本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種HPLC法分離測(cè)定曲安奈德和硝酸益康唑組合物中有關(guān)物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

曲安奈德為糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、止癢及抗過(guò)敏作用。硝酸益康唑?yàn)榭拐婢?，?duì)皮膚癬菌、霉菌和酵母菌(如念珠菌)等有抗菌活性，對(duì)某些革蘭陽(yáng)性菌也有效。曲安奈德和硝酸益康唑組合物臨床可用于皮炎、濕疹、炎癥性真菌性疾病等的治療。

曲安奈德(Triamcinolone Acetonide)為中強(qiáng)效的氟化糖皮質(zhì)激素，有甾體類(lèi)化合物的母環(huán)，結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示。對(duì)酸、堿、溫度和光照均較敏感，在特殊條件易降解，性質(zhì)不穩(wěn)定。

硝酸益康唑(Econazole Nitrate)為第一代咪唑類(lèi)的硝酸鹽，有咪唑環(huán)和醚類(lèi)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)式如式Ⅱ所示。其中咪唑環(huán)易被氧化，對(duì)氧較敏感，在特殊條件下也能降解。

曲安奈德和硝酸益康唑化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)差異大，在各種條件下的穩(wěn)定性也不一致，兩者制成復(fù)方制劑后，硝酸益康唑的酸性對(duì)曲安奈德的穩(wěn)定性有 影響，樣品存儲(chǔ)中空氣中的氧氣對(duì)硝酸益康唑的穩(wěn)定性有影響；再者，硝酸益康唑?yàn)槿鯄A性化合物，結(jié)構(gòu)中共軛體系小，成鹽后在紫外區(qū)的響應(yīng)較弱，加上兩個(gè)化合物紫外區(qū)吸收差異較大，根據(jù)《化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則》項(xiàng)下要求，對(duì)雜質(zhì)降解途徑進(jìn)行詳細(xì)了解，為產(chǎn)品的存儲(chǔ)、運(yùn)輸提供更好的、更合理的條件，研究制劑處方、工藝對(duì)兩主藥成分的相互影響，分別建立簡(jiǎn)單可行、靈敏度高、專(zhuān)屬性好的有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制方法勢(shì)在必行，因此建立有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制項(xiàng)，對(duì)產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制，能提高產(chǎn)品的質(zhì)量可控性和安全性。

各國(guó)藥典均未收錄有曲安奈德和硝酸益康唑單方制劑以及復(fù)方制劑中曲安奈德和硝酸益康唑及其有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，Ch.P、EP、BP均只收錄曲安奈德和硝酸益康唑原料藥的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法。Ch.P2015年版中收載有曲安奈德益康唑乳膏，其項(xiàng)下無(wú)有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)，僅有含量的HPLC法。申請(qǐng)?zhí)枮?00510096394.6的發(fā)明專(zhuān)利中公開(kāi)了曲安奈德益康唑凝膠及其制法和質(zhì)量控制方法，該質(zhì)量控制方法中的含量方法與中國(guó)藥典2015年版曲安奈德益康唑乳膏的含量法一致，且也無(wú)有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)。均不能作為曲安奈德和硝酸益康唑組合物有關(guān)物質(zhì)的控制，說(shuō)明目前現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的方法中無(wú)有效的曲安奈德和硝酸益康唑組合物有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種用于分離測(cè)定曲安奈德和硝酸益康唑組合物中有關(guān)物質(zhì)的HPLC方法，該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，以保證曲安奈德和硝酸益康唑組合物的質(zhì)量控制。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種HPLC法分離測(cè)定曲安奈德和硝酸益康唑組合物中有關(guān)物質(zhì)的方法，采用反相液相色譜法；采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以磷酸氫二銨溶液和有機(jī)溶劑的混合液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫分離。

進(jìn)一步，所述的方法，所述磷酸氫二銨溶液的濃度為0.005mol/L-0.02mol/L。

優(yōu)選的，所述磷酸氫二銨溶液的濃度為0.01mol/L。

進(jìn)一步，所述的方法，所述磷酸氫二銨溶液的pH值為5.5-6.5。優(yōu)選的，所述磷酸氫二銨溶液的pH值為6.0。

進(jìn)一步，所述的方法，所述磷酸氫二銨溶液選用磷酸、甲酸、乙酸、檸檬酸和三氟乙酸中的一種或多種進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。優(yōu)選磷酸進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。

進(jìn)一步，所述的方法，所述有機(jī)溶劑為乙腈和/或甲醇。

優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑為乙腈。

進(jìn)一步，所述的方法，所述十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱填料的顆粒粒徑為3-5μm。優(yōu)選顆粒粒徑為5μm。

進(jìn)一步，所述的方法，選用色譜柱柱長(zhǎng)為150-250mm。優(yōu)選色譜柱柱長(zhǎng)為150mm。

進(jìn)一步，所述的方法，所述流動(dòng)相的流速為0.5-1.5ml/min。

優(yōu)選的，所述流動(dòng)相的流速為1.0ml/min。

進(jìn)一步，所述的方法，所述流動(dòng)相采用線(xiàn)性梯度洗脫分離，線(xiàn)性梯度洗脫條件為：

0min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為75-85：15-25；

50min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為25-35：65-75；

60min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為25-35：65-75；

62min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為75-85：15-25；

65min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為75-85：15-25。

優(yōu)選的，所述流動(dòng)相采用線(xiàn)性梯度洗脫分離，線(xiàn)性梯度洗脫條件為：

0min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為80：20；

50min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為30：70；

60min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為30：70；

62min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為80：20；

65min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為80：20。

進(jìn)一步，所述的方法，所述色譜柱柱溫為25-45℃。優(yōu)選的，色譜柱柱溫為35℃。

進(jìn)一步，所述的方法，洗脫分離后，再采用檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，所述檢測(cè)器選用紫外檢測(cè)器、DAD檢測(cè)器和VWD檢測(cè)器中的任一種。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm±5nm。

本發(fā)明還提供了一種HPLC法分離測(cè)定曲安奈德益康唑乳膏中曲安奈德和硝酸益康唑及有關(guān)物質(zhì)的方法，包括如下進(jìn)行的步驟：

取曲安奈德益康唑乳膏適量，加入乙腈，于60±5℃水浴中加熱，振搖使溶解，然后置冰浴中放置30分鐘以上，于每分鐘4000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液為供試品溶液，取供試品溶液注入高效液相色譜儀，采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以磷酸氫二銨溶液和有機(jī)溶劑的混合液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫分離，并在分離后采用檢測(cè)器對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

進(jìn)一步，所述的一種HPLC法分離測(cè)定曲安奈德益康唑乳膏中曲安奈德和硝酸益康唑及有關(guān)物質(zhì)的方法，所述的方法還包括以下步驟：

取曲安奈德、硝酸益康唑及有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品制備對(duì)照溶液，分別取對(duì)照溶液及供試品溶液進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，按主成分自身對(duì)照法計(jì)算供試品中各已知雜質(zhì)的含量，按主成分自身對(duì)照法計(jì)算供試品中其他單個(gè)雜質(zhì)的含量，總雜質(zhì)為各已知雜質(zhì)與其他單個(gè)雜質(zhì)之和。

如在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中公開(kāi)了利用HPLC法分離測(cè)定曲安奈德益康唑乳膏中曲安奈德和硝酸益康唑及有關(guān)物質(zhì)的方法，具體步驟如下：

色譜條件：色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，柱長(zhǎng)為150mm，檢測(cè)器為DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm，以0.01mol/L磷酸氫二銨(用磷酸調(diào)解pH為6.0)和乙腈的混合液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫比例為：0min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為80：20；50min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為30：70；60min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為30：70；62min：磷酸氫二銨溶液與有機(jī)溶劑的體積比為80：20；65min：磷酸氫二銨溶 液與有機(jī)溶劑的體積比為80：20。流動(dòng)相流速為1.0ml/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣體積為10μl。

(1)分別取羥苯甲酯和2，6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚(BHT)各約10mg、曲安奈德20mg和硝酸益康唑50mg，置50ml量瓶中，加50％乙腈溶液超聲使溶解，加入1ml用50％乙腈制成含雜質(zhì)A、B、C各約0.2mg/ml的混合對(duì)照品溶液，并加30％乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液；

(2)取曲安奈德和硝酸益康唑組合物適量，用30％乙腈溶解，分別配制成每1ml含曲安奈德0.4mg和硝酸益康唑4mg的供試品溶液。

(3)精密量取供試品溶液0.5ml，置100ml量瓶中，用30％乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

分別取系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液和對(duì)照溶液，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按帶校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算供試品中各已知雜質(zhì)的含量，按主成分自身對(duì)照法計(jì)算供試品中其他單個(gè)雜質(zhì)的含量，總雜質(zhì)為各已知雜質(zhì)與其他單個(gè)雜質(zhì)之和。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供的一種HPLC法分離測(cè)定曲安奈德和硝酸益康唑組合物中有關(guān)物質(zhì)的方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空缺，用高效液相色譜法分離測(cè)定曲安奈德和硝酸益康唑組合物中曲安奈德和硝酸益康唑及有關(guān)物質(zhì)，并能有效分離出輔料峰，使其不干擾有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。該方法分離度好，專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高；且操作簡(jiǎn)單，具有簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，保證產(chǎn)品的安全有效，對(duì)于曲安奈德和硝酸益康唑組合物的質(zhì)量控制有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中系統(tǒng)適用性溶液的HPLC圖。

圖2為實(shí)施例1中測(cè)定曲安奈德益康唑乳膏中的有關(guān)物質(zhì)HPLC圖。

圖3為實(shí)施例1中測(cè)定空白輔料溶液的有關(guān)物質(zhì)HPLC圖。

圖4為實(shí)施例1中測(cè)定溶劑的有關(guān)物質(zhì)HPLC圖。

具體實(shí)施方式

所舉實(shí)施例是為了更好地對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實(shí)施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1曲安奈德益康唑乳膏中曲安奈德和硝酸益康唑及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

1、儀器與條件

儀器：高效液相色譜儀SHIMADZU 20A(SHIMADZU)；

色譜工作站：LcSolution；

檢測(cè)器：DAD；

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑(SHIMADZU，VP-ODS，150mm×4.6mm，5μm)；

流動(dòng)相：流動(dòng)相A：0.01mol/L磷酸氫二銨(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為6.0)；流動(dòng)相B：乙腈；以流動(dòng)相A、B進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫；

檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm；

柱溫：35℃；

流速：1.0ml/min；

進(jìn)樣體積：10μl。

流動(dòng)相A、B線(xiàn)性梯度洗脫條件為：

2、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)分別取羥苯甲酯和2，6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚(BHT)各約10mg、曲安奈德20mg和硝酸益康唑50mg，置50ml量瓶中，加50％乙腈溶液超聲使溶解，加入1ml用50％乙腈制成含雜質(zhì)A、B、C各約0.2mg/ml的混合對(duì)照品溶液，并加溶劑(30％乙腈)稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

(2)取曲安奈德益康唑乳膏10g，置具塞錐形瓶中，加乙腈25ml，60℃水浴中加熱，振搖使溶解，置冰浴中放置30分鐘以上，于每分鐘4000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液作為供試品溶液。

(3)另取本品曲安奈德益康唑乳膏的空白輔料10g，照供試品溶液相同的方法處理得空白輔料溶液。

(4)精密量取供試品溶液0.5ml，置100ml量瓶中，用溶劑(30％乙腈)稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

(5)分別取系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液、空白輔料溶液和溶劑(30％乙腈)，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1-4。

3、檢測(cè)結(jié)果

供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰(保留時(shí)間為4-25min)，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C的校正峰面積(峰面積分別乘以1.25、0.85、1.15)均不得大于對(duì)照溶液曲安奈德峰面積的2倍(1.0％)，其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液曲安奈德峰面積(0.5％)，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液曲安奈德峰面積的5倍(2.5％)。羥苯甲酯和峰面積小于對(duì)照溶液曲安奈德峰面積0.2倍的雜質(zhì)峰均不積分(0.1％)。

上述供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰(保留時(shí)間為25～50min)，單個(gè)雜質(zhì)的峰面積不得大于硝酸益康唑主峰面積(0.5％)，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于硝酸益康唑主峰面積的2.0倍(1.0％)。BHT和峰面積小于對(duì)照溶液硝酸益康唑峰面積0.2倍的雜質(zhì)峰均不積分(0.1％)。

按帶校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算供試品中各已知雜質(zhì)的含量，按主 成分自身對(duì)照法計(jì)算供試品中其他單個(gè)雜質(zhì)的含量，總雜質(zhì)為各已知雜質(zhì)與其他單個(gè)雜質(zhì)之和。

計(jì)算公式如下：

FAt/As

式中：At為供試品溶液中各雜質(zhì)峰的峰面積；

As為對(duì)照溶液中曲安奈德或硝酸益康唑的主峰面積；

F為已知雜質(zhì)的校正因子。

實(shí)施例2數(shù)批曲安奈德益康唑乳膏有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

按照實(shí)施例1的方法對(duì)我司數(shù)批曲安奈德益康唑乳膏樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

表1數(shù)批樣品檢測(cè)結(jié)果

最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。