本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，特別是涉及一種氫氯噻嗪快速檢測卡及其檢測方法及其制備方法。
背景技術：
目前，降壓類中成藥及保健食品以及其他標示上述功能的健康產品中非法添加的物質主要為氫氯噻嗪、利血平、鹽酸可樂定、硝苯地平等化學成分。氫氯噻嗪為利尿藥、抗高血壓藥。主要適用于心原性水腫、肝原性水腫和腎性水腫：如腎病綜合征、急性腎小球腎炎、慢性腎功能衰竭以及腎上腺皮質激素與雌激素過多引起的水腫；高血壓；尿崩癥等。長期使用氫氯噻嗪可致血膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白水平升高，高密度脂蛋白降低，有促進動脈粥樣硬化的可能。還會出現(xiàn)乏力、倦怠、眩暈、食欲缺乏、惡心、嘔吐、腹瀉及血壓降低等癥狀。因此控制氫氯噻嗪的濫用是一個亟待解決的問題。
目前，對于氫氯噻嗪的檢測常用薄層色譜法、高效液相色譜等技術，這些方法費時費力，而且成本不菲，無法滿足常規(guī)的藥品大批量快速篩查的要求。
技術實現(xiàn)要素：
為解決上述問題，本發(fā)明提供一種能快速檢測出樣品中是否含有氫氯噻嗪的氫氯噻嗪快速檢測卡及其檢測方法及其制備方法。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：
一種氫氯噻嗪快速檢測卡，包括檢測卡底板，檢測卡底板上依次設有并銜接的用于放置樣品的樣品墊、金標結合墊、包被膜，金標接合墊上設有氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG-膠體金復合物，包被膜上設有依次用氫氯噻嗪單克隆抗原的溶液印制的檢測線和用羊抗兔IgG溶液印制的質控線。
進一步作為本發(fā)明技術方案的改進，兔IgG-膠體金復合物的用量為0.2～0.9μg/cm2， 氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物的用量為0.4～0.8μg/cm2，羊抗兔IgG的用量為0.03～0.05μg/mm,的羊抗兔IgG的濃度為4mg/ml，氫氯噻嗪單克隆抗原的用量為0.03～0.1μg/mm。
進一步作為本發(fā)明技術方案的改進，包被膜的一端還銜接有吸水墊，包被膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，金標接合墊為玻璃纖維棉。
一種快速檢測氫氯噻嗪的方法，包括以下步驟：
A.將帶檢測樣品加入有機溶劑溶解，加緩釋劑稀釋后過濾，并收集濾液；
B.將濾液滴加樣品墊上，濾液與金標接合墊上設有氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG-膠體金復合物進行反應，獲得反應物；
C.反應物依次與檢測線上的氫氯噻嗪單克隆抗原的溶液及質控線上的羊抗兔IgG溶液反應并顯色。
進一步作為本發(fā)明技術方案的改進，步驟A中，的有機溶劑為醇類有機溶劑或氯仿，的醇類有機溶劑為乙醇，的緩釋劑為PBS緩沖液。
進一步作為本發(fā)明技術方案的改進，步驟C中， 當質控線和檢測線均顯紫紅色時，即待測樣品中未添加氫氯噻嗪化學成分；當質控線顯紫紅色，檢測線不顯色時，即待測樣品中含有氫氯噻嗪化學成分；當質控線和檢測線均不顯色或者只出現(xiàn)檢測線顯色時，則使用新檢測卡重新檢測。
一種氫氯噻嗪快速檢測卡的制備方法 ，包括以下步驟：
A. 分別制備樣品墊、金標結合墊、包被膜；
B. 在檢測卡底板上依次銜接樣品墊、金標結合墊、包被膜。
進一步作為本發(fā)明技術方案的改進，步驟A中，在硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜上噴印氫氯噻嗪抗原稀釋液制備包被膜的檢測線，以及噴印羊抗兔IgG稀釋液制備包被膜的檢測線；
在玻璃纖維上涂布氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG抗體 -膠體金復合物稀釋液，置烘箱烘干以制備金標結合墊。
進一步作為本發(fā)明技術方案的改進，包被膜的制備方法是用0.01M pH7.4PBS緩沖液、10%～20%蔗糖將氫氯噻嗪抗原稀釋到0.3～1.0mg/ml；噴至硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜上，每300mm的噴量為30ul，制作檢測線；將羊抗兔IgG稀釋到0.3mg/ml～0.5mg/ml，每300mm的噴量為30ul，制作質控線，檢測線與質控線的間距為4.5mm，放入烘箱45度烘干12～18小時；
金標結合墊的制備方法是：首先制備膠體金，用高純水將1%的氯金酸稀釋為0.01%，放入磁力攪拌子，置于恒溫磁力攪拌加熱套上煮沸，劇烈沸騰后每100ml一次性迅速加入0.7ml的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，至顏色保持紅色不再發(fā)生改變時停止加熱，冷卻至室溫后補足損失的水，制備得到膠體金顆粒；取半徑為15nm～40nm的膠體金顆粒，調pH值到7.0-7.4，在攪拌下按20μg抗體/ml膠體金加入氫氯噻嗪單克隆抗體或兔IgG抗體，每1ml加入100ul 10%的BSA使其穩(wěn)定，在12000rpm/s離心30min， 棄上清液，將沉淀用十分之一初始膠體金體積的0.01M pH8.5的Tris-HCl緩沖液，1‰～5‰ PVP-40，5%BSA，0.1 ‰～0.5‰NaN3重懸；將氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG抗體 -膠體金復合物用0.01M pH8.0的Tris-HCl緩沖液，1‰～5‰PVP-40，5%BSA，1‰～5‰TritonX-100，0.1‰-0.5‰NaN3稀釋至3%～10%，取玻璃纖維，每張涂布20ml～30ml，置烘箱以37℃烘干18～24小時。
進一步作為本發(fā)明技術方案的改進， 步驟A中，樣品墊的制備方法是取玻璃纖維涂布溶液為0.01M pH7.4的PBS、1%BSA、1%TWEEN～20、0.1 ‰～0.5‰NaN3，每張涂布20ml～30ml，置烘箱以37℃烘干18～24小時。
本發(fā)明的有益效果：此氫氯噻嗪快速檢測卡及其檢測方法及其制備方法，設有的樣品墊、金標結合墊、包被膜，樣品墊上的待測樣本與金標接合墊上設有氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG-膠體金復合物反應后，反應物與包被膜上設有依次用氫氯噻嗪單克隆抗原的溶液印制的檢測線和用羊抗兔IgG溶液印制的質控線反應并顯色。當質控線和檢測線均顯紫紅色時，即待測樣品中未添加氫氯噻嗪化學成分；當質控線顯紫紅色，檢測線不顯色時，即待測樣品中含有氫氯噻嗪化學成分；本發(fā)明操作步驟簡單，檢測速度快，結果容易觀察，可實現(xiàn)對大批量樣品的快速篩查，大大降低檢測成本，減少工作量，在食品藥品監(jiān)管中具有實際意義。本發(fā)明針對待測樣品成分復雜問題，對樣品預處理方法進行優(yōu)化，所需樣品量少，僅需提取、稀釋兩步即可完成樣品前處理。
附圖說明
下面結合附圖對本發(fā)明作進一步說明：
圖1是本發(fā)明實施例所述快速檢測卡的整體結構示意圖。
具體實施方式
以下將結合實施例和附圖對本發(fā)明的構思、具體結構及產生的技術效果進行清楚、完整地描述，以充分地理解本發(fā)明的目的、特征和效果。顯然，所描述的實施例只是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部實施例，基于本發(fā)明的實施例，本領域的技術人員在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的其他實施例，均屬于本發(fā)明保護的范圍。
參照圖1，本發(fā)明為一種氫氯噻嗪快速檢測卡，包括檢測卡底板5，檢測卡底板5上依次設有并銜接的用于放置樣品的樣品墊1、金標結合墊2、包被膜3，金標接合墊2上設有氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG-膠體金復合物，包被膜3上設有依次用氫氯噻嗪單克隆抗原的溶液印制的檢測線7和用羊抗兔IgG溶液印制的質控線6。
此氫氯噻嗪快速檢測卡及其檢測方法及其制備方法，設有的樣品墊1、金標結合墊2、包被膜3，樣品墊1上的待測樣本與金標接合墊2上設有氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG-膠體金復合物反應后，反應物與包被膜3上設有依次用氫氯噻嗪單克隆抗原的溶液印制的檢測線7和用羊抗兔IgG溶液印制的質控線6反應并顯色。當質控線6和檢測線7均顯紫紅色時，即待測樣品中未添加氫氯噻嗪化學成分；當質控線6顯紫紅色，檢測線7不顯色時，即待測樣品中含有氫氯噻嗪化學成分；本發(fā)明操作步驟簡單，檢測速度快，結果容易觀察，可實現(xiàn)對大批量樣品的快速篩查，大大降低檢測成本，減少工作量，在食品藥品監(jiān)管中具有實際意義。本發(fā)明針對待測樣品成分復雜問題，對樣品預處理方法進行優(yōu)化，所需樣品量少，僅需提取、稀釋兩步即可完成樣品前處理。
作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，兔IgG-膠體金復合物的用量為0.2～0.9μg/cm2， 氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物的用量為0.4～0.8μg/cm2，羊抗兔IgG的用量為0.03～0.05μg/mm,羊抗兔IgG的濃度為4mg/ml，氫氯噻嗪單克隆抗原的用量為0.03～0.1μg/mm。
作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，包被膜3的一端還銜接有吸水墊4，包被膜3為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，金標接合墊2為玻璃纖維棉。
一種快速檢測氫氯噻嗪的方法，包括以下步驟：
A.將帶檢測樣品加入有機溶劑溶解，加緩釋劑稀釋后過濾，并收集濾液；
B.將濾液滴加樣品墊1上，濾液與金標接合墊2上設有氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG-膠體金復合物進行反應，獲得反應物；
C.反應物依次與檢測線7上的氫氯噻嗪單克隆抗原的溶液及質控線6上的羊抗兔IgG溶液反應并顯色。
作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，步驟A中，的有機溶劑為醇類有機溶劑或氯仿，的醇類有機溶劑為乙醇，的緩釋劑為PBS緩沖液。
作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，步驟C中， 當質控線6和檢測線7均顯紫紅色時，即待測樣品中未添加氫氯噻嗪化學成分；當質控線6顯紫紅色，檢測線7不顯色時，即待測樣品中含有氫氯噻嗪化學成分；當質控線6和檢測線7均不顯色或者只出現(xiàn)檢測線7顯色時，則使用新檢測卡重新檢測。
一種氫氯噻嗪快速檢測卡的制備方法 ，包括以下步驟：
A. 分別制備樣品墊1、金標結合墊2、包被膜3；
B. 在檢測卡底板5上依次銜接樣品墊、金標結合墊、包被膜。
作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，步驟A中，在硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜上噴印氫氯噻嗪抗原稀釋液制備包被膜3的檢測線7，以及噴印羊抗兔IgG稀釋液制備包被膜3的檢測線7；
在玻璃纖維上涂布氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG抗體 -膠體金復合物稀釋液，置烘箱烘干以制備金標結合墊2。
作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，包被膜3的制備方法是用0.01M pH7.4PBS緩沖液、10%～20%蔗糖將氫氯噻嗪抗原稀釋到0.3～1.0mg/ml；噴至硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜上，每300mm的噴量為30ul，制作檢測線7；將羊抗兔IgG稀釋到0.3mg/ml～0.5mg/ml，每300mm的噴量為30ul，制作質控線6，檢測線7與質控線6的間距為4.5mm，放入烘箱45度烘干12～18小時；
金標結合墊2的制備方法是：首先制備膠體金，用高純水將1%的氯金酸稀釋為0.01%，放入磁力攪拌子，置于恒溫磁力攪拌加熱套上煮沸，劇烈沸騰后每100ml一次性迅速加入0.7ml的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，至顏色保持紅色不再發(fā)生改變時停止加熱，冷卻至室溫后補足損失的水，制備得到膠體金顆粒；取半徑為15nm～40nm的膠體金顆粒，調pH值到7.0-7.4，在攪拌下按20μg抗體/ml膠體金加入氫氯噻嗪單克隆抗體或兔IgG抗體，每1ml加入100ul 10%的BSA使其穩(wěn)定，在12000rpm/s離心30min， 棄上清液，將沉淀用十分之一初始膠體金體積的0.01M pH8.5的Tris-HCl緩沖液，1‰～5‰ PVP-40，5%BSA，0.1 ‰～0.5‰NaN3重懸；將氫氯噻嗪單克隆抗體-膠體金復合物和兔IgG抗體 -膠體金復合物用0.01M pH8.0的Tris-HCl緩沖液，1‰～5‰PVP-40，5%BSA，1‰～5‰TritonX-100，0.1‰-0.5‰NaN3稀釋至3%～10%，取玻璃纖維，每張涂布20ml～30ml，置烘箱以37℃烘干18～24小時。
作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，步驟A中，樣品墊1的制備方法是取玻璃纖維涂布溶液為0.01M pH7.4的PBS、1%BSA、1%TWEEN～20、0.1 ‰～0.5‰NaN3，每張涂布20ml～30ml，置烘箱以37℃烘干18～24小時。
本發(fā)明優(yōu)選實施例一：
氫氯噻嗪的快速檢測方法，對于固體劑型，依次包括下述步驟：
1）、對需檢測的產品加醇類有機溶劑或者氯仿溶解，較優(yōu)的醇類有機溶劑是乙醇，再加PBS緩釋劑稀釋后過濾，收集濾液；
其中：不同劑型樣品溶解方法如下：
硬膠囊：旋開膠囊殼，取約1粒內容物。
軟膠囊：用剪刀剪開膠囊殼，擠出約1粒內容物。
片劑：壓碎成粉末，取約1片量。
丸劑：取每次服用量的1/2左右，壓碎或剪碎。
2）、向上述樣品的任意一種中加入有機溶劑，有機溶劑的使用量以浸沒待測樣品為宜，本發(fā)明選用1～2mL的使用量，基本上可覆蓋不同劑型樣品的需要。
3）、為保證提取完全，振搖時間需不少于30秒，以適應各種劑型的需要。
通過實驗發(fā)現(xiàn)，滴加至氫氯噻嗪膠體金試紙條上的濾液，若有機溶劑的濃度大于50%，則氫氯噻嗪膠體金試紙條不能正常使用，因而需加入1mL以上的PBS緩沖液進行稀釋。同時，考慮到提取液在過濾過程中需損耗一定的溶液，因此本發(fā)明加PBS緩沖液進行稀釋至總體積為10mL，既確保試紙的靈敏度，又保證有足夠的提取液進行加樣。
對于液體劑型：無需前處理，直接檢測。
2）將步驟1）收集的濾液滴加于氫氯噻嗪膠體金層析檢測卡上，開始計時，3～5min后，根據(jù)膠體金試紙條的檢測T線和控制C線的顯色，判斷待測樣品為陽性或陰性；
3） 步驟2）所述的膠體金檢測試紙上的控制C線和檢測T線均顯紫紅色，則判斷為陰性，即待測樣品中未添加氫氯噻嗪化學成分；膠體金檢測試紙上的控制線C顯紫紅色，檢測線T不顯色，則判斷為陽性，即待測樣品中含有氫氯噻嗪化學成分；膠體金檢測試紙上的控制線C和檢測線T均不顯色，或只出現(xiàn)檢測線T顯色，則說明實驗無效，應用新的膠體金檢測試紙重新檢測。
檢測氫氯噻嗪的快速檢測卡，檢測卡底板5采用PVC材料，包括PVC板，PVC板上依次銜接的樣品墊1、金標結合墊2、包被膜3和吸水墊4，參見圖1，樣品墊1壓在金標結合墊2的1/2～1/3 左右，金標結合墊2壓在包被膜3的0.1～0.2cm，檢測線T線距離包被膜3下端6mm，質控線C線距離包被膜3上端6mm，C、T間距為4.5mm，吸水墊壓在包被膜0.1～0.2cm處。
其中：金標接合墊為吸附氫氯噻嗪單克隆抗體～膠體金復合物和兔～膠體金復合物的玻璃纖維棉，在包被膜上依次用氫氯噻嗪偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱性檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱性質控線C線，兩條線平行排列。
包被膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，單克隆-兔IgG的用量為0.2～0.9μg/cm2，優(yōu)選0.25～0.45μg/cm2，氫氯噻嗪單克隆抗體～膠體金復合物的用量為0.4～0.8μg/ cm2，優(yōu)選0.03μg/mm，羊抗兔IgG的濃度為4mg/ml，羊抗兔IgG的用量為0.03～0.05μg/mm。
檢測卡的制備方法：在PVC板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜和吸水墊；
其中：
1）包被膜的制備方法是：
用pH7.4,0.01M PBS緩沖液、10%-20%蔗糖將氫氯噻嗪抗原稀釋到0.3～1.0mg/ml，噴至硝酸纖維膜上，每300mm的噴量為30ul，為T線；羊抗兔稀釋到0.3mg/ml～0.5mg/ml，每300mm的噴量為30ul，運轉速度為80毫米／秒，泵壓力100泵壓力, 移動長度290cm為C線，C、T線的間距為4.5mm，放45℃烘箱過夜12～18小時；
2）金標結合墊結合墊的制備方法是：
用高純水將1%的氯金酸稀釋成0.01%，放入磁力攪拌子，置于恒溫磁力攪拌加熱套上煮沸，劇烈沸騰后每100ml一次性迅速加入0.7ml的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，至顏色保持紅色不再發(fā)生改變停止加熱，冷卻至室溫后補足損失的水，合格的膠體金應該透亮，無雜質和漂浮物，可保存一個月不發(fā)生改變。
取半徑為15nm～40nm的膠體金顆粒，調pH值到7.0-7.4，在攪拌下按10μg抗原/ml膠體金加入氫氯噻嗪單克隆抗體，最后每1ml加入100ul 10%的BSA使其穩(wěn)定，在12000rpm/s離心30min，棄上清液，將沉淀用十分之一初始膠體金體積的100ul的0.01M pH8.5的Tris-HCl緩沖液，1‰～5‰ PVP-40，5%BSA，0.1 ‰-0.5‰NaN3重懸，置4℃可放2個月左右；
把氫氯噻嗪單克隆抗體～膠體金復合物和兔IgG～膠體金復合物用0.01M pH8.0的Tris-HCl緩沖液，1‰～5‰PVP-40，5%BSA，1‰～5‰TritonX-100，0.1‰-0.5‰NaN3稀釋至3%～10%，取面積為25×30cm的玻璃纖維，每張涂布20ml～30ml，置烘箱，在37℃放置18～24小時。
3）制備樣品墊
取25×30cm玻璃纖維，每張涂布20ml～30ml涂布溶液為0.01M pH7.4的PBS，1%BSA，1%TWEEN-20，0.1 ‰-0.5‰NaN3，置烘箱37度18～24小時。
本發(fā)明操作步驟簡單，檢測速度快，結果容易觀察，可實現(xiàn)對大批量樣品的快速篩查，大大降低檢測成本，減少工作量，在食品藥品監(jiān)管中具有實際意義；本發(fā)明針對待測樣品成分復雜問題，對樣品預處理方法進行優(yōu)化，所需樣品量少，僅需提取、稀釋兩步即可完成樣品前處理。
當然，本發(fā)明創(chuàng)造并不局限于上述實施方式，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明精神的前提下還可做出等同變形或替換，這些等同的變形或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。