本發(fā)明涉及一種采用高效液相色譜法檢測乳中他唑巴坦的方法，屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

他唑巴坦是強(qiáng)力不可逆的競爭性β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，可以與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合后使其失活，具有抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌的作用。

抗生素的大量應(yīng)用，導(dǎo)致其在乳中的殘留問題受到廣泛關(guān)注。為了躲避抗生素的檢出，有些人在乳中添加β-內(nèi)酰胺酶，用以降解抗生素，從而無法判斷乳中是否含有抗生素。所以，針對這一現(xiàn)象，建立了關(guān)于乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法。但是，有些人又利用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑能不可逆地與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合的性質(zhì)，在乳中添加β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，使β-內(nèi)酰胺酶失去活性，導(dǎo)致陽性奶不能被檢測出來。

關(guān)于乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測方法在國內(nèi)外還沒有現(xiàn)行的檢測標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，國外由于其文化發(fā)展程度的差異，主要將目標(biāo)放在臨床醫(yī)療中的使用情況，并沒有看到他唑巴坦在乳中的報道；而國內(nèi)對于他唑巴坦的檢測方法的報道很少，文獻(xiàn)報道的方法又主要集中在微生物法、酶法、毛細(xì)管電泳法等。

由于目前尚無良好有效的檢測手段，建立乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦的檢測方法非常重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種采用高效液相色譜法檢測乳中他唑巴坦的方法，采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的在于提供一種采用高效液相色譜法檢測乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦的方法，該方法步驟如下：

1)將樣品進(jìn)行前處理；

2)按照如下色譜條件利用高效液相色譜進(jìn)行測定；所述色譜條件為：色譜柱為C18色譜柱；檢測波長為210nm-220nm；流動相為四丁基氫氧化銨-磷酸二氫鉀溶液-乙腈；流速為0.7mL/min-1.2mL/min；進(jìn)樣量為10μL；洗脫時間為10min。

優(yōu)選地，所述前處理，是稱取1份牛奶與乙腈混合，震蕩混勻后離心，取上清液與正己烷混合，震蕩混勻后離心，棄去正己烷層，氮氣吹干后，用流動相復(fù)溶，最后過微孔濾膜。

優(yōu)選地，所述四丁基氫氧化銨濃度為2.5mmol/L-10mmol/L。

更優(yōu)選地，所述四丁基氫氧化銨濃度為5mmol/L。

優(yōu)選地，所述磷酸二氫鉀溶液濃度為0.0125mol/L-0.06mol/L；pH為4-6。

更優(yōu)選地，所述磷酸二氫鉀溶液濃度為0.03mol/L；pH為5。

優(yōu)選地，所述四丁基氫氧化銨濃度-磷酸二氫鉀溶液-乙腈，體積比為10:80:10-10:70:20。

更優(yōu)選地，所述四丁基氫氧化銨濃度-磷酸二氫鉀溶液-乙腈，體積比為10:80:10。

優(yōu)選地，所述C18色譜柱，規(guī)格為4.6mm×250mm，5μm。

優(yōu)選地，具體步驟如下：

1)將樣品進(jìn)行前處理：稱取1份牛奶與3份-5份乙腈混合于離心管中，震蕩混勻后離心，取上清液與4份-6份正己烷混合于另一離心管中，震蕩混勻后離心，棄去正己烷層，在35℃-45℃氮氣吹干后，用流動相復(fù)溶，最后過微孔濾膜；

2)按照如下色譜條件利用高效液相色譜進(jìn)行測定；所述色譜條件為：色譜柱為4.6mm×250mm，5μm的C18色譜柱；檢測波長為210-220nm；流動相為體積比為10:80:10-10:70:20的四丁基氫氧化銨濃度-磷酸二氫鉀溶液-乙腈；流速為0.7mL/min-1.2mL/min；進(jìn)樣量為10μL；洗脫時間為10min；所述四丁基氫氧化銨濃度為2.5mmol/L-10mmol/L；所述磷酸二氫鉀溶液濃度為0.0125mol/L-0.06mol/L，pH為4-6。

更優(yōu)選地，具體步驟如下：

1)將樣品進(jìn)行前處理：稱取1份牛奶與4份乙腈混合于離心管中，震蕩混勻后離心，取上清液與5份正己烷混合于另一離心管中，震蕩混勻后離心，棄去正己烷層，在40℃氮氣吹干后，用流動相復(fù)溶，最后過微孔濾膜；

2)按照如下色譜條件利用高效液相色譜進(jìn)行測定；所述色譜條件為：色譜柱為4.6mm×250mm，5μm的C18色譜柱；檢測波長為213nm；流動相為體積比為10:80:10的四丁基氫氧化銨濃度-磷酸二氫鉀溶液-乙腈；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量為10μL；洗脫時間為10min；所述四丁基氫氧化銨濃度為5mmol/L；所述磷酸二氫鉀溶液濃度為0.03mol/L，pH為5。

以上所述任一方法在檢測克拉維酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明對采用HPLC法檢測乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，取得最佳色譜條件，然后針對此條件進(jìn)行他唑巴坦方法學(xué)驗證。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明采用高效液相色譜法建立了乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦的檢測方法，樣品采用乙腈除蛋白，正己烷脫脂的方法，最佳色譜條件為：色譜柱為Hypersil ODS-2C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相為5mmol/L四丁基氫氧化銨-0.03mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 5)-乙腈(10:80:10)，檢測波長為213nm，流速為1mL/min。該方法的線性范圍為12.5～200μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9993，平均回收率在86％～92％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.573％。本發(fā)明方法操作簡便，結(jié)果可靠，對于保證產(chǎn)品的質(zhì)量，保護(hù)消費者健康具有十分重要的作用，具有一定的現(xiàn)實和指導(dǎo)意義。適用于乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦的檢測。

附圖說明

圖1最佳色譜條件下他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。

圖2最佳色譜條件下原料乳中添加他唑巴坦的色譜圖。

圖3他唑巴坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4室溫條件下他唑巴坦的穩(wěn)定性。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

實施例1：

一、標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

精確稱取他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品，將其配成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用時用流動相稀釋成所需的濃度，所有溶液使用前需過0.45μm的微孔濾膜。

二、液相色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS-2C18(4.6mm×250mm，5μm)；檢測波長：210-220nm(優(yōu)選為213nm)；流動相：5mmol/L四丁基氫氧化銨-0.03mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 5)-乙腈(10:80:10)；流速：0.7mL/min-1.2mL/min(優(yōu)選為1mL/min)；進(jìn)樣量：10μl；洗脫時間：10min。

三、樣品前處理方法

稱取1份牛奶與3份-5份乙腈混合于離心管中，震蕩混勻后離心，取上清液與4份-6份正己烷混合于另一離心管中，震蕩混勻后離心，棄去正己烷層，在35℃-45℃氮氣吹干后，用流動相復(fù)溶，最后過微孔濾膜。

經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)牛奶與乙腈的最佳體積比為1:4，牛奶與正己烷的最佳體積比為1:5時，氮氣吹干最佳溫度為40℃，即稱取1份(如1mL)牛奶與4份(如4mL)乙腈混合于離心管中，震蕩混勻(如1min)后離心(如4000r/min，15min)，取上清液與5份(如5mL)正己烷混合于另一離心管中，震蕩混勻(如1min)后離心(如4000r/min，8min)，棄去正己烷層，重復(fù)除脂2次，在40℃氮氣吹干后，用流動相復(fù)溶，最后過微孔濾膜(如0.45μm)。

四、色譜條件的優(yōu)化

1、流動相選擇及配比的優(yōu)化

本試驗首先考察了同等條件下甲醇-水(10：90)和乙腈-水(10：90)兩種流動相對物質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流動相為甲醇-水時，色譜峰拖尾；當(dāng)流動相為乙腈-水時，峰型好，分離度高，待測物質(zhì)可得到好的洗脫效果。因此，本試驗確定乙腈-水為流動相。

確定乙腈-水為流動相后，考察乙腈與水以不同的比例存在時，對待測物質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明，乙腈比例從10％到50％的變化過程中，隨著乙腈濃度的降低，保留時間逐漸延長(表-1)。但當(dāng)乙腈濃度低于10％時，分離條件沒有達(dá)到最佳狀態(tài)，雜質(zhì)和他唑巴坦沒有完全分開。因此乙腈-水最佳體積比＝10:90。

表1流動相配比與保留時間的關(guān)系

2、緩沖溶液的選擇及濃度的優(yōu)化

在色譜分析中，向水相中添加緩沖溶液，達(dá)到防止樣品解離，峰型拖尾，增加方法的可靠性等作用。本試驗考察四丁基氫氧化銨和磷酸氫二鉀兩種緩沖溶液對分離效果的影響。結(jié)果表明，以四丁基氫氧化銨和磷酸氫二鉀時，他唑巴坦得到較好的洗脫，且分離度好。因此，本試驗選擇以四丁基氫氧化銨和磷酸氫二鉀作為緩沖溶液。

在水相中添加四丁基氫氧化銨，配制成不同濃度的四丁基氫氧化銨，按照前面確定的乙腈與水的最佳體積比進(jìn)行混合，考察緩沖溶液的濃度對待測物質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明,在一定范圍內(nèi),流動相的離子強(qiáng)度越高,則保留時間越長(表-2),但考慮液相色譜對有機(jī)鹽濃度的限制,在保證有效分離的前提下,應(yīng)選擇離子強(qiáng)度相對較低的緩沖液體作為流動相。因此，本試驗確定四丁基氫氧化銨的最佳濃度為5mmol/L。

表2四丁基氫氧化銨濃度與保留時間的關(guān)系

在水相中添加磷酸二氫鉀，配制成不同濃度的磷酸二氫鉀溶液，按照前面確定的乙腈與水的最佳體積比進(jìn)行混合，考察緩沖溶液的濃度對待測物質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明,在一定范圍內(nèi),流動相的離子強(qiáng)度越高,則保留時間越長(表-3),但考慮液相色譜對有機(jī)鹽濃度的限制,在保證有效分離的前提下,應(yīng)選擇離子強(qiáng)度相對較低的緩沖液體作為流動相。因此，本試驗確定磷酸二氫鉀的最佳濃度為0.03mol/L。

表3磷酸二氫鉀濃度與保留時間的關(guān)系

3、緩沖溶液pH值的優(yōu)化

緩沖溶液pH值的選擇對于試驗的結(jié)果非常重要，若pH值的選擇不恰當(dāng)會導(dǎo)致分裂峰、不對稱峰、肩峰或?qū)挿宓?。本試驗考察了不同的pH值對保留時間及分離效果的影響。結(jié)果顯示，pH值的改變對保留時間影響不大(表-4)，但可以影響色譜峰的峰型以及實驗的重現(xiàn)性。當(dāng)pH值為5時，色譜峰峰型好，分離效果也好，因此，本試驗最佳pH為5。

表4pH值與保留時間的關(guān)系

五、方法學(xué)的驗證

1、系統(tǒng)適用性

由圖1、圖2可以看出，溶劑不干擾主峰和有關(guān)物質(zhì)峰的測定,他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品溶液在最佳色譜條件下的保留時間為5.285min，原料乳中他唑巴坦的保留時間為5.312min，樣品中他唑巴坦峰和標(biāo)準(zhǔn)品主峰的保留時間基本一致。綜上表明，此最佳色譜條件適用于乳品中他唑巴坦的檢測應(yīng)用。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

精密稱取他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品25mg置于25mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻；然后分別精密量取上述溶液，用流動性逐步稀釋濃度為12.5、25、50、100、200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述最佳色譜條件進(jìn)樣測定。每個濃度平行測定5次，按所得峰面積平均值(y)對他唑巴坦的濃度(μg/mL)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出他唑巴坦的回歸方程與相關(guān)系數(shù)(圖3)。測得最小檢出限為0.07μg/mL。

3、回收率與精密度

本試驗采用空白加標(biāo)的方法進(jìn)行回收率和精密度測定。將5、50、100μg/mL 3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品添加到空白樣品中，按照1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行處理，每個濃度樣品測定5次，記錄峰面積，分別帶入回歸方程，并依據(jù)公式：回收率＝樣品測定值/標(biāo)準(zhǔn)加入量×100％進(jìn)行測定，結(jié)果如表5。由表中結(jié)果可以看出，該方法的平均回收率在86％～92％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.573％。

表5乳中克拉維酸的加標(biāo)回收率及精密度

4、穩(wěn)定性試驗

準(zhǔn)確稱取濃度為10μg/mL他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在室溫下放置0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8h后，按照上述測定方法進(jìn)行上機(jī)試驗。結(jié)果表明,在室溫條件下,標(biāo)準(zhǔn)品溶液放置8h內(nèi)是比較穩(wěn)定的，但含量還是有所下降，故供試品溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配(見圖4)。

5、實際樣品的測定

按照本試驗所建立的高效液相色譜的方法對市場銷售的15種液態(tài)奶進(jìn)行測定，暫未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。