本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c及其T細(xì)胞表位肽在結(jié)核病檢測試劑、疫苗和藥物制備中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，調(diào)查結(jié)果顯示全世界有三分之一的人口處于潛伏感染，且有5％～10％在未來的生活中將可能發(fā)展為活動性結(jié)核病。自1993年世界衛(wèi)生組織宣布結(jié)核病成為全球危機(jī)后，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，據(jù)WHO報告，每年新增結(jié)核病人約800萬，每年約有200～300萬人死于結(jié)核病。我國在22個結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家中位居第2位，全國第5次流行病學(xué)抽樣檢查結(jié)果顯示：全國130萬人發(fā)病，占全球發(fā)病率的14.3％，我國也是全球27個耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，耐多藥結(jié)核病患病人數(shù)占據(jù)全球第一。每個未經(jīng)治療的活動性肺結(jié)核病人能夠傳染10～15人。結(jié)核病已經(jīng)成為全球重要的衛(wèi)生問題，需引起人們的高度重視。結(jié)核的早期診斷和預(yù)防治療對結(jié)核病的控制至關(guān)重要，研究者應(yīng)致力于開發(fā)高效、敏感、特異的結(jié)核診斷檢測方法。臨床上肺結(jié)核癥狀表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、高熱等，容易與慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、肺炎、感冒等混淆，需要借助影像學(xué)、細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)等診斷方法方可確診。臨床上常用的是細(xì)菌學(xué)方法痰涂片鏡檢和痰培養(yǎng)，痰涂片鏡檢是世界范圍內(nèi)結(jié)核病檢查中使用最廣泛的技術(shù)，由于此法設(shè)備簡便，適合在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的地區(qū)使用。但是由于對樣本中的菌含量要求高，因此該方法靈敏度不高，導(dǎo)致大量涂陰患者不被發(fā)現(xiàn)從而轉(zhuǎn)陽，且涂陰患者具有傳染性，不容忽視，該方法無種特異性，靈敏度差，受痰液標(biāo)本和病情的影響。痰培養(yǎng)作為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在培養(yǎng)時間過長，現(xiàn)在已有BACTECMGIT960系統(tǒng)等快速培養(yǎng)系統(tǒng)可在2周內(nèi)分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，但由于其配制的培養(yǎng)基、營養(yǎng)添加劑、雜菌抑制劑價格昂貴，無法在發(fā)展中國家廣泛推廣，并且快速培養(yǎng)與改良L-J培養(yǎng)相比污染率顯著增高，導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。常用的用于人群篩查的檢測方法是皮膚結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)，使用的是結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有許多分枝桿菌種類(致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD診斷結(jié)核病的特異性較差，不能有效區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與卡介苗接種，結(jié)核的影像學(xué)檢查如常規(guī)的X線檢查、CT檢查、MRI檢查、超聲檢查等價格昂貴，且對身體造成一定傷害，特異性低，不適合用于常規(guī)的檢查診斷。結(jié)核分枝桿菌侵入人體后寄居在巨噬細(xì)胞內(nèi)，人體對結(jié)核分枝桿菌主要的免疫反應(yīng)是細(xì)胞免疫應(yīng)答，主要參與的細(xì)胞是CD4+和CD8+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可以通過穿孔素、顆粒酶等途徑將被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞殺死從而達(dá)到清除結(jié)核分枝桿菌的目的。其中MHC-I類分子存在于所有有核細(xì)胞的表面，而MHC-Ⅱ類分子僅存在于專職抗原遞呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，因此CD8+T細(xì)胞表位在結(jié)核的診斷和疫苗構(gòu)建中具有更廣泛的用途。目前以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測方法T-SPOT是利用IFN-γ特異性抗體捕獲經(jīng)結(jié)核抗原刺激的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后產(chǎn)生的IFN-γ，并以酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)顯色的方式表現(xiàn)出來，從斑點(diǎn)的數(shù)量來確定細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，從單細(xì)胞水平評價細(xì)胞免疫功能。以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外γ干擾素的檢測被用于結(jié)核病的輔助診斷，該檢測方法不僅能篩選出活動性結(jié)核病人，同時也能檢測出潛伏期病人，從而能更好的預(yù)防和控制潛伏期結(jié)核，目前已有以結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)編碼的結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽為刺激物的商品化的IGRA檢測試劑盒，如QuantiFERON-TBGoldtest和T-SPOT，均呈現(xiàn)較高的靈敏性和特異性。而Rv0446c(GI：15607587)是結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組編碼的保守膜蛋白，含256個氨基酸，可在H37Rv的培養(yǎng)上清中檢測出的分泌蛋白，主要參與細(xì)胞壁的加工過程，是可能的結(jié)核毒力相關(guān)蛋白。Rv0446c是結(jié)核分枝桿菌保守膜蛋白，在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清中能檢測到的分泌蛋白，主要參與細(xì)胞膜和細(xì)胞的加工過程，利用生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行抗原表位預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)Rv0446c蛋白存在較多的T細(xì)胞表位，具有潛在的診斷效能。本發(fā)明建立在反向疫苗學(xué)的基礎(chǔ)上，利用計(jì)算機(jī)篩選出結(jié)核分枝桿菌可能的免疫原性抗原庫，然后利用生物信息學(xué)軟件TEpredict和IEDB預(yù)測結(jié)核抗原MHC-I類T細(xì)胞表位，通過固態(tài)合成法合成這些多肽，先利用人群免疫篩選試驗(yàn)對結(jié)核新抗原進(jìn)行篩選，篩選出免疫優(yōu)勢抗原然后，再通過動物實(shí)驗(yàn)對其免疫原性進(jìn)行驗(yàn)證，最后經(jīng)驗(yàn)證得到的免疫優(yōu)勢抗原及其表位可一方面用于結(jié)核診斷，另一方面可用于卡介苗的改造。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446cT細(xì)胞表位肽及其應(yīng)用。本發(fā)明基于以下構(gòu)思：Rv0446c是結(jié)核分枝桿菌上的保守膜蛋白，基于T細(xì)胞IFN-γ釋放技術(shù)，利用生物信息學(xué)軟件TEpredict和IEDB對Rv0446c編碼基因上T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測，利用固態(tài)合成法合成T細(xì)胞表位肽，再通過T-SPOT(T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn))對結(jié)核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內(nèi)的特異性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測，從而評價該抗原用于結(jié)核檢測的靈敏度和特異性，同時通過人群免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選出Rv0446c抗原蛋白上的免疫優(yōu)勢表位肽，再通過動物實(shí)驗(yàn)，確定免疫優(yōu)勢T細(xì)胞表位肽的免疫原性。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c在制備結(jié)核檢測試劑、疫苗和藥物中的應(yīng)用；其中，所述抗原蛋白Rv0446c的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446cT細(xì)胞表位肽，所述表位肽選自P120、P121、P122和P123，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1-4所示。本發(fā)明還提供由所述T細(xì)胞表位肽衍生的表位肽或其類似物。本發(fā)明還提供編碼所述表位肽的DNA分子。本發(fā)明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的表達(dá)盒及表達(dá)載體。本發(fā)明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白。本發(fā)明還提供所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白在制備結(jié)核檢測試劑、疫苗和藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種結(jié)核檢測試劑，所述檢測試劑中含有結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c，或編碼所述抗原蛋白Rv0446c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。本發(fā)明還提供含有上述檢測試劑的結(jié)核T-SPOT檢測試劑盒。所述試劑盒還包括以下材料或試劑：①一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。②酶標(biāo)試劑：辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應(yīng)板，陽性對照孔中含有結(jié)核非特異性刺激抗原(如PHA等)，本底對照含有PBS或基底液。④其他T-SPOT檢測所需的試劑及耗材。優(yōu)選地，一抗固定在上述微孔反應(yīng)板上。本發(fā)明是基于雙抗體夾心原理，采用T-SPOT法檢測抗原，實(shí)驗(yàn)過程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結(jié)合細(xì)胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標(biāo)二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。本發(fā)明還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c和/或所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白在制備結(jié)核疫苗和抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種結(jié)核疫苗，其有效成分為結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c，或編碼所述抗原蛋白Rv0446c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。本發(fā)明還提供一種抗結(jié)核藥物，其有效成分包括以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c和/或所述表位肽作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動物，制備的多克隆抗體，或者以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c和/或所述表位肽作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動物，采用雜交瘤技術(shù)或DNA重組技術(shù)，制備的識別所述結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c及其T細(xì)胞表位肽抗原的人源化單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c和/或所述T細(xì)胞表位肽及其衍生的表位肽或其類似物在檢測結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。其是將人或動物的淋巴細(xì)胞經(jīng)所述結(jié)核分枝桿菌Rv0446c蛋白抗原、其T細(xì)胞表位肽及其衍生的表位肽或其類似物抗原或它們的組合物刺激后，檢測T細(xì)胞或B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。其中，結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括：γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括抗體。針對結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測方法包括酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫膠體金試驗(yàn)、細(xì)胞因子內(nèi)染色和T細(xì)胞增殖試驗(yàn)等。B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。所述淋巴細(xì)胞來自人或動物的外周血、靜脈血、腦脊液、胸腔積液或胸水等。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(一)本發(fā)明利用結(jié)核分枝桿菌Rv0446c蛋白抗原及其T細(xì)胞表位肽作為刺激物用于結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)，與以往采用完全抗原相比，能夠降低由于抗原不純造成的假陽性。(二)研究證明，本發(fā)明提供的抗原表位均能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此當(dāng)使用上述表位肽作為刺激物進(jìn)行體外T細(xì)胞γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)時，靈敏度顯著提高。(三)采用固相合成的方法合成T細(xì)胞表位肽，有利于質(zhì)量控制，且成本較低，純度高，適合大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。(四)本發(fā)明的抗原蛋白Rv0446c是結(jié)核毒力相關(guān)因子，動物實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)顯示該抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，可用作新型結(jié)核疫苗候選抗原。(五)本發(fā)明的檢測試劑可廣泛用于結(jié)核病的輔助診斷、流行病學(xué)監(jiān)測等相關(guān)領(lǐng)域。附圖說明圖1顯示本發(fā)明實(shí)施例6中抗原蛋白Rv0446c的兩條T細(xì)胞表位肽P120和P123可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ(A)、IL-4(B)和IL-10(C)。實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例1結(jié)核分枝桿菌抗原基因Rv0446c的克隆及蛋白的表達(dá)純化Rv0446c(GI:15607587)是結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組編碼的保守膜蛋白，含256個氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。根據(jù)其編碼基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌)表達(dá)并純化獲得抗原蛋白Rv0446c。實(shí)施例2結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446cT細(xì)胞表位肽的合成基于T細(xì)胞IFN-γ釋放技術(shù)，利用生物信息學(xué)軟件TEpredict和IEDB對Rv0446c編碼基因上T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測，利用固態(tài)合成法合成T細(xì)胞表位肽，再通過T-SPOT法對結(jié)核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內(nèi)的特異性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測，從而評價該抗原用于結(jié)核檢測的靈敏度和特異性。本實(shí)施例提供的結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446cT細(xì)胞表位肽選自P120、P121、P122和P123，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1-4所示。實(shí)施例3結(jié)核T-SPOT檢測試劑盒的制備所述試劑盒基本組成如下：①實(shí)施例1制備的蛋白抗原Rv0446c和/或?qū)嵤├?合成的表位肽抗原：所述表位肽選自P120、P121、P122和P123中的至少一種。②一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。酶標(biāo)試劑：辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應(yīng)板，陽性對照孔中含有結(jié)核非特異性刺激抗原(如PHA等)，本底對照含有PBS或基底液。④其他T-SPOT檢測所需的試劑及耗材。將一抗固定在上述微孔反應(yīng)板上。該試劑盒是基于雙抗體夾心原理設(shè)計(jì)的，采用T-SPOT法檢測抗原，實(shí)驗(yàn)過程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結(jié)合細(xì)胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標(biāo)二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。實(shí)施例4抗原表位肽用于結(jié)核感染的臨床檢測1.外周血淋巴細(xì)胞的分離1.1受試對象①志愿者病例的篩選標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)癥狀、體征及胸部影像學(xué)檢查診斷為肺結(jié)核的，且痰培養(yǎng)為陽性的肺結(jié)核患者。②肺部疾病患者的篩選標(biāo)準(zhǔn)：痰培養(yǎng)和痰涂片為陰性的肺部其他疾病，如塵肺、慢阻肺等肺部疾病患者。③健康志愿者的篩選標(biāo)準(zhǔn)：無結(jié)核臨床癥狀、無結(jié)核病人密切接觸史、無其他疾病或感染。入選的結(jié)核病患者和志愿者年齡在15-80歲之間，從到結(jié)核病室就診的連續(xù)時間樣本中隨機(jī)選取。共采集了50例結(jié)核病志愿者、39例肺部疾病患者及55例健康志愿者血液樣本，采血時使用無內(nèi)毒素的肝素抗凝真空采血管采集外周靜脈血，每名志愿者采血約5ml～10ml。1)樣品于4小時內(nèi)用Ficoll-Hypaque分離液分離PBMCs。2)先將全血用RPMI-1640培養(yǎng)基1:1稀釋混勻，在離心管中加入一定體積的分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方，保持兩液面界面清晰，分離液、抗凝未經(jīng)稀釋全血、RPMI1640培養(yǎng)基體積為1:1:1，室溫(18～26℃)，800g離心20分鐘。3)離心結(jié)束后，管底是紅細(xì)胞，中間層是分離液，最上層是血漿層，血漿層與分離液層之間是白色云霧狀的單個核細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)層。用吸管吸取白色云霧狀細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至15ml無菌離心管中，加入RPMI1640培養(yǎng)基至10ml，室溫條件下800g離心10分鐘。4)棄去上清，重懸后加入7mlRPMI1640培養(yǎng)基，700g離心10分鐘。5)棄去上清加0.5mlAIM-V培養(yǎng)基重懸沉淀。6)利用自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對細(xì)胞計(jì)數(shù)，用AIM-V培養(yǎng)基配制500μL細(xì)胞濃度為2.5×106/ml的細(xì)胞懸液。2.抗原表位肽的準(zhǔn)備將實(shí)施例2中固相合成法制備的抗原表位肽用DMSO溶解，各條表位肽分別用含10％胎牛血清RPIM1640培養(yǎng)基稀釋至一定濃度后使用。3.T-SPOT檢測抗原表位肽特異性T細(xì)胞采用實(shí)施例3的試劑盒，向預(yù)包被一抗的微孔板中加入以下試劑，每個病人分別設(shè)6個檢測孔：陽性對照孔(加100μL濃度為15μg/ml的植物血凝素PHA作為陽性刺激物)、陰性對照孔(加100μLPBS作為陰性對照)、4個檢測孔(4個孔中分別加入100μL濃度為20μg/ml的4條表位肽P120、P121、P122、P123中的一條)，每個孔中加入100μL上述稀釋好的PBMC，使每孔中PBMC的數(shù)量達(dá)25萬個，將抗原與PBMC細(xì)胞置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時。4.T-SPOT洗板及結(jié)果判定洗去PBMC細(xì)胞和抗原刺激物，加100μL一抗室溫下孵育1小時，用PBS洗5遍，加二抗室溫孵育1小時，再用PBS洗5遍，加底物避光顯色7分鐘后，用純化水終止顯色，將培養(yǎng)板放在通風(fēng)口處晾干觀察板上的斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果判定(表1)：空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)＝N、檢測孔斑點(diǎn)數(shù)＝T、陽性質(zhì)控孔斑點(diǎn)數(shù)＝P。表1T-SPOT結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)其中四條T細(xì)胞表位肽檢測50例結(jié)核病人、39例肺部其他疾病患者和55個健康人的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2。表2Rv0446c蛋白抗原四條T細(xì)胞表位肽檢測靈敏度和特異度統(tǒng)計(jì)表位肽靈敏度(％)特異度(％)P1203096.81P1211898.94P1226100P1232296.814條多肽聯(lián)合5093.62檢測靈敏度＝(結(jié)核病患者檢測陽性數(shù)/結(jié)核病患者總數(shù))×100％檢測特異度＝1-(肺結(jié)核病患者檢測陽性數(shù)+健康志愿者檢測陽性數(shù))/(肺部疾病患者總數(shù)+健康志愿者總數(shù))按照單條多肽檢測出陽性即為陽性的原則，經(jīng)計(jì)算得出Rv0446c蛋白抗原P120、P121、P122、P123四條表位肽聯(lián)合檢測出結(jié)核病人的靈敏度為50％，特異度為93.62％。單條T細(xì)胞表位肽檢測靈敏度可達(dá)30％。實(shí)施例5Rv0446cT細(xì)胞表位肽的免疫原性檢測1、為了驗(yàn)證Rv0446cT細(xì)胞表位肽的免疫原性，考慮到裸肽易降解且不易被抗原遞呈細(xì)胞識別的特性，將合成的裸肽與血藍(lán)蛋白(KLH)進(jìn)行偶聯(lián)，將偶聯(lián)得到的T細(xì)胞表位肽進(jìn)行免疫BALB/c小鼠。2、免疫小鼠篩選6周齡的雌性BALB/c小鼠48只，分為8組，PBS陰性對照組(PBS)，佐劑對照組血藍(lán)蛋白(KLH)對照組，結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Ag85B20μg低劑量組(Ag85b-L)、Ag85B50μg高劑量組(Ag85B-H)、Rv0446cP120多肽50μg低劑量組(P120-L)、Rv0446cP120多肽100μg高劑量組(P120-H)、Rv0446cP123多肽50μg低劑量組(P123-L)、Rv0446cP123多肽100μg高劑量組(P123-H)。將每組抗原與相應(yīng)的佐劑--多聚肌苷酸poly(I:C)50μL和雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)100μL充分乳化后采用皮下接種的方式免疫小鼠，每隔3周免疫一次，共免疫三次，末次免疫4周后進(jìn)行檢測。3、小鼠血清的分離小鼠眼球采血500μL，將血液置于37℃溫箱中2小時，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中過夜。次日，將血液3000rpm離心5分鐘后吸取上清。4、血清抗體滴度檢測1)配制抗原包被液，將抗原蛋白Rv0446c的兩條表位多肽P120和P123以及Ag85B分別用碳酸鹽緩沖液(pH＝9.6)稀釋后，得到5μg/ml的Rv0446c表位肽P120和P123包被液以及2μg/ml的Ag85B抗原包被液，酶標(biāo)板分別用兩種包被液于4℃過夜包被，次日，用PBST洗滌5遍。2)用含2％BSA的PBS液37℃封閉2小時，用PBST洗滌5遍。3)用PBS將各組血清從1:10開始進(jìn)行倍比稀釋，每孔中加入100μL稀釋后的血清，37℃孵育1小時后，用PBST洗5遍。4)分別加入5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的IgG、IgG1、IgG2a抗體，每孔100μL，37℃孵育1小時后，用PBST洗5遍。5)加入TMB37℃顯色15分鐘后，每孔中加入50μL2M硫酸終止終止顯色。6)酶標(biāo)儀檢測波長450nm的吸管光度值。7)判斷標(biāo)準(zhǔn)：OD≥2.1×OD(陰性對照)的判定為陽性。8)結(jié)果分析：各組血清的特異性抗體滴度見表3。表3小鼠血清中特異性抗體滴度IgGIgG1IgG2aPBS組111KLH組111Ag85B-L8063489142543.8452548Ag85B-H1015936285087.6640000P120-L126.998022.45P120-H226.27113.1431.75P123-L253.98142.5431.75P123-H403.17142.5740結(jié)果顯示，在空白對照組PBS組和陰性對照組KLH組中未檢測到P120和P123特異性抗體。在P120和P123多肽高低劑量免疫組中均能檢測到IgG、IgG1和IgG2a抗體，其中P120多肽IgG抗體高劑量組滴度高于低劑量組，而P123多肽高低劑量組抗體滴度無差別。采用上述方法分別對Rv0446cT細(xì)胞表位肽P121和P122進(jìn)行免疫原性檢測，在P120和P123免疫組中均能夠檢測到P120和P123特異性抗體。實(shí)施例6Rv0446cT細(xì)胞表位肽的細(xì)胞免疫原性檢測1、將實(shí)施例5中免疫的小鼠處死后，在75％酒精中浸泡5分鐘，將小鼠固定在超凈臺中的泡沫板上，剪開腹膜，分離出脾臟，將其置于裝有1640的平皿中。2、在200目的尼龍網(wǎng)上，用注射器內(nèi)芯輕輕研磨小鼠脾臟，將研磨的細(xì)胞通過濾網(wǎng)過濾。1000r/min離心5分鐘棄上清，收集細(xì)胞沉淀。3、將細(xì)胞沉淀輕輕振蕩使其松動，按照2mL/只加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后，置于37℃溫箱中孵育10分鐘后，加入相當(dāng)于紅細(xì)胞裂解液2倍體積的1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000r/min離心5分鐘棄上清，收集脾細(xì)胞沉淀。4、用1640培養(yǎng)基2ml/只重懸脾細(xì)胞，1000r/min離心5分鐘棄上清，收集脾細(xì)胞沉淀。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞濃度。5、用含有10％FBS的1640培養(yǎng)基稀釋脾細(xì)胞，使其濃度為2×106/mL。每組取500μL脾細(xì)胞液置于24孔培養(yǎng)板中，PBS組和DP佐劑組脾細(xì)胞分別用Ag85B蛋白(5μg/mL)、Rv0446c的T細(xì)胞表位肽P120(5μg/mL未偶聯(lián)KLH蛋白的裸肽)、P123(5μg/mL未偶聯(lián)KLH蛋白的裸肽)與脾細(xì)胞共同孵育，Ag85B-L和Ag85B-H組分別用500μL的Ag85B蛋白(5μg/mL)與脾細(xì)胞共同孵育，P120-L和P120-H組均用500μLP120多肽(5μg/mL未偶聯(lián)KLH蛋白的裸肽)與脾細(xì)胞共同孵育，P123-L和P123-H組均用500μL的P123多肽(5μg/mL未偶聯(lián)KLH蛋白的裸肽)與脾細(xì)胞共同孵育，每組加入500μL的無菌PBS和500μL植物血凝素(PHA)(5μg/mL)作為陰性對照和陽性對照，每個檢測孔均做2個重復(fù)。將脾細(xì)胞與相應(yīng)的刺激物在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育72小時后，收集細(xì)胞上清，采用ELISA法檢測上清中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10。6、將IFN-γ單抗、IL-2單抗、IL-4單抗等用碳酸鹽緩沖液(pH＝9.6)，L-10單抗用碳酸鹽緩沖液(pH＝6.5)按照1:500倍稀釋后，按100μL/孔加入到96微孔板中，4℃包被過夜。7、用PBTS洗滌3遍后，拍干，加入含10％FBS的PBS液室溫封閉1小時。8、用PBST洗滌5遍后，將IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的標(biāo)準(zhǔn)品按照對應(yīng)的比例稀釋成相應(yīng)濃度，分別加入到各ELISA板上，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。其余加入100μL待檢測的細(xì)胞上清，室溫孵育2小時。9、用PBST稀釋5遍后，分別加入100μLIFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10各自的檢測抗體+HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時。10、用PBST洗滌7遍后，加入TMB顯色液100μL，室溫孵育30分鐘后，加入終止液50μL終止反應(yīng)。11、酶標(biāo)儀測定波長450nm的吸光值，同時檢測波長570nm的吸光值作為對照。12、結(jié)果分析：根據(jù)細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將檢測孔的OD值代入公式，計(jì)算每組小鼠各種細(xì)胞因子的終濃度。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，與PBS組和KLH組相比，Rv0446c的T細(xì)胞表位肽P120能刺激小鼠產(chǎn)生較高濃度的IFN-γ(P＜0.001)、IL-4(P＜0.001)、IL-10(P＜0.001)，且P120高劑量組產(chǎn)生IFN-γ(P＜0.001)的量高于低劑量組，Rv0446c的T細(xì)胞表位肽P123能刺激小鼠產(chǎn)生IFN-γ(P＜0.001)，且P123高劑量組產(chǎn)生IFN-γ(P＜0.05)的量比低劑量組高。IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，可以通過激活巨噬細(xì)胞從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的清除。IL-4和IL-10是Th2型細(xì)胞因子，促進(jìn)結(jié)核感染過程中的抗體產(chǎn)生。在結(jié)核感染中起到免疫調(diào)節(jié)作用。采用上述方法分別對Rv0446cT細(xì)胞表位肽P121和P122進(jìn)行細(xì)胞免疫原性檢測，結(jié)果表明，P120和P123也能夠刺激小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子?？梢?，結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c的四條T細(xì)胞表位肽，均能刺激結(jié)核病人產(chǎn)生IFN-γ，能有效區(qū)分結(jié)核病人和肺部其他疾患病人和健康人群，且四條多肽聯(lián)合診斷效率提高。Rv0446c及其T細(xì)胞表位肽均可作為一種檢測試劑用于結(jié)核病的診斷。在動物實(shí)驗(yàn)中，Rv0446c的兩條T細(xì)胞表位肽P120和P123能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ(P＜0.001)、IL-4(P＜0.001)、IL-10(P＜0.001)，并能刺激小鼠產(chǎn)生特異性的抗體IgG、IgG1和IgG2a，由此證明Rv0446c及其T細(xì)胞表位肽具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，是一種免疫優(yōu)勢抗原，可以考慮用作結(jié)核分枝桿菌疫苗的構(gòu)建和制備。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3