(shí)施例)。
[0131]實(shí)施例3
[0132]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0133](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0134]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到IOL純化水中，35°C水浴30min，待完全溶解后，用硫酸調(diào)節(jié)pH至1.4。
[0135](2)第一次吸附
[0136]稱取活性炭100g，加入到硫酸魚精蛋白溶液中，30°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去活性炭，濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至12.0。
[0137](3)第二次吸附
[0138]稱取活性炭50g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，85°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去活性炭。
[0139](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0140]取濾液，加入等量0-4°C放置過夜的無水乙醇，4000rpm，離心10min，棄去上清液。
[0141](5)干燥[0142]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~0.1MPa，干燥 24h。
[0143](6)收率
[0144]將干媒后的硫Ife魚精蛋白精品稱重，得到硫Ife魚精蛋白精制品269g,收率53.8%。
[0145](7)質(zhì)量控制
[0146]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法如效果實(shí)施例)。
[0147]對(duì)比實(shí)施例5
[0148]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0149](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0150]準(zhǔn)確 稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到IOL純化水中，35°C水浴30min，待完全溶解后，用硫酸調(diào)節(jié)pH至2.4。
[0151](2)第一次吸附
[0152]稱取活性炭100g，加入到硫酸魚精蛋白溶液中，30°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去活性炭，濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.0。
[0153](3)第二次吸附
[0154]稱取活性炭50g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，85°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去活性炭。
[0155](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0156]取濾液,加入等量0-4?放置過夜的無水乙醇，4000rpm,離心10min,棄去上清液。
[0157](5)干燥
[0158]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~0.1MPa，干燥 24h。
[0159](6)收率
[0160]將干媒后的硫Ife魚精蛋白精品稱重，得到硫Ife魚精蛋白精制品182g,收率36.4%。
[0161](7)質(zhì)量控制
[0162]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法如效果實(shí)施例)。
[0163]實(shí)施例4
[0164]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0165](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0166]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到IOL純化水中，40°C水浴30min，待完全溶解后，用2.5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)pH至1.5。
[0167](2)第一次吸附
[0168]稱取骨炭100g，加入到硫酸魚精蛋白溶液中，30°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去骨炭，濾液用2.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至11.0。
[0169](3)第二次吸附[0170]稱取骨炭50g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，65°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去骨炭。
[0171](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0172]取濾液,加入等量0-4°C放置過夜的無水乙醇，4000rpm,離心10min,棄去上清液。
[0173](5)干燥
[0174]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~0.1MPa，干燥 24h。
[0175](6)收率
[0176] 將干媒后的硫Ife魚精蛋白精品稱重，得到硫Ife魚精蛋白精制品298g,收率59.8%。
[0177](7)質(zhì)量控制
[0178]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法如效果實(shí)施例)。
[0179]實(shí)施例5
[0180]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0181](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0182]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到IOL純化水中，45°C水浴30min，待完全溶解后，用2.5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)pH至1.6。
[0183](2)第一次吸附
[0184]稱取活性礬土 100g，加入到硫酸魚精蛋白溶液中，45°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去活性礬土，濾液用2.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.0。
[0185](3)第二次吸附
[0186]稱取活性礬土 50g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，85°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去活性礬土。
[0187](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0188]取濾液，加入等量0-4°C放置過夜的無水乙醇，4000rpm，離心10min，棄去上清液。
[0189](5)干燥
[0190]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~
0.1MPa，干燥 24h。
[0191](6)收率
[0192]將干媒后的硫Ife魚精蛋白精品稱重，得到硫Ife魚精蛋白精制品2658,收率53%。
[0193](7)質(zhì)量控制
[0194]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法如效果實(shí)施例)。
[0195]實(shí)施例6
[0196]硫酸魚精蛋白粗提物精制
[0197](I)硫酸魚精蛋白粗提物溶解
[0198]準(zhǔn)確稱取硫酸魚精蛋白粗提物(由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供)500g，加入到IOL純化水中，50°C水浴30min，待完全溶解后，用2.5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)pH至1.3。[0199](2)第一次吸附
[0200]稱取硅膠100g，加入到硫酸魚精蛋白溶液中，50°C水浴攪拌約2h，濾紙過濾，除去硅膠，濾液用2.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.0。
[0201](3)第二次吸附
[0202]稱取硅膠50g，加入到已經(jīng)調(diào)節(jié)好pH的硫酸魚精蛋白溶液中，75°C水浴，攪拌吸附3h，過濾除去硅膠。
[0203](4)有機(jī)溶劑沉淀
[0204]取濾液，加入等量0-4°C放置過夜的無水乙醇，4000rpm，離心10min，棄去上清液。
[0205](5)干燥
[0206]取下層沉淀物，放入真空干燥箱，放入500g五氧化二磷，真空度保持0.08~
0.1MPa，干燥 24h。
[0207](6)收率
[0208]將干媒后的硫Ife魚精蛋白精品稱重，得到硫Ife魚精蛋白精制品246g,收率49.2%。
[0209](7)質(zhì)量控制
[0210]取精制后的硫酸魚精蛋白通過陽離子交換色譜鑒定其純度(方法如效果實(shí)施例)。
[0211]效果實(shí)施例1
[0212]純化前后硫酸魚精蛋白純度鑒定
[0213]采用離子交換層析鑒定純化前后硫酸魚精蛋白純度，色譜條件如下:
[0214]色譜柱:HiTrap SP FF預(yù)裝柱(5ml) (GE公司生產(chǎn))
[0215]純化系統(tǒng):AKTA Explorer (GE公司生產(chǎn))
[0216]上樣量:0.5ml
[0217]樣品濃度:10mg/ml
[0218]平衡液:50mmol/LTris-HCl, pH8.0
[0219]洗脫液:pH8.0,50mmol/L Tris_HCl+2mol/L NaCl
[0220]檢測波長:220nm，260nm
[0221]流速:5ml/min
[0222]檢測方法:0min — 3min:平衡液平衡
[0223]3.0lmin — IOmin:100%平衡液+0%洗脫液一O %平衡液+100%洗脫液線性梯度洗脫
[0224]10.01min — 13min:洗脫液
[0225] 所用填料為強(qiáng)陽離子，洗脫液的鹽濃度為150-200mS/cm，洗脫8個(gè)柱體積。純化前后及對(duì)照品(硫酸魚精蛋白進(jìn)口原料藥，由日本Yuki Gosei Kogyo Co Ltd提供)的實(shí)驗(yàn)
結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下表所示:
[0226]
【權(quán)利要求】
1.一種硫酸魚精蛋白的純化方法，其包括下述步驟: (1)將硫酸魚精蛋白粗提物溶解于水中得溶液，加入酸，調(diào)節(jié)溶液pH值為I~2; (2)加入吸附劑，攪拌，過濾，得到濾液； (3)加入堿，調(diào)節(jié)濾液pH值為10~12，再加入吸附劑，攪拌，過濾； (4)加入有機(jī)溶劑，離心除去上清液，將沉淀物真空干燥，即得； 其中，步驟(2)與步驟(3)中所述的吸附劑為硅藻土、活性礬土、皂土、骨炭、活性炭和硅膠中的一種或多種。
2.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的水為純化水；所述的硫酸魚精蛋白粗提物與所述的水的質(zhì)量比為1: (10~30)； 和/或，步驟(1)中，所述的酸為硫酸。
3.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的吸附劑與所述的溶液的質(zhì)量比為5: (1000~100)； 和/或，步驟(2)中，所述的攪拌為在水浴條件下攪拌，所述的水浴的溫度為30~50°C，所述的攪拌的時(shí)間為1~3小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的堿為氫氧化鈉和/或氫氧化鉀； 和/或，步驟⑶中，所述的吸附劑與所述的溶液的質(zhì)量比為5:(1000~100)； 和/或，步驟(3)中，所述的攪拌為在水浴條件下攪拌，所述的水浴的溫度為60~85°C，所述的攪拌的時(shí)間為I~3小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑為乙醇、乙醚、丙酮和甲醇中的一種或多種，所述的有機(jī)溶劑與所述的溶液的質(zhì)量比為(1.0~3.5):1。
6.如權(quán)利要求5所述的純化方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑為O~4°C放置過夜的無水乙醇。
7.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述的離心的轉(zhuǎn)速為3000~5000rpm，所述的離心的時(shí)間為10~20min。
8.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述的真空干燥的真空度為0.08~0.1MPa，所述的真空干燥的時(shí)間為24~30小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述的真空干燥在放入五氧化二磷的真空干燥箱中進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述的硫酸魚精蛋白粗提物通過下述方法制得:將魚白與純化水的混合物勻漿后，加入醋酸調(diào)節(jié)pH為3.5~4.5，沉淀物用硫酸溶解，離心后上清液用無水乙醇沉淀，沉淀物溶于純化水，O~4°C靜置，下層油狀物溶于純化水中，硫酸調(diào)節(jié)pH為1.5~2.5，加入無水乙醇沉淀，沉淀物干燥，即得硫酸魚精蛋白粗提物。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK103936846SQ201410182824
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】江文濤, 黃臻輝 申請(qǐng)人:上海第一生化藥業(yè)有限公司