本發(fā)明屬于免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測CRP、SAA的免疫層析試劑盒及制備和使用方法。

背景技術(shù)：

C-反應(yīng)蛋白：CRP(C-Reactive protein)當(dāng)人體受了微生物等多種因子侵襲后，肝臟在幾小時內(nèi)產(chǎn)生一種急性期反應(yīng)蛋白，常規(guī)CRP在感染發(fā)生后6—8h即開始升高，24—48h達到高峰，高峰值可達正常的數(shù)百倍，在感染消除后其含量急驟下降，一周內(nèi)可恢復(fù)正常。這為疾病早期感染類型的鑒別提供了重要的依據(jù)。常規(guī)CRP檢測主要用于感染性疾病的實驗檢查依據(jù)。

常規(guī)CRP對于感染的診斷和鑒別已經(jīng)在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，目前對于CRP與其他指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用也日益受到重視。

血清淀粉樣蛋白A(serμm amyloid A,SAA)是組織淀粉樣蛋白A的前體物質(zhì)，屬于急性時相反應(yīng)蛋白。SAA是血液中以低水平存在的正常組份。當(dāng)人體有病毒或細菌感染性炎癥、活動性病變、組織大面積損傷時很快升高。特別是在病毒急性感染時(48～72h)可迅速升高，并在疾病的恢復(fù)期迅速下降。因此SAA是感染機體病毒時極有效的輔助診斷指標(biāo)。

聯(lián)合檢測的臨床有用性SAA是感染性疾病輔助診斷的新試驗。SAA、CRP的組合檢測更能體現(xiàn)優(yōu)勢互補，對細菌和病毒感染的診斷和鑒別診斷又多了一份依據(jù)，更能體現(xiàn)單項指標(biāo)不能反映的臨床增值意義。組合檢測的特點和臨床意義簡述如下：細菌和病毒感染鑒別診斷的意義：SAA在細菌和病毒感染的早期均可升高，而CRP對病毒感染時一般不增高的特點，因此兩者同時檢測可對早期細菌和病毒感染的鑒別診斷提供有力的數(shù)據(jù)。例如兩者均增高細菌感染的趨向性較大；而CRP正常SAA明顯增高者,結(jié)合臨床對病毒性感染的趨向性診斷又多了一份依據(jù)。特別是在嬰幼兒感染性疾病的早期，細菌和病毒感染確是很難鑒別，而SAA和CRP的聯(lián)合檢測比單獨測CRP更有獨特的意義。

目前市場上沒有已獲得注冊證的能同時檢測CRP和SAA濃度的試劑盒，臨床上目前有單獨檢測CRP和SAA的試劑盒，如果需要同時檢測兩者的結(jié)果，需要檢驗科進行兩次操作，而且根據(jù)試劑盒所需的標(biāo)本類型不同，患者還可能需要重復(fù)取樣，不僅增加了試劑，耗材的浪費，增加了檢測治療的成本，還給患者造成了額外的負擔(dān)。

通過對現(xiàn)有專利文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，天津中新科炬生物制藥有限公司的中國發(fā)明專利申請《一種同時定量檢測SAA/PCT/CRP的檢測裝置》、申請?zhí)枺?01511030398.4提供一種同時定量檢測SAA/PCT/CRP的檢測裝置，由互相獨立的人血清淀粉樣蛋白A(SAA)，人降鈣素原(PCT)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)檢測試紙，三聯(lián)卡殼和附帶了相應(yīng)判斷方法和標(biāo)準曲線的免疫層析判讀結(jié)果記錄儀組成的一種同時快速定量檢測SAA/PCT/CRP的檢測裝置。但該方法為三聯(lián)卡殼，需要分別加樣3次，而且加樣的量及方法也不一樣，并不能降低試劑及耗材的成本，不能實現(xiàn)真正意義上的聯(lián)檢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種基于納米金的檢測CRP、SAA的免疫層析試劑盒及制備和使用方法。該試劑盒提供了一種能同時檢測CRP和SAA濃度的納米金免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l，該試紙條用CRP，SAA單克隆抗體作為反應(yīng)線，用兔IgG作為質(zhì)控線。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明涉及一種同時定量檢測CRP、SAA的納米膠體金免疫層析試劑盒，包括免疫層析檢測試劑板、納米膠體金應(yīng)用溶液和血液采樣裝置，所述免疫層析檢測試劑板包含設(shè)有抗CRP包被線、抗SAA包被線和兔抗質(zhì)控包被線的硝酸纖維素膜；所述納米膠體金應(yīng)用溶液包含綴合配對SAA抗體的抗SAA納米膠體金金貯、綴合配對CRP抗體的抗CRP納米膠體金金貯、綴合羊抗兔納米膠體金金貯以及穩(wěn)定緩沖液。

優(yōu)選的，所述試劑盒的檢測基礎(chǔ)是固相雙抗體夾心的免疫反應(yīng)。

優(yōu)選的，所述血液采樣裝置為吸管或血液定量采集、轉(zhuǎn)移和稀釋的一體化裝置。所述血液定量采集、轉(zhuǎn)移和稀釋的一體化裝置記載在申請?zhí)?01120045729.2的在先實用新型專利。

優(yōu)選的，所述納米膠體金應(yīng)用溶液為包含終濃度0.5-2μg/mL羊抗兔抗體的金貯、終濃度0.5-2μg/mL抗SAA抗體的金貯、終濃度0.5-2μg/mL抗CRP抗體的金貯、終濃度1-3μg/mL的CRP游離抗體，5-10mg/mLBSA或Casein、1-10mg/mL表面活性劑的硼酸鹽緩沖液。

優(yōu)選的，所述抗體是指單克隆或多克隆抗體優(yōu)選的。

所述金貯(納米膠體金金貯)是指納米膠體金與識別目標(biāo)蛋白特定位點的抗體靜電結(jié)合形成的復(fù)合物。

優(yōu)選的，所述納米膠體金的粒徑范圍為15-50nm。

第二方面，本發(fā)明還涉及一種前述的同時定量檢測CRP、SAA的納米膠體金免疫層析試劑盒的制備方法，所述方法包括如下步驟：

S1、免疫層析檢測試劑板的制備：在底板中間粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的一端貼上樣品墊，另一端貼上吸水墊，在硝酸纖維素膜中間靠近樣品墊的一側(cè)起依次噴上抗CRP包被線、抗SAA包被線和兔抗質(zhì)控包被線，切條，安裝到卡殼；

S2、納米膠體金應(yīng)用溶液的制備：在硼酸鹽緩沖液中加入終濃度0.5-2μg/mL羊抗兔抗體的金貯、終濃度0.5-2μg/mL抗SAA抗體的金貯、終濃度0.5-2μg/mL抗CRP抗體的金貯、終濃度1-3μg/mL的CRP游離抗體，5-10mg/mLBSA或Casein、終濃度1-10mg/mL表面活性劑制備得到納米膠體金應(yīng)用溶液。

所述表面活性劑優(yōu)選Trition-100。

優(yōu)選的，步驟S1中，硝酸纖維素膜上分別以0.8-1μl/cm的噴量依次噴涂抗CRP單克隆抗體溶液、抗SAA單克隆抗體溶液、兔抗體溶液形成抗CRP包被線、抗SAA包被線和兔抗質(zhì)控包被線。

優(yōu)選的，用檸檬酸緩沖液分別稀釋抗SAA單克隆抗體，抗CRP單克隆抗體，兔抗體配制得到所述抗SAA單克隆抗體溶液、抗CRP單克隆抗體溶液和兔抗體溶液。

優(yōu)選的，步驟S1中，將抗SAA單克隆抗體、抗CRP單克隆抗體、兔抗體分別用pH為5.2-5.5的0.05-1.5M檸檬酸沖液稀釋成0.5-2.0mg/ml，同時添加終濃度10-20/mL的蔗糖和終濃度0.1-0.5/mLSDS，即可分別配制得到抗SAA單克隆抗體溶液、抗CRP單克隆抗體溶液和兔抗體溶液。

優(yōu)選的，步驟S2中，所述硼酸鹽緩沖液為含5-10mg/mLNaCl、1.5-2mg/mL疊氮鈉的0.01-0.1M硼酸-硼砂緩沖液。

優(yōu)選的，步驟S2中，按1-10μl/mL的濃度在納米膠體金中加入K₂CO₃調(diào)節(jié)pH，加入羊抗兔抗體、抗SAA抗體或抗CRP抗體，混勻，包被濃度為0.005-0.02mg/mL；離心洗滌后用磷酸鹽緩沖液重懸，即分別制得羊抗兔抗體的金貯(也稱羊抗兔納米膠體金金貯)、抗SAA抗體的金貯(也稱抗SAA納米膠體金金貯)、抗CRP抗體的金貯(也稱抗CRP納米膠體金金貯)。

優(yōu)選的，所述混勻后、離心洗滌前還包括如下步驟：加入10mg/mL的Carbowax溶液，使其終濃度為0.2-0.25mg/mL。

第三方面，本發(fā)明還涉及一種前述的同時定量檢測CRP、SAA的納米膠體金免疫層析試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟：

A1、測定校準品，每個濃度重復(fù)10次，每個檢測中加入校準品3μL，與1mL納米膠體金應(yīng)用溶液混合后滴加到試劑板樣品墊上的加樣孔中，在免疫層析定量分析儀上進行反射率的分析，獲得SAA標(biāo)準曲線和CRP標(biāo)準曲線；

A2、樣本測試，每個檢測中加入樣品3μL，與1mL納米膠體金應(yīng)用溶液混合后滴加到試劑板樣品墊上的加樣孔中，在免疫層析定量分析儀進行反射率的分析，將測試結(jié)果分別帶入所述SAA標(biāo)準曲線和CRP標(biāo)準曲線，計算獲得樣本中的SAA濃度和CRP濃度。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明提供的基于納米金的快速定量同時檢測CRP和SAA濃度的免疫層析試劑盒，能夠一次取樣，一次獲取兩個指標(biāo)的結(jié)果，簡單快速，且精密度在10％以內(nèi)，與公認方法的相關(guān)性良好。

2、本發(fā)明的方法將待測樣品中的抗原抗體反應(yīng)信息轉(zhuǎn)化成了另一種更為直觀的反射率信號，利用該方法，經(jīng)過一系列的研究工作，可以獲得反射率信號與待測抗原之間的對應(yīng)關(guān)系，進而制作標(biāo)準曲線，再通過對反射率信號與標(biāo)準曲線的比對最終獲得待測抗原的定量或者定性檢測結(jié)果。

3、常用的免疫層析法，通常將納米膠體金溶液噴灑或浸漬于固相載體上，后通過加熱或真空使其附著于固相載體上。此種方法由于納米金的釋放的差異，各部分材料的接觸的差異往往會引起較大的CV以及一些死金現(xiàn)象，而本方法經(jīng)過改良后使用了液相的金直接與樣本稀釋液混合，提高了反應(yīng)的效率，避免了釋放引起的問題，降低了產(chǎn)品的整體CV，同時通過優(yōu)化納米金稀釋液體系，解決了液相納米膠體金的穩(wěn)定性問題，最終成功的制備得到同時定量檢測CRP、SAA的納米膠體金免疫層析試劑盒。

附圖說明

圖1為本發(fā)明試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為SAA標(biāo)準曲線；

圖3為CRP標(biāo)準曲線；

圖4為SAA線性預(yù)測圖；

圖5為CRP線性預(yù)測圖；

其中，1為納米膠體金應(yīng)用溶液、2為塑料底板、3為樣品墊、4為吸水墊、5為硝酸纖維素膜、6為抗CRP包被線、7為抗SAA包被線、8為兔抗質(zhì)控包被線。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

本實施例一種快速定量檢測CRP+SAA的納米膠體金免疫層析試劑盒。該試劑盒的檢測基礎(chǔ)是固相雙抗體夾心的免疫反應(yīng)：如圖1所示，檢測試劑盒包含以下幾個組分：免疫層析檢測試劑板、納米膠體金應(yīng)用溶液1和.血液采樣裝置(可選用吸管或血液定量采集、轉(zhuǎn)移和稀釋的一體化裝置)。

所述的免疫層析檢測試劑板由硝酸纖維素膜5，樣品墊3，吸水墊4，塑料底板2及塑料卡殼組成；所述硝酸纖維素膜5上依次噴涂抗CRP單克隆抗體溶液、抗SAA單克隆抗體溶液、兔抗體溶液形成抗CRP包被線6、抗SAA包被線7和兔抗質(zhì)控包被線8。

所述的納米膠體金應(yīng)用液由配對SAA抗體的納米膠體金金貯，配對CRP抗體的納米膠體金金貯，羊抗兔抗體的納米膠體金金貯及穩(wěn)定緩沖液組成。該納米膠體金金貯是指納米膠體金與識別目標(biāo)蛋白特定位點的抗體靜電結(jié)合形成的復(fù)合物。該抗體是指單克隆或多克隆抗體。

本實施例的納米膠體金層析免疫試劑盒的制備方法包括如下步驟：

1、檢測試劑板的制備

1)空白大卡的制備

將硝酸纖維素膜裁成30±1cm的長度粘貼在塑料底板的中間。

2)質(zhì)控線的制備

將兔IgG用0.07M的檸檬酸沖液(pH5.2-5.5)稀釋成1.0mg/ml，同時添加終濃度10-20mg/mL的蔗糖和終濃度0.1-0.5mg/mLSDS。

3)檢測線的制備

a、SAA檢測線的制備

將抗SAA單克隆抗體用0.07M的檸檬酸沖液(pH5.2-5.5)稀釋成1.0mg/ml，同時添加終濃度10-20mg/mL的蔗糖和終濃度0.1-0.5mg/mL SDS。

b、CRP檢測線的制備

將抗CRP單克隆抗體用0.07M的檸檬酸沖液(pH5.2-5.5)稀釋成1.0mg/ml，同時添加終濃度10-20mg/mL的蔗糖和終濃度0.1-0.5/mLSDS。

4)噴膜

將貼好硝酸纖維素膜的空白大卡放置在Bio-Dot三維噴膜儀上，三條線的噴量設(shè)置均為0.8-1μl/cm(更優(yōu)選為0.8μl/cm)，依次噴上抗CRP包被線、抗SAA包被線和質(zhì)控包被線。

5)干燥

噴好的大卡放入37±2℃的烘箱中烘干15min，烘干后封入鋁箔袋，裝入干燥劑，密封繼續(xù)在37±2℃的烘箱放置42-72小時。

6)粘貼

在烘干好的大卡上靠近抗CRP包被線一端粘貼上樣品墊，在靠近質(zhì)控包被線一端粘帖上吸水墊。

7)切條組裝

將粘貼好的試劑大卡切條，安裝到塑料卡殼的下蓋中，蓋上上蓋，用壓蓋機壓合好。

2、納米膠體金應(yīng)用液的制備

1)納米膠體金溶液的制備

量取2500mL超純水放入5000mL三角燒瓶內(nèi)，與適量玻璃珠共同加入至沸，在沸騰狀態(tài)下加入45mL±5mL1％檸檬酸三鈉溶液(加入量隨小試確定)，待重新沸騰(約30秒)后再加入25mL±1mL 1％氯化金溶液，2分鐘后將加熱器調(diào)節(jié)至微沸，從加入氯化金溶液開始計時，共煮沸15分鐘，冷卻至室溫，液體呈澄清透明酒紅色。取3ml納米金溶液，于波長520nm處測取吸光度值，應(yīng)在0.95-1.15之間；在粒度分析儀中測試其粒徑值，應(yīng)在15-50nm之間。

2)羊抗兔IgG納米膠體金金貯的制備

按1-10μl/mL(更優(yōu)選5-8μl/mL)的濃度在納米膠體金中加入0.1M K₂CO₃調(diào)節(jié)PH，搖勻，加入羊抗兔多克隆抗體，包被濃度為0.005-0.02mg/mL(更優(yōu)選為0.005-0.01mg/mL)，混勻10分鐘，加入前一次一半量的0.1M K₂CO₃混勻5分鐘，加入10mg/mL的Carbowax溶液，使其終濃度為0.2-0.25mg/mL以保護納米膠體金。在8℃，23800×g下離心20分鐘，吸去上清，沉淀用等量的10mg/mLCarbowax，PH7.4-7.6的溶液重懸清洗，再次在8℃，23800×g下離心20分鐘，吸去上清。沉淀用含10-70mg/mL蔗糖，1-5mg/mL Cabowax，10-50mg/mL BSA和0.5-1mg/mL疊氮鈉的0.025-0.1M的磷酸緩沖液，PH 7.4，重懸至原體積的1/10。

3)抗SAA納米膠體金金貯的制備

按1-10μl/mL(更優(yōu)選5-8μl/mL)的濃度在納米膠體金中加入0.1M K₂CO₃調(diào)節(jié)PH，搖勻，加入抗SAA單克隆抗體，包被濃度為0.005-0.02mg/mL(更優(yōu)選為0.005-0.01mg/mL)，混勻10分鐘，加入前一次一半量的0.1M K₂CO₃混勻5分鐘，加入10mg/mL的Carbowax溶液，使其終濃度為0.2-0.25mg/mL以保護納米膠體金。在8℃，23800×g下離心20分鐘，吸去上清，沉淀用等量的10mg/mLCarbowax，PH7.4-7.6的清洗液重懸清洗，再次在8℃，23800×g下離心20分鐘，吸去上清。沉淀用含10-70mg/mL蔗糖，1-5mg/mLCabowax，10-50mg/mLBSA和0.5-1mg/mL疊氮鈉的0.025-0.1M的磷酸緩沖液，PH 7.4，重懸至原體積的1/10.

4)抗CRP納米膠體金金貯的制備

按1-10μl/mL(更優(yōu)選5-8μl/mL)的濃度在納米膠體金中加入0.1M K₂CO₃調(diào)節(jié)PH，搖勻，加入抗CRP單克隆抗體，包被濃度為0.005-0.01mg/mL，混勻10分鐘，加入前一次一半量的0.1M K₂CO₃混勻5分鐘，加入10mg/mL的Carbowax溶液，使其終濃度為0.2-0.25mg/mL以保護納米膠體金。在8℃，23800×g下離心20分鐘，吸去上清，沉淀用等量的10mg/mLCarbowax，PH7.4-7.6的清洗液重懸清洗，再次在8℃，23800×g下離心20分鐘，吸去上清。沉淀用含10-70mg/mL蔗糖，1-5mg/mLCabowax，10-50mg/mLBSA和0.5-1mg/mL疊氮鈉0.025-0.1M的磷酸緩沖液，PH 7.4，重懸至原體積的1/10.

5)納米膠體金應(yīng)用液的制備

在0.001-0.1M硼酸-硼砂緩沖液，其中含5-10mg/mLBSA或Casein、5-10mg/mLNaCl、1-10mg/mLTrition-100、1.5-2mg/mL疊氮鈉，加入終濃度0.5-2μg/mL羊抗兔抗體的金貯、終濃度0.5-2μg/mL抗SAA抗體的金貯、終濃度0.5-2μg/mL抗CRP抗體的金貯、終濃度1-3μg/mL的CRP游離抗體。

3、CRP+SAA檢測

1)標(biāo)準曲線制備

采用上述方法制備的試劑組合成CRP+SAA納米膠體金定量檢測試劑盒，測定校準品，每個濃度重復(fù)10次。

每個檢測中加入校準品3μL，與1mL納米膠體金應(yīng)用液混合，然后滴加到試劑板加樣孔中，5分鐘后在配套的讀數(shù)儀上進行讀數(shù)，標(biāo)準曲線數(shù)據(jù)如表1、表2所示，標(biāo)準曲線如圖2、圖3所示。

由圖2、圖3的標(biāo)準曲線可以看到，該標(biāo)準曲線線性良好，可以通過該標(biāo)準曲線對樣本中所含的SAA和CRP濃度進行定量分析。

通過表1結(jié)果可知，檢測試劑盒的批內(nèi)精密度良好，校準品各濃度點號精密度均小于10％，且試劑靈敏度良好，SAA 2.5mg/L水平與0值校準品,CRP 0.5mg/L與0值校準品有顯著區(qū)分。

表1 SAA定量檢測標(biāo)準曲線數(shù)據(jù)

表2 CRP定量檢測標(biāo)準曲線數(shù)據(jù)

2)樣本測試

每個檢測中加入樣品3μL，與1mL納米膠體金應(yīng)用液混合，然后滴加到試劑板加樣孔中，5分鐘后在配套的讀數(shù)儀上進行讀數(shù)，將測試結(jié)果帶入圖2、圖3的標(biāo)準曲線，計算樣品測試濃度，比對數(shù)據(jù)如表3、表4所示，與西門子測試結(jié)果進行相關(guān)性分析，相關(guān)性曲線如圖4、圖5所示。

西門子系統(tǒng)和配套的CRP和SAA試劑盒是知名的檢測試劑盒，其精度和結(jié)果公認可靠。由圖4、圖5顯示可知本發(fā)明的試劑盒測定結(jié)果與西門子儀器及配套試劑盒測定結(jié)果相關(guān)系數(shù)R²為0.98216和0.98495，相關(guān)性較好，可用于臨床診斷使用。

表3 SAA臨床樣本比對結(jié)果。

表4 CRP臨床樣本比對結(jié)果