本發(fā)明涉及一種中成藥的質(zhì)量控制方法，特別涉及一種養(yǎng)血清腦顆粒中神經(jīng)元保護(hù)生物活性的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：
：

中藥質(zhì)量控制一直是中藥現(xiàn)代化一大難題，也是中藥走向世界的瓶頸；單味中藥材本身已是一個(gè)復(fù)雜體系，那么由多味中藥組成的復(fù)方制劑，其系統(tǒng)的復(fù)雜程度更不言而喻，這使得復(fù)方制劑的質(zhì)量控制變得愈加困難。中藥質(zhì)量控制的最終目的是保證中藥的安全性和有效性；而現(xiàn)行中藥制劑質(zhì)量控制方法如常規(guī)鑒別檢查、少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)性成分含量測(cè)定以及化學(xué)指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)等則主要用于評(píng)價(jià)其表觀成分的一致性，不僅無(wú)法關(guān)聯(lián)藥效或毒副作用，且存在被勾兌的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，表觀化學(xué)成分的重現(xiàn)也可能導(dǎo)致對(duì)樣品質(zhì)量合格與否的誤判，其潛在風(fēng)險(xiǎn)更大。生物活性測(cè)定方法因具有整體可控、藥效相關(guān)等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，作為符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的適用質(zhì)量控制模式及方法，漸已成為中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的重要發(fā)展方向之一。同時(shí)，國(guó)家藥典委員會(huì)已明確表示“中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)逐步由單一指標(biāo)成分定性定量測(cè)定開(kāi)始向活性有效成分及生物檢定的綜合檢測(cè)過(guò)渡”，與國(guó)內(nèi)一致，美國(guó)植物藥指南中關(guān)于藥材、提取物、制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定中也一直強(qiáng)調(diào)增加生物測(cè)試項(xiàng)目(Biological assay)。因此，生物活性測(cè)定方法可有效地彌補(bǔ)現(xiàn)行化學(xué)成分層面難以全面監(jiān)控中藥復(fù)方質(zhì)量的局限。在以前的研究中，我們已成功地將斑馬魚模型應(yīng)用于藥物藥效學(xué)、毒理學(xué)及藥物代謝中。

養(yǎng)血清腦顆粒是在中國(guó)傳統(tǒng)名方四物湯的基礎(chǔ)上，以當(dāng)歸、川芎、鉤藤、白芍、夏枯草等11味中藥組成，具有養(yǎng)血平肝、活絡(luò)止痛的功效，主要用于血虛肝旺所致頭痛，眩暈眼花，心煩易怒，失眠多夢(mèng)，是受國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的中藥品種。

本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，以養(yǎng)血清腦顆粒為研究對(duì)象，建立了一種養(yǎng)血清腦顆粒的質(zhì)量控制方法，本發(fā)明選用斑馬魚神經(jīng)元損傷模型，對(duì)不同批次的養(yǎng)血清腦顆粒的生物活性進(jìn)行檢測(cè)，確立標(biāo)準(zhǔn)的養(yǎng)血清腦顆粒生物活性指標(biāo)，以對(duì)生產(chǎn)中的養(yǎng)血清腦顆粒進(jìn)行相同的指標(biāo)檢測(cè)，以控制生產(chǎn)質(zhì)量，同時(shí)建立了中藥復(fù)方 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中“生物活性測(cè)定”方法，同時(shí)也為其他藥效物質(zhì)不清楚的復(fù)方中藥的生物活性質(zhì)量控制研究提供相應(yīng)參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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為此，本發(fā)明提供一種養(yǎng)血清腦顆粒生物活性的檢測(cè)方法，所述方法步驟如下：

步驟1，對(duì)照品溶液的制備，

步驟2，供試品溶液的制備，

步驟3，用斑馬魚神經(jīng)元損傷模型對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率。

其中，所述對(duì)照品溶液的制備，方法如下：

取二甲基亞砜用蒸餾水配制成0.01-0.3％的溶液，作為溶劑對(duì)照組；

取還原性谷胱甘肽用蒸餾水配制成0.1-1.0mol.L-1的溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照組。

優(yōu)選的，所述對(duì)照品溶液的制備，方法如下：

取二甲基亞砜用蒸餾水配制成0.1％的溶液，作為溶劑對(duì)照組；

取還原性谷胱甘肽用蒸餾水配制成0.5mol.L-1的溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照組。

其中，所述供試品溶液的制備，方法如下：

取供試品適量，用超純水分別溶解并稀釋至1000，750，500，250，100μg·mL-1，即得。

其中，所述斑馬魚神經(jīng)元損傷模型，方法如下：

用0.2～0.3mol·mL-1嗎替麥考酚酯對(duì)受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎處理20-25h；用吖啶橙染料染色，凋亡細(xì)胞呈熒光綠色，熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)判斷造模成功率。斑馬魚選用的是受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎。

其中，所述對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率方法如下：

將對(duì)照溶液和供試品溶液分別加入斑馬魚神經(jīng)元損傷模型中處理后，使用三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行過(guò)度暴露處死，并用吖啶橙染料對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行活體染色后在熒光顯微鏡下觀察、拍照，統(tǒng)計(jì)斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度F，定量計(jì)算評(píng)價(jià)養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率P％,用GraphPad軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，用方差分析和Dunnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

其中的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率P％計(jì)算公式如下：

F為斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

優(yōu)選的方法如下：

分別取溶劑對(duì)照組溶液、陽(yáng)性對(duì)照組溶液和各濃度供試品溶液各2-10mL，分別注入斑馬魚神經(jīng)元損傷模型中處理24h后，使用0.3～0.8mmol·L-1的三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行過(guò)度暴露處死，并用吖啶橙染料對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行活體染色1-2h，染色結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

更優(yōu)選的，方法如下：

分別取溶劑對(duì)照組溶液、陽(yáng)性對(duì)照組溶液和各濃度供試品溶液各5mL，分別注入斑馬魚神經(jīng)元損傷模型中處理24h后，使用0.64mmol·L-1的三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行過(guò)度暴露處死，并用吖啶橙染料對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行活體染色1h，染色結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

本發(fā)明還提供一種養(yǎng)血清腦顆粒生物活性的檢測(cè)方法，所述方法還包括步驟4，利用步驟3測(cè)定不同批次的養(yǎng)血清腦顆粒，計(jì)算確定出標(biāo)準(zhǔn)的養(yǎng)血清腦顆粒生物活性指標(biāo)，并以該指標(biāo)為依據(jù)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中或儲(chǔ)存過(guò)程中的養(yǎng)血清腦顆粒進(jìn)行生物活性檢測(cè)以確定養(yǎng)血清腦顆粒的質(zhì)量是否合格。

本發(fā)明的方法是經(jīng)過(guò)篩選獲得的，篩選方法如下：

1、實(shí)驗(yàn)材料：

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

IPP6.0圖像處理軟件(Media Cybernetics公司)，Nest Biotech 6孔板，熒光顯微鏡(深圳市科視威光學(xué)儀器有限公司)。嗎替麥考酚酯(阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：128794-94-5)，還原型谷胱甘肽(阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：70-18-8)，吖啶橙染料(Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：494-38-2)，養(yǎng)血清腦顆粒(天津天士力制藥集團(tuán)有限公司)，6批效期內(nèi)制劑批號(hào)(S1～S6)：130225，130226，130175，130565，130601，130606；3批過(guò)期制劑批號(hào)(S7～S9)：090829，091134，091211。3批特殊處理制劑批號(hào)(S10～S12)：130225。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚是目前生命科學(xué)研究中重要的模式脊椎動(dòng)物之一，作為一種新型的模式動(dòng)物，斑馬魚具有典型的脊椎動(dòng)物腦部特征，神經(jīng)行為遵循順序發(fā)育原則。與嚙齒動(dòng)物模型相比，它具有飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)卵量大，發(fā)育快速，胚胎透明，易于觀察，動(dòng)物產(chǎn)生的應(yīng)激少以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較客觀等優(yōu)點(diǎn)。目前模式動(dòng)物斑馬魚已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)損傷和神經(jīng)行為學(xué)等神經(jīng)科學(xué)研究。因此，本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)化的斑馬魚神經(jīng)元損傷藥效模型，采用AO染色與凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度定量分析可對(duì)藥物的體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效率進(jìn)行快速、可靠的評(píng)價(jià)。

斑馬魚選用的是受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎；胚胎的繁殖以自然成對(duì)交配的方式進(jìn)行。在28℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎(養(yǎng)魚用水水質(zhì)：每1L反滲透水中加入200mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510μS·cm-1；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6mg·L-1 CaCO3)。因?yàn)榕咛タ梢詮淖陨淼穆腰S囊中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以在受精后9天內(nèi)不需要喂食。用0.64mmol·L-1的三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行過(guò)度暴露處理，從而將斑馬魚麻醉處死；麻醉處死的操作步驟符合美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)(AVMA)對(duì)動(dòng)物麻醉處死的規(guī)范要求。

斑馬魚胚胎由杭州環(huán)特生物科技有限公司提供，使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2012-0171。

2、斑馬魚神經(jīng)元損傷模型建立

用0.25mol·mL-1嗎替麥考酚酯(MMF)對(duì)受精一天野生型AB系胚胎斑馬魚處理24h，誘導(dǎo)斑馬魚中樞神經(jīng)損傷模型；吖啶橙(AO)染料染色，凋亡細(xì)胞呈熒光綠色，熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)判斷造模成功率(造模成功率95％)，如圖1所示。

斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度定量分析可對(duì)藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效率進(jìn)行快速、可靠的評(píng)價(jià)。

3、供試品溶液的制備

取不同批次的養(yǎng)血清腦顆粒制劑適量，用超純水溶解，作為藥液母液，置4℃冰箱備用；用超純水稀釋到相應(yīng)濃度進(jìn)行藥效活性檢測(cè)。

4、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)藥效測(cè)定方法建立

養(yǎng)血清腦顆粒作為11味中藥組成的大復(fù)方，在缺血性腦血管病的治療中被廣泛應(yīng)用，臨床療效顯著，安全可靠。前期藥理研究表明，養(yǎng)血清腦顆粒通過(guò)選擇性的抑制谷氨酸、caspase-3的表達(dá)，并且通過(guò)谷氨酸鹽合成酶選擇性抑制興奮性 氨基酸谷氨酸的神經(jīng)毒性作用，減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。根據(jù)養(yǎng)血神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，選擇同樣是通過(guò)抑制谷氨酸表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的還原性谷胱甘肽作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

選用受精一天的野生型AB系斑馬魚胚胎，將受精20-25h斑馬魚胚胎放入6孔板中，加入培養(yǎng)基3mL，每孔加入30條幼魚胚胎，嗎替麥考酚酯(MMF)造模但無(wú)藥物治療組為模型組，0.1％DMSO為溶劑對(duì)照組，0.50mol·L-1還原型谷胱甘肽(GSH)為陽(yáng)性對(duì)照組，將供試品溶液制備中的養(yǎng)血清腦顆粒(工作參照物S1，批號(hào)：130225)母液用超純水分別稀釋至1000，750，500，250，100μg·mL-1各5mL，作為受試組，造模同時(shí)分別加入不同濃度的S1樣品處理24h。藥物處理結(jié)束后，使用0.64mM的三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行過(guò)度暴露處死；然后用AO染料對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行活體染色1h；染色結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。統(tǒng)計(jì)斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度(F)，定量評(píng)價(jià)養(yǎng)血清腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率P％效果。計(jì)算公式如下：

5、數(shù)據(jù)處理

GraphPad 5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，用方差分析和Dunnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，*P<0.05，**P<0.01。

6、結(jié)果

各濃度養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度F值與神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率P％見(jiàn)表1。

如圖2所示，溶劑對(duì)照組斑馬魚中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡較少，凋亡細(xì)胞熒光信號(hào)弱；嗎替麥考酚酯誘導(dǎo)的模型組斑馬魚中樞神經(jīng)凋亡細(xì)胞非常明顯(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照治療藥谷胱甘肽組(GSH 0.50mol·L-1)神經(jīng)保護(hù)藥效為104.6％，與模型組相比，斑馬魚中樞神經(jīng)凋亡細(xì)胞顯著減少(P<0.01)。與模型組相比，養(yǎng)血清腦顆粒100，250，500，750和1000μg·mL-1組，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率分別為14.2％，20.5％，49.5％，65.1％和85.7％。

以藥物濃度(C)為橫坐標(biāo)，以神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率(P％)為縱坐標(biāo)，通過(guò)試驗(yàn)數(shù) 據(jù)進(jìn)行線性回歸和計(jì)算，回歸方程為：P％＝0.082C+4.439，r＝0.995。以上結(jié)果表明在100～1000μg·mL-1內(nèi)，養(yǎng)血對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率成良好的線性關(guān)系。另外用GraphPad 5.0軟件擬合量-效曲線，養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用EC50值為522μg·mL-1。因此選擇480-550μg·mL-1作為考察不同批次制劑神經(jīng)保護(hù)作用的給藥濃度。

表1 養(yǎng)血清腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用(Mean±SD)

注：n為每組測(cè)定的斑馬魚數(shù)目；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

7、方法學(xué)考察

7.1精密度

分別平行制備三批養(yǎng)血清腦顆粒(S1，S2，S3)樣品3份，按照上述方法分別進(jìn)行日內(nèi)與日間精密度考察，重復(fù)操作6次。日內(nèi)精密度采用三批制劑分別對(duì)同一批斑馬魚按本發(fā)明建立的方法進(jìn)行測(cè)定；不同批次制劑的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率無(wú)明顯差異(P<0.05)，RSD為2.2～3.7％。日間精密度考察采用同一批養(yǎng)血制劑對(duì)3個(gè)不同批次斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率測(cè)定，不同批次斑馬魚之間的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率無(wú)顯著差異(P<0.05)，RSD為1.2％。(表2)日內(nèi)與日間精密度結(jié)果表明斑馬魚神經(jīng)元損傷藥物評(píng)價(jià)模型具有很好的可靠性和重復(fù)性。

表2 養(yǎng)血清腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)藥效精密度考察

3.3.2重復(fù)性考察

平行制備養(yǎng)血清腦顆粒(S1)的6份，分別處理同一批次的斑馬魚24h，不同樣品處理后均有明顯的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)藥效，且6個(gè)樣品處理組的斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效率之間均無(wú)顯著性差異(P<0.05)，RSD為8.4％(表3)，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

表3 養(yǎng)血清腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)藥效重復(fù)性考察

3.3.3穩(wěn)定性考察

分別于0，3，6，12和24h將室溫放置的同一供試品溶液進(jìn)行生物藥效活性檢測(cè)，計(jì)算RSD為4.9％，結(jié)果說(shuō)明供試品溶液在室溫放置24h內(nèi)是穩(wěn)定的。

有益效果：

中藥成分復(fù)雜，單純效仿化學(xué)藥基于成分論的質(zhì)量控制模式，對(duì)于物質(zhì)基礎(chǔ)不明的中藥很難控制臨床上的有效性和安全性。因此，將生物測(cè)定引入到中藥質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)中來(lái)，是中藥質(zhì)量控制模式和方法研究的重要發(fā)展方向。本發(fā)明中選擇的斑馬魚神經(jīng)損傷模型具有關(guān)聯(lián)藥效，可測(cè)可評(píng)的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)本發(fā)明中使用的生物測(cè)試方法具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定、可靠的優(yōu)點(diǎn)。需要特別強(qiáng)調(diào)的是本方法的專屬性，根據(jù)養(yǎng)血清腦顆粒臨床上具有神經(jīng)保護(hù)作用而選擇斑馬魚神經(jīng)元損傷模型，同時(shí)根據(jù)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效率來(lái)定量評(píng)價(jià)養(yǎng)血清腦顆粒質(zhì)量?jī)?yōu)劣，說(shuō)明本方法具有較強(qiáng)的專屬性。但是，本方法同樣可用于其他類神經(jīng)保護(hù)作用中藥產(chǎn)品的活性評(píng)價(jià)中，因此不具有排他性。本項(xiàng)研究為養(yǎng)血清腦顆粒的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了新的思路和技術(shù)支持，同時(shí)也有效的解決化學(xué)分析或指紋圖譜等方法在中藥質(zhì)量控制方面存在的不足，是對(duì)中藥質(zhì)量控制體系的有效補(bǔ)充與完善。本研 究可作為一種新型的生物活性質(zhì)量評(píng)價(jià)方法推廣于其他類中藥生物質(zhì)控中。

附圖說(shuō)明

圖1嗎替麥考酚酯造模后斑馬魚表型圖(圖中熒光點(diǎn)為斑馬魚凋亡神經(jīng)細(xì)胞)

圖2養(yǎng)血清腦顆粒神經(jīng)保護(hù)作用表型圖

具體實(shí)施方式：

以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種養(yǎng)血清腦顆粒生物活性的檢測(cè)方法，所述方法步驟如下：

步驟1，對(duì)照品溶液的制備，

步驟2，供試品溶液的制備，

步驟3，用斑馬魚神經(jīng)元損傷模型對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率。

其中，所述對(duì)照品溶液的制備，方法如下：取二甲基亞砜用蒸餾水配制成0.1％的溶液，作為溶劑對(duì)照組；取還原性谷胱甘肽用蒸餾水配制成0.5mol.L-1的溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照組。

其中，所述供試品溶液的制備，方法如下：取供試品適量，用超純水分別溶解并稀釋至1000，750，500，250，100μg·mL-1，即得。

其中，所述斑馬魚神經(jīng)元損傷模型，方法如下：用0.25mol·mL-1嗎替麥考酚酯對(duì)受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎處理24h；用吖啶橙染料染色，凋亡細(xì)胞呈熒光綠色，熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)判斷造模成功率。斑馬魚選用的是受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎。

其中，所述檢對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率方法如下：

分別取溶劑對(duì)照組溶液、陽(yáng)性對(duì)照組溶液和各濃度供試品溶液各5mL，分別注入斑馬魚神經(jīng)元損傷模型中處理24h后，使用0.64mmol·L-1的三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行過(guò)度暴露處死，并用吖啶橙染料對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行活體染色1h，染色結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

其中，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率P％計(jì)算公式如下：

F為斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

實(shí)施例2

一種養(yǎng)血清腦顆粒生物活性的檢測(cè)方法，所述方法步驟如下：

步驟1，對(duì)照品溶液的制備，

步驟2，供試品溶液的制備，

步驟3，用斑馬魚神經(jīng)元損傷模型對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率。

其中，所述對(duì)照品溶液的制備，方法如下：取二甲基亞砜用蒸餾水配制成0.01％的溶液，作為溶劑對(duì)照組；取還原性谷胱甘肽用蒸餾水配制成0.1mol.L-1的溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照組。

其中，所述供試品溶液的制備，方法如下：取供試品適量，用超純水分別溶解并稀釋至1000，750，500，250，100μg·mL-1，即得。

其中，所述斑馬魚神經(jīng)元損傷模型，方法如下：用0.2mol·mL-1嗎替麥考酚酯對(duì)受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎處理20h；用吖啶橙染料染色，凋亡細(xì)胞呈熒光綠色，熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)判斷造模成功率。斑馬魚選用的是受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎。

其中，所述檢對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率方法如下：

分別取溶劑對(duì)照組溶液、陽(yáng)性對(duì)照組溶液和各濃度供試品溶液各2mL，分別注入斑馬魚神經(jīng)元損傷模型中處理24h后，使用0.3mmol·L-1的三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行過(guò)度暴露處死，并用吖啶橙染料對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行活體染色2h，染色結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

其中，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率P％計(jì)算公式如下：

F為斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

實(shí)施例3

一種養(yǎng)血清腦顆粒生物活性的檢測(cè)方法，所述方法步驟如下：

步驟1，對(duì)照品溶液的制備，

步驟2，供試品溶液的制備，

步驟3，用斑馬魚神經(jīng)元損傷模型對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率。

其中，所述對(duì)照品溶液的制備，方法如下：取二甲基亞砜用蒸餾水配制成0.3％的溶液，作為溶劑對(duì)照組；取還原性谷胱甘肽用蒸餾水配制成1.0mol.L-1的溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照組。

其中，所述供試品溶液的制備，方法如下：取供試品適量，用超純水分別溶解并稀釋至1000，750，500，250，100μg·mL-1，即得。

其中，所述斑馬魚神經(jīng)元損傷模型，方法如下：用0.3mol·mL-1嗎替麥考酚酯對(duì)受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎處理25h；用吖啶橙染料染色，凋亡細(xì)胞呈熒光綠色，熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)判斷造模成功率。斑馬魚選用的是受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎。

其中，所述檢對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率方法如下：

分別取溶劑對(duì)照組溶液、陽(yáng)性對(duì)照組溶液和各濃度供試品溶液各10mL，分別注入斑馬魚神經(jīng)元損傷模型中處理24h后，使用0.8mmol·L-1的三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行過(guò)度暴露處死，并用吖啶橙染料對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行活體染色1h，染色結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

其中，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率P％計(jì)算公式如下：

F為斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

實(shí)施例4

一種養(yǎng)血清腦顆粒生物活性的檢測(cè)方法，所述方法步驟如下：

步驟1，對(duì)照品溶液的制備，

步驟2，供試品溶液的制備，

步驟3，用斑馬魚神經(jīng)元損傷模型對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率。

其中，所述對(duì)照品溶液的制備，方法如下：取二甲基亞砜用蒸餾水配制成0.1％的溶液，作為溶劑對(duì)照組；取還原性谷胱甘肽用蒸餾水配制成0.5mol.L-1的溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照組。

其中，所述供試品溶液的制備，方法如下：取供試品適量，用超純水分別溶解并稀釋至1000，750，500，250，100μg·mL-1，即得。

其中，所述斑馬魚神經(jīng)元損傷模型，方法如下：用0.25mol·mL-1嗎替麥考酚酯對(duì)受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎處理24h；用吖啶橙染料染色，凋亡細(xì)胞呈熒光綠色，熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)判斷造模成功率。斑馬魚選用的是受精后24h野生型AB系斑馬魚胚胎。

其中，所述檢對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算供試品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)率方法如下：

分別取溶劑對(duì)照組溶液、陽(yáng)性對(duì)照組溶液和各濃度供試品溶液各5mL，分別注入斑馬魚神經(jīng)元損傷模型中處理24h后，使用0.5mmol·L-1的三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行過(guò)度暴露處死，并用吖啶橙染料對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行活體染色2h，染色結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

其中，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率P％計(jì)算公式如下：

F為斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

實(shí)施例5

按照本發(fā)明建立的生物活性測(cè)定方法測(cè)定不同生產(chǎn)批次的養(yǎng)血清腦顆粒制劑，其中包括在效期內(nèi)的6批制劑，3批過(guò)期制劑，3批經(jīng)破壞后的制劑；分別為高溫、光照、10％H2O2破壞后樣品。該12批制劑的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)藥效結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果可見(jiàn)不同條件下的養(yǎng)血樣品對(duì)斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)藥效有明顯差異，其中 S1～S6為效期內(nèi)的合格制劑，其神經(jīng)保護(hù)率在55.8～61.3％之間，具有顯著的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用(P<0.01)；S7～S9為過(guò)效期制劑，其神經(jīng)保護(hù)率在26.7～46.3％之間，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率較低，與合格批次相比顯著性(P<0.01)；S10～S12為經(jīng)過(guò)特殊破壞后的制劑；其神經(jīng)保護(hù)效率差異較大；以上結(jié)果提示通過(guò)斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)藥效活性測(cè)定可以定性的表征養(yǎng)血清腦顆粒質(zhì)量的優(yōu)劣。

表4 養(yǎng)血清腦顆粒神經(jīng)保護(hù)藥效結(jié)果(Mean±SD)

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

本發(fā)明中斑馬魚神經(jīng)損傷模型作為心腦血管藥物生物學(xué)內(nèi)控檢測(cè)方法具有較好的精密度重復(fù)性，具有關(guān)聯(lián)藥效，可測(cè)可評(píng)的特點(diǎn)。本發(fā)明中選擇了不同批次的養(yǎng)血清腦顆粒制劑，根據(jù)前期化學(xué)成分研究結(jié)果選擇6批合格制劑，3批過(guò)期制劑以及3批經(jīng)破壞后養(yǎng)血制劑進(jìn)行生物活性質(zhì)控評(píng)價(jià)，結(jié)果表明合格制劑均具有顯著的神經(jīng)保護(hù)率，過(guò)期以及破壞性樣品的神經(jīng)保護(hù)效率則大大降低，表明該方法可用于有效的區(qū)分合格與不合格樣品。