本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是關(guān)于一種使用免疫磁珠分離血清中外泌體的方法。

背景技術(shù)：

免疫磁珠分離技術(shù)是一項(xiàng)基于抗原-抗體結(jié)合作用發(fā)展起來(lái)的免疫學(xué)技術(shù)。它主要是靠在磁珠表面修飾氨基，羧基，鏈霉親和素等基團(tuán)，利用這些基團(tuán)可以和抗體共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)，可用于結(jié)合相應(yīng)的抗原，在外加磁場(chǎng)的作用下可達(dá)到相應(yīng)抗原物質(zhì)的分離，廣泛應(yīng)用于核酸提取，膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)分離如細(xì)胞分離領(lǐng)域。

外泌體（exosome）是一類(lèi)直徑為30-150nm的膜結(jié)構(gòu)囊泡，廣泛存在于血液，尿液，唾液等體液中。外泌體膜表面含有CD9，CD63和CD81標(biāo)志蛋白，膜內(nèi)含有核酸如microRNA。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者體內(nèi)血清外泌體分泌異常，具體表現(xiàn)為：（1）腫瘤患者體內(nèi)血清外泌體膜表面除含有CD9，CD63和CD81標(biāo)志蛋白外，還含有特定標(biāo)記蛋白，如胰腺癌患者體內(nèi)血清外泌體中特定表達(dá)GPC1蛋白；（2）腫瘤患者體內(nèi)血清外泌體中microRNA表達(dá)異常，如肝癌患者體內(nèi)血清外泌體中microRNA-221表達(dá)量明顯高于正常人表達(dá)量。因此，血清外泌體的表達(dá)分泌情況可作為腫瘤早期診斷的依據(jù)。

目前，血清外泌體分離有離心法，色譜法，大分子聚合物沉降法，免疫磁珠試劑盒法。離心法對(duì)外泌體得率較高，但其耗時(shí)耗力，不適合大量樣本操作。色譜法提取的外泌體純度較高，但其分離易受雜蛋白干擾，操作穩(wěn)定性差。大分子聚合物沉淀外泌體耗時(shí)短，缺點(diǎn)是所得外泌體純度低。以上所述技術(shù)均只能對(duì)血清中總的外泌體進(jìn)行分離，缺乏對(duì)特定標(biāo)志物外泌體(如CD9⁺/CD63⁺外泌體)的分離，免疫磁珠試劑盒法可對(duì)特定標(biāo)志物的外泌體進(jìn)行分離，但該項(xiàng)技術(shù)僅為少數(shù)國(guó)際巨頭公司如美國(guó)SBI公司，日本MBL公司所掌握，使用成本高昂。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種，操作簡(jiǎn)單，成本低，針對(duì)含有特定標(biāo)志物外泌體分離方法。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：一種使用免疫磁珠分離血清中外泌體的方法，該方法包括以下各步驟：

（1）預(yù)處理，室溫下以新鮮血清，經(jīng)離心分離，去除細(xì)胞碎片，取上清；

（2）取1倍體積鏈霉親和素修飾磁珠懸液用100倍體積分離緩沖液清洗，磁力架分離磁珠，100倍體積分離緩沖液懸浮；將上述懸浮液加入1倍體積CD9或CD63單克隆抗體孵育；孵育完成后用100倍體積分離緩沖液清洗，磁力架分離磁珠，100倍體積分離緩沖液懸??；

（3）將步驟（2）最終得到的磁珠懸浮液中加入2-10倍體積步驟（1）處理得到的血清上清，孵育；

（4）將步驟（3）孵育完成后用100倍體積磷酸緩沖鹽溶液清洗，磁力架分離磁珠，即得分離有外泌體的復(fù)合物即磁珠-抗體-外泌體。

進(jìn)一步的，上述步驟（2）中懸浮液加入1倍體積CD9或CD63單克隆抗體孵育30分鐘。

進(jìn)一步的，上述步驟（3）孵育2小時(shí)。

進(jìn)一步的，上述步驟中磁力架分離磁珠，清洗三遍。

進(jìn)一步的，上述分離緩沖液為含0.1%牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽溶液。

進(jìn)一步的，上述分離緩沖液以0.2微米濾膜過(guò)濾除菌。

進(jìn)一步的，上述的孵育條件為：30℃，孵育器參數(shù)為顛倒旋轉(zhuǎn)90°，傾斜5秒，5°震動(dòng)持續(xù)1秒。

附圖說(shuō)明

圖1為免疫磁珠分離血清中CD9⁺外泌體的透射電鏡效果圖。其中A,B分別為偶聯(lián)有/未偶聯(lián)有生物素化CD9單克隆抗體的磁珠富集血清外泌體后的效果圖。

圖2為免疫磁珠分離血清中CD63⁺外泌體的透射電鏡效果圖。其中A,B分別為偶聯(lián)有/未偶聯(lián)有生物素化CD63單克隆抗體的磁珠富集血清外泌體后的效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明的基本思想是使用免疫磁珠分離血清中外泌體。

下述實(shí)施例中使用的主要儀器及試劑：鏈霉親和素修飾Dynabeads? MyOne? Streptavidin T1磁珠（Invitrogen公司，美國(guó)）；生物素修飾的鼠抗人CD9單克隆抗體（Ancell公司，美國(guó)）；生物素修飾的鼠抗人CD63單克隆抗體（Ancell公司，美國(guó)）；HulaMixer? Sample Mixer孵育器（Invitrogen公司，美國(guó)）;透射電子顯微鏡（Hitachi，日本）

實(shí)施例1.免疫磁珠分離血清中CD9⁺外泌體

一．方法

（1）收集新鮮血清，置于離心機(jī)中，室溫2000g離心30分鐘，棄細(xì)胞碎片沉淀，取離心上清液（若血清處于冰凍狀態(tài)，需先26℃水浴解凍后再離心）。

（2）漩渦震蕩鏈霉親和素修飾Dynabeads? MyOne? Streptavidin T1磁珠，待磁珠懸浮液均一后，取5微升磁珠懸液加入到500微升分離緩沖液中，懸浮清洗，磁力架分離磁珠，清洗三遍。清洗完成后，500微升分離緩沖液懸浮磁珠。

（3）取5微升Ancell公司生產(chǎn)的鼠抗人生物素化CD9單克隆抗體加入到上述方法（2）所得的磁珠懸液中，顛倒混合均勻，置于HulaMixer? Sample Mixer孵育器上孵育30分鐘（參數(shù)為顛倒旋轉(zhuǎn)90°，傾斜5秒，5°震動(dòng)持續(xù)1秒）；孵育完成，孵育液置于磁力架上5分鐘，棄清液，磁珠用500微升分離緩沖液懸浮，懸浮清洗，磁力架分離磁珠，清洗三遍。清洗完成后，500微升分離緩沖液懸浮磁珠。

（4）取10微升方法（1）所得的血清加入到方法（3）所得的磁珠懸液中，顛倒混合均勻，置于HulaMixer? Sample Mixer孵育器上孵育2小時(shí)（參數(shù)為顛倒旋轉(zhuǎn)90°，傾斜5秒，5°震動(dòng)持續(xù)1秒）；孵育完成，孵育液置于磁力架上，棄清液，磁珠用500微升分離緩沖液懸浮，懸浮清洗，磁力架分離磁珠，清洗三遍；清洗完成后，即得分離有CD9⁺外泌體的復(fù)合物即磁珠-抗體-CD9⁺外泌體。

二．結(jié)果

上述方法（4）所得到的磁珠-抗體-CD9⁺外泌體復(fù)合物經(jīng)掃描電鏡拍攝后得到附圖1所示結(jié)果，顯示磁珠表面

實(shí)施例2.免疫磁珠分離血清中CD63⁺外泌體

一．方法

（1）收集新鮮血清，置于離心機(jī)中，室溫2000g離心30分鐘，棄細(xì)胞碎片沉淀，取離心上清液（若血清處于冰凍狀態(tài)，需先26℃水浴解凍后再離心）。

（2）漩渦震蕩鏈霉親和素修飾Dynabeads? MyOne? Streptavidin T1磁珠，待磁珠懸浮液均一后，取5微升磁珠懸液加入到500微升分離緩沖液中，懸浮清洗，磁力架分離磁珠，清洗三遍。清洗完成后，500微升分離緩沖液懸浮磁珠。

（3）取5微升Ancell公司生產(chǎn)的鼠抗人生物素化CD63單克隆抗體加入到上述方法（2）所得的磁珠懸液中，顛倒混合均勻，置于HulaMixer? Sample Mixer孵育器上孵育30分鐘（參數(shù)為顛倒旋轉(zhuǎn)90°，傾斜5秒，5°震動(dòng)持續(xù)1秒）；孵育完成，孵育液置于磁力架上5分鐘，棄清液，磁珠用500微升分離緩沖液懸浮，懸浮清洗，磁力架分離磁珠，清洗三遍。清洗完成后，500微升分離緩沖液懸浮磁珠。

（4）取10微升方法（1）所得的血清加入到方法（3）所得的磁珠懸液中，顛倒混合均勻，置于HulaMixer? Sample Mixer孵育器上孵育2小時(shí)（參數(shù)為顛倒旋轉(zhuǎn)90°，傾斜5秒，5°震動(dòng)持續(xù)1秒）；孵育完成，孵育液置于磁力架上，棄清液，磁珠用500微升分離緩沖液懸浮，懸浮清洗，磁力架分離磁珠，清洗三遍；清洗完成后，即得分離有CD63⁺外泌體的復(fù)合物即磁珠-抗體-CD63⁺外泌體。

二．結(jié)果

上述方法（4）所得到的磁珠-抗體-CD63⁺外泌體復(fù)合物經(jīng)掃描電鏡拍攝后得到附圖2所示結(jié)果，附圖2中的A和B對(duì)比發(fā)現(xiàn)，A中未偶聯(lián)有生物素化CD63單克隆抗體的磁珠富集血清外泌體后，磁珠表面未顯示附著有外泌體，而B(niǎo)中偶聯(lián)有生物素化CD63單克隆抗體的磁珠富集血清外泌體后，如圖中箭頭所示，磁珠表面顯示有直徑為30-150nm外泌體附著，表明本發(fā)明能夠有效的富集血清樣本中CD63⁺外泌體。