本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測技術領域，具體地說是一種H-HCG快速免疫診斷層析試紙及其制備方法。

背景技術：

人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin簡稱HCG)，是由胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌的、分子量為36700的糖蛋白激素，它是由α和β二亞基組成。HCG是臨床妊娠及妊娠相關疾病檢查中最常用的標記物，其生物免疫學特征主要由β亞基決定，為避免抗HCG抗體與其他多肽激素如FSH、LH和TSH等發(fā)生交叉反應，盡管完整的HCG在妊娠期間被發(fā)現是最常見的形式，但是HCG在血、尿中以不同的形式存在，HCG的其它亞型或片段也呈現在孕婦的血液、尿液和唾液中，這些亞型或片段包括高糖基化人絨毛膜促性腺激素(H-HCG)、游離的HCG-α單位、游離的HCG-β單位、HCG-β核心片段和缺口HCG，它們分別具有不同的生物功能。但是，目前廣泛使用的檢測人HCG的檢測工具為HCG膠體金免疫層析檢測試紙，以及使用抗HCG的α和β鏈或β—HCG單克隆抗體檢測孕婦血清總HCG濃度的方法，所測得的HCG值均小于各種HCG組分的實際總和，并且不能完全和所有類型或亞型或片段的HCG結合，也不能提供各種亞型的信息，特別是它們的生物學功能和相關的臨床意義。

早期妊娠可分為正常妊娠和不正常妊娠，不正常妊娠包括異位妊娠和自然流產，發(fā)病率在我國分別為1％和10-15％左右，而且呈逐年上升趨勢，是孕產婦的主要死亡原因之一，已經成為育齡女性重要的健康問題。為了確定異位妊娠和自然流產，盡管我們對孕婦進行孕酮和HCG水平的定量檢測，但是至今還沒有一種篩選方法能夠快速、準確地即時診斷。也沒有單獨的快速、準確地即時診斷方法來區(qū)分早期正常妊和不正常妊娠。當前臨床上通用的方法是，一是超聲檢查，二是HCG倍增試驗來確定異位妊娠的存在。通過經陰道超聲，看是否存在胚胎囊來判斷胚胎存在，通過腹部超聲則是看有無異位的妊娠存在。但是采用超聲在早期檢查胚胎、胚胎囊的方法適合于5-8周妊娠(約停經后1-4周)，當有異位妊娠癥狀的孕婦就診時往往已經錯過了超聲檢查的時機，另依賴HCG倍增試驗來分析，如二天內孕婦血中HCG水平沒有倍增，則表明異位妊娠。相反自然流產者就不能采用上述二種分析方法了。測量每二天HCG的倍增率已成為標準的婦產科檢查方法，在二天內下降的HCG的水平和不倍增常常表明妊娠失敗。然而該方法有其不足之處，其一孕婦需要就診二次，其二需要抽血二次檢測HCG水平二次以上，其三檢測結果受限制，大量不同的文獻報道檢測的敏感性為62-78％，假陽性率高達26-40％。

檢測高糖基化人絨毛膜促性腺激素(H-HCG)水平，能夠很好的監(jiān)測或區(qū)分早期妊娠的為正常妊娠和不正常妊娠，因為H-HCG是妊娠早期正常分泌的一種激素，其功能為完成胎盤向子宮內膜的植入，因此對于正常妊娠而言，H-HCG分泌的不足會使胎盤植入和生長障礙，引起胎盤發(fā)育不良而導致流產。研究顯示，妊娠4～7周時(據末次月經)血清H-HCG預測流產的效率高于常規(guī)HCG檢查。Sasaki等檢測妊娠7天左右時(據LH峰)的H-HCG和總HCG的比值來預測流產，獲得了100％的陽性預測值和75％的陰性預測值。另一項對體外受精(IVF)妊娠婦女的研究表明，胚胎植入3周后的H-HCG檢測預測IVF后妊娠結局效果優(yōu)于常規(guī)HCG檢查，并能區(qū)分流產原因是胚胎植入失敗還是臨床自然流產，Strom等對IVF術后第6天的血清和子宮組織的檢測也發(fā)現，H-HCG對成功妊娠的診斷有100％的敏感度和特異度。并能鑒別生化妊娠。Cole在最近的研究中發(fā)現，成功妊娠和自然流產者的血清HCG濃度并沒有太大差異，但自然流產妊娠婦女血清H-HCG濃度明顯低于成功妊娠者，而生化妊娠的血清H-HCG水平則更低。H-HCG的檢測在早孕、異位妊娠、早期流產、腫瘤監(jiān)測等方面具有其優(yōu)異性以及重要的臨床意義。因此，研究H-HCG，如何將其應用于產品中，來制備一種檢測速度快、且方便的產品迫在眉睫。

技術實現要素：

本發(fā)明為了解決上述技術缺陷，提供一種H-HCG快速免疫診斷層析試紙及其制備方法，此方法方便、快捷、準確性高，且此試紙適合于早期正常妊娠和不正常妊娠的診斷和鑒別診斷，在早孕、異位妊娠、早期流產、腫瘤監(jiān)測等方面具有重要的臨床意義。

本發(fā)明一方面，提供一種H-HCG快速免疫診斷試紙，包括：依次連接的樣本墊、包被有檢測T線與質控C線的硝酸纖維素膜、吸樣墊，且所述樣本墊、所述硝酸纖維素膜、所述吸樣墊依次搭接、粘貼在一支撐板上；

優(yōu)選地，H-HCG快速免疫診斷試紙還包括一結合墊，且所述結合墊設置在所述樣本墊與所述硝酸纖維素膜之間，使得所述樣本墊與所述結合墊、所述硝酸纖維素膜、所述吸樣墊構成單通道試紙；

或者

H-HCG快速免疫診斷試紙還包括一纖維隔離薄膜、一結合墊和一加液墊，且所述纖維隔離薄膜兩端分別搭接在所述樣本墊、所述硝酸纖維素膜上方，所述結合墊兩端分別搭接在所述纖維隔離薄膜、所述硝酸纖維素膜上方，所述加液墊兩端分別搭接在所述纖維隔離薄膜、所述結合墊上方，使得所述樣本墊與所述纖維隔離薄膜、所述結合墊、所述加液墊、所述硝酸纖維素膜、所述吸樣墊構成雙通道試紙。

進一步地，

所述結合墊上設置有H-HCG異性抗體B207或B152，所述硝酸纖維素膜上的所述檢測T線包被有H-HCG特異性抗體B152或B207，所述質控C線含有羊抗鼠多克隆抗體；

或者，

所述結合墊上設置有抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體，或者設置有H-HCG特異性抗體B207或B152；檢測T線由檢測線T1、檢測線T2組成，且所述檢測線T1包被有抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體、檢測線T2上包被有H-HCG特異性抗體B152或B207，或者檢測線T1上包被有H-HCG特異性抗體B152或B207，檢測線T2上包被有抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體；適合于免疫競爭法，所述硝酸纖維素膜(3)T線上包被有H-HCG抗原或相反，結合墊(2)上設置有H-HCG抗原，T線上包被有H-HCG特異性抗體。

本發(fā)明第二方面，提供第一方面所述一種H-HCG快速免疫診斷層析試紙的制備方法，包括如下步驟：

①、樣本墊的制備：配制樣本墊處理液，再將經剪裁后的玻璃纖維膜或無紡布置于樣本墊處理液中室溫浸泡、烘干、備用；

②、結合墊的制備：配制結合墊處理液、金標抗體，將結合墊原料置于結合墊處理液中室溫浸泡、烘干，再用劃膜噴金機將金標抗體噴于經浸泡后的結合墊原料、烘干備用；

③、硝酸纖維素膜包被：配制包被緩沖液，用包被緩沖液分別稀釋羊抗鼠多克隆抗體、抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體(或者它們可以是單克隆抗體、多克隆抗體或抗體的多種片段)、H-HCG單克隆抗體B207或B152至0.1-20mg/ml，獲得質控C線、檢測線T1、檢測線T2或者質控C線、檢測線T2、檢測線T1、或者質控C線、檢測T線；

④、試紙的制備：

單通道試紙：在常溫的干燥室內，取所述支撐板，先將上述包被的所述硝酸纖維素膜貼合于所述支撐板的中部，再在硝酸纖維素膜兩側分別粘貼所述結合墊、所述吸樣墊，且在所述結合墊與所述硝酸纖維素膜相對的一側粘貼所述樣本墊，最后采用裁剪機剪切所述支撐板；

雙通道試紙：所述硝酸纖維素膜一側粘貼所述吸樣墊，且所述吸樣墊一側與所述硝酸纖維素膜搭接，另一側邊緣與所述支撐板平齊，所述硝酸纖維素膜另一側與所述樣本墊搭接，使得待測樣本依次通過所述樣本墊、所述硝酸纖維素膜、所述吸樣墊形成第一水平流動通道；

將所述纖維隔離薄膜兩端分別搭接在所述樣本墊、所述硝酸纖維素膜上方，所述結合墊兩端分別搭接在所述纖維隔離薄膜、所述硝酸纖維素膜上方，所述加液墊兩端分別搭接在纖維隔離薄膜、所述結合墊上方，使得檢測過程中緩沖液依次通過所述加液墊、所述結合墊、所述硝酸纖維素膜、所述吸樣墊形成第二水平流動通道，最后采用裁剪機剪切所述支撐板。

優(yōu)選地，所述步驟①中，樣本處理液的制備方法為：稱取0.5g±0.05gBSA于燒杯中，加入70ml 10mM pH8.4硼酸鹽緩沖液溶解，加入吐溫-20，混勻，定容、濾膜過濾后備用。

優(yōu)選地，步驟②中，結合墊處理液的制備方法為：稱取0.1g±0.05gBSA，0.5g±0.05g海藻糖于燒杯中，加入70ml 10mM pH8.0硼酸鹽緩沖液溶解，加入吐溫-20，混勻、濾膜過濾后備用；所述金標抗體中含抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體，或者H-HCG異性抗體B207或B152。

所述步驟③中，包被緩沖液的制備方法為：取海藻糖于燒杯中，加入PBS溶解后再加入甲醇，混勻、定容、濾膜過濾后備用。

進一步地，所述樣本墊材料為玻璃纖維膜或無紡布；所述吸樣墊由吸水濾紙構成。

進一步地，所述結合墊(2)由5-100nm膠體金或5-800nm納米材料或乳膠顆?；蛱碱w?；蚱渌l(fā)光染料或酶結合抗HCG抗體或H-HCG抗體組成，或引用或結合親和素、生物素；所述結合墊(2)中標記有特異性抗體的膠體金或纖維素納米顆粒，或者標記有特異性抗體的膠體金—纖維素納米顆粒，或二者中添加有親和素或生物素。

本發(fā)明一種H-HCG快速免疫診斷層析試紙及其制備方法，其優(yōu)點是：

①、結合墊、硝酸纖維素膜上包被H-HCG異性抗體B207或B152、或者抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體的設計，可通過人體H-HCG含量的體現如血液、尿液、唾液等樣本的檢測來獲知被檢測者是否懷孕、或者孕婦的胎盤功能是否良好以及預測流產等；且此H-HCG試紙適用于妊娠早期，特別是同房后5-7天或月經過期當天的前1-2天即可開始檢測，可供各級醫(yī)療機構對早孕婦女進行初步診斷及婦女在家中自我檢測；

②、這種利用免疫層析試紙法快速檢測的診斷試劑，特別適合于早期正常妊娠和不正常妊娠的診斷和鑒別診斷，具有特異性強、敏感性高，具有安全、易保存、穩(wěn)定性好和應用方便等優(yōu)點，在醫(yī)學快速診斷、健康體檢、普查以及家庭診斷方面、女性的醫(yī)學健康和優(yōu)生優(yōu)育方面有著較大的適用價值和臨床意義。

附圖說明

圖1、圖2為一種H-HCG快速免疫診斷層析試紙單通道結構示意圖；

圖3、圖4為一種H-HCG快速免疫診斷層析試紙雙通道結構示意圖；

圖5為雙通道外套殼體結構示意圖；

其中：

1、樣本墊，2、結合墊，21、加液墊，3、硝酸纖維素膜，31、檢測T線、32、檢測線T1，33、檢測線T2，34、質控C線，4、吸樣墊，5、支撐板，6、纖維隔離薄膜，7、加樣孔，8、加液孔，9、硝酸纖維素膜視窗，10、吸樣墊視窗。

具體實施方式

一種H-HCG快速免疫診斷層析試紙，包括依次連接的樣本墊1、包被有檢測T線31與質控C線34的硝酸纖維素膜3、吸樣墊4，且所述樣本墊1、所述硝酸纖維素膜3、所述吸樣墊4依次搭接、粘貼在一支撐板5上。

優(yōu)選地，H-HCG快速免疫診斷層析試紙：還包括一結合墊2，且所述結合墊2設置在所述樣本墊1與所述硝酸纖維素膜3之間，使得所述樣本墊1與所述結合墊2、所述硝酸纖維素膜3、所述吸樣墊4構成單通道試紙(如圖1、圖2所示)。

優(yōu)選地，H-HCG快速免疫診斷層析試紙：還包括一纖維隔離薄膜6、一結合墊2和一加液墊21，且所述纖維隔離薄膜6兩端分別搭接在所述樣本墊1、所述硝酸纖維素膜3上方，所述結合墊2兩端分別搭接在所述纖維隔離薄膜6、所述硝酸纖維素膜3上方，所述加液墊21兩端分別搭接在纖維隔離薄膜6、所述結合墊2上方，使得所述樣本墊1與所述纖維隔離薄膜6，所述結合墊2、與所述加液墊21、所述硝酸纖維素膜3、所述吸樣墊4構成雙通道試紙(如圖3、圖4所示)；

進一步地，

所述結合墊2上設置有H-HCG異性抗體B207或B152，所述硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B152或B207，所述質控C線34含有羊抗鼠多克隆抗體；

或者，

所述結合墊2上設置有抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體，，或者設置有H-HCG特異性抗體B207或B152；檢測T線31由檢測線T1 32、檢測線T2 33組成，且所述檢測線T1 32包被有抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體、檢測線T2 33上包被有H-HCG特異性抗體B152或B207，或者檢測線T1 32上包被有H-HCG特異性抗體B152或B207，檢測線T2 33上包被有抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體；

或者，

適合于免疫競爭法，所述硝酸纖維素膜3T線上包被有H-HCG抗原或相反，結合墊2上設置有H-HCG抗原，T線上包被有H-HCG特異性抗體。

優(yōu)選地，所述樣本墊1材料為玻璃纖維膜或無紡布；所述吸樣墊4由吸水濾紙構成。

優(yōu)選地，所述結合墊2由5-100nm膠體金或5-800nm納米材料或乳膠顆?；蛱碱w粒或其它發(fā)光染料或酶結合抗HCG抗體或H-HCG抗體組成，或引用或結合親和素、生物素；所述結合墊2中標記有特異性抗體的膠體金或纖維素納米顆粒，或者標記有特異性抗體的膠體金—纖維素納米顆粒，或二者中添加有親和素或生物素。

所述檢測T線31具有固定抗體或者H-HCG抗原或加有生物素或親和素。

上述所述中，H-HCG特異性抗體B207和B152的用量在0.01-100mg/ml，抗α-HCG或β-HCG的抗體，或者抗完整HCG抗體的用量在0.01-100mg/ml。

本發(fā)明一種H-HCG快速免疫診斷層析試紙，具體有如下形式：

一、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B207，檢測T線31為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B152，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

二、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B207，檢測T線31為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B207，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

三、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B152，檢測T線31為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B207，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

四、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B152，檢測T線31為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B152，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

五、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B207，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B152，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

六、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B207，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B152，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

七、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B207，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B152，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

八、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B207，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B152，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

九、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B207,檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體,質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

十、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B207,檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

十一、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B152，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B207，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

十二、結合墊2含有H—HCG特異性抗體B152，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有h-HCG特異性抗體B207，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上的羊抗鼠多克隆抗體；

十三、結合墊2有H-HCG特異性抗體B152，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體,檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有HCG特異性抗體B207，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

十四、結合墊2有H-HCG特異性抗體B152，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B207，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

十五、結合墊2有H-HCG特異性抗體B152，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體,檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

十六、結合墊2有H-HCG特異性抗體B152,檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體,檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體,，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

十七、結合墊2有抗α-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B207，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H—HCG特異性抗體B152,質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

十八、結合墊2有抗α-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B152，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B207，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

十九、結合墊2有抗α-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體,檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B207，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

二十、結合墊2有抗α-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B152，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

二十一、結合墊2有抗α-HCG抗體,檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B207，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

二十二、結合墊2有抗α-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B152，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗β-HCG抗體,質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

二十三、結合墊2有抗β-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有有H-HCG特異性抗體B207，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B152,質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體；

二十四、結合墊2有抗β-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B152，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B207，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體。

二十五、結合墊2有抗β-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體,檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B207，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體。

二十六、結合墊2有抗β-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體,檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B152,質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體。

二十七、結合墊2有抗β-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B207,檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體,質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體。

二十八、結合墊2有抗β-HCG抗體，檢測線T1 32為硝酸纖維素膜3上包被有H-HCG特異性抗體B152，檢測線T2 33為硝酸纖維素膜3上包被有抗α-HCG抗體，質控C線34為包被在硝酸纖維素膜3上抗鼠多克隆的羊抗體。

本發(fā)明一種H-HCG快速免疫診斷試紙還可以制作成卡、筆的形式。當雙通道模式制成卡、筆的形式時，試紙外套有一外殼，外殼上設計有與所述樣本墊1、所述加液墊21、所述硝酸纖維素膜3、所述吸樣墊4分別對應的加樣孔7、加液孔8、硝酸纖維素膜視窗9、吸樣墊視窗10(如圖5所示)。

實施例一：

所述一種H-HCG快速免疫診斷層析試紙的制備方法，包括如下步驟：

主要原料如下：

試劑：氯金酸、檸檬酸三鈉、抗α-HCG或β-HCG的抗體，H-HCG特異性抗體B207或B152；、BSA、海藻糖、NaCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、硼酸、硼砂、吐溫-20、Triton X-100、蔗糖、超純水；

耗材：硝酸纖維素膜(NC膜)、8975玻璃纖維、GF-06玻璃纖維、吸水墊、底板、容量瓶、錐形瓶、EP管、槍頭。

一、制備前的準備：

1.1 2％檸檬酸三納溶液配制

稱取0.105g檸檬酸三納于15mlEP管中，加入5ml純水，混勻至完全溶解即為2％檸檬酸三納溶液。

取40ml純水于50ml容量瓶中，向容量瓶中加入0.5ml 1％氯金酸溶液，用純水定容至50ml，混勻即為0.01％氯金酸溶液。將50ml 0.01％氯金酸溶液倒入100ml錐形瓶中，放在電爐上用3-4檔加熱至沸騰，用移液槍吸取380μL 2％檸檬酸三納溶液，快速打入到沸騰的氯金酸溶液中，繼續(xù)加熱，即40-55nm膠體金制備完畢。

1.2 PBS緩沖液配制：

稱取Na₂HPO₄·12H₂O 1.615-2g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.225-5g，NaCl 4.0-5.0g于燒杯中，加入400ml超純水溶解定容至500ml，0.22μm濾膜過濾后備用。

1.3復溶液配制：

稱取BSA 1g，蔗糖10-13g于燒杯中，加入70ml PBS溶解，加入0.08-0.1ml Triton X-100，混勻，定容至100ml，0.22μm濾膜過濾后備用。

2、最佳pH確定：

分別取1mL膠體金于6個1.5mLEP管中，向每管分別加入0.2M K₂CO₃ 1μL、2μL、3μL、5μL、7μL、10μL，對應pH分別約為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，向每管分別加入150-200μL 0.1mg/mL抗體溶液，混勻，37度靜置20min，向每管分別加入100-130μL10％NaCl溶液，混勻，靜置觀察顏色變化，0.2M K₂CO₃加入量為1-3μL的EP管中膠體金顏色仍為紫紅色，其他管變?yōu)樗{色，最適pH為7.0-8.0。

3、最小抗體標記量確定：

取4支EP管，分別取1mL膠體金加入各管中，再向每管分別加入K₂CO₃2-4μL，混勻，加入30μL(3μg)、50μL(5μg)、70μL(7μg)、100μL(10μg)的0.08-0.1mg/ml的抗體溶液，混勻，37℃靜置20min，向每管加入10％NaCl溶液，混勻，靜置觀察顏色變化，抗體加入量為7-10μg的EP管中膠體金顏色未發(fā)生明顯變化為紫紅色，抗體加入量為3、5μg的EP管中膠體金變藍，說明1ml膠體金的最小抗體加入量為5-8μg。

4、金標抗體制備：

分別取40nm-55nm的膠體金1mL于EP管中，向管中分別加入K₂CO₃溶液2-4μL，混勻，向EP管中加入0.08-0.1mg/ml抗體70μL，混勻，37℃放置20min，從管中取100μL于500μLEP管中，加入10μL10％NaCl溶液，混勻，靜置觀察顏色為紅色，可以進行后續(xù)試驗。向40-55nm的膠體金EP管中加入100μL 5％PEG溶液,37℃靜置2h進行封閉，4℃10000g離心20min，棄上清，用100μL復溶液復溶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5、

0.2M硼酸溶液配制：稱取硼酸12.37g于燒杯中，加入800ml超純水溶解后定容至1L，0.22μm濾膜過濾后備用。

0.05M硼砂溶液配制：稱取硼砂19.07g于燒杯中，加入800ml超純水溶解后定容至1L，0.22μm濾膜過濾后備用。

10mM pH8.0硼酸-硼砂緩沖液配制：分別取3ml 0.05M硼砂溶液、7ml 0.2M硼酸溶液于燒杯中，加入190ml超純水，混勻備用。

10mM pH8.4硼酸-硼砂緩沖液配制：分別取4.5ml 0.05M硼砂溶液、5.5ml 0.2M硼酸溶液于燒杯中，加入190ml超純水，混勻備用。

二、制備方法

①、樣本墊1的制備：

配制樣本液，稱取0.5g±0.05gBSA于100ml燒杯中，加入70ml 10mM pH8.4硼酸鹽緩沖液溶解，加入0.3ml吐溫-20，混勻，定容至100ml，0.22μm濾膜過濾后備用；

再將經剪裁為成0.7cm和3.2cm寬的長條后的玻璃纖維膜置于樣本液中室溫浸泡4h，37℃烘干，干燥皿中保存?zhèn)溆茫?/p>

②、結合墊2的制備：

配制結合墊2處理液：稱取0.1g±0.05gBSA，0.5g±0.05g海藻糖于100ml燒杯中，加入70ml 10mM pH8.0硼酸鹽緩沖液溶解，加入0.3ml吐溫-20，混勻，定容至100ml，0.22μm濾膜過濾后備用；

金標抗體的制備：取1mL 40-55nm膠體金于EP管中，加入2μL 0.2M K₂CO₃溶液，混勻，加入70μL 0.08-0.1mg/ml抗體溶液，混勻，37℃靜置20min，加入100μL 10％BSA溶液(終濃度1％)，混勻，37℃放置1.5h，4℃，12000g離心20min，棄上清，加入1ml PBS復溶，4℃，12000g離心20min，棄上清，加入100μL復溶液復溶，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

再將結合墊2原料裁成0.7cm寬的長條后置于結合墊2處理液中室溫浸泡4h，37℃烘干，再用劃膜噴金機按照8-15μL/cm的量將金標抗體噴于經浸泡后的結合墊2原料，37℃烘干，干燥皿中保存?zhèn)溆茫?/p>

③、硝酸纖維素膜3包被：配制包被緩沖液：稱取3g海藻糖于燒杯中，加入80-100mlPBS溶解，加入3-5ml甲醇，混勻，定容至100ml，0.22μm濾膜過濾后備用；

包被檢測線T1 32：用包被緩沖液將抗體稀釋至0.5-2mg/ml，按0.9-1.5μL/cm的量劃在所述硝酸纖維素膜3上，37℃烘干后干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>

包被檢測線T2 33：用包被緩沖液抗體稀釋至0.5-2mg/ml，按0.9-1.3μL/cm的量劃在所述硝酸纖維素膜3上，37℃烘干后干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>

包被質控C線34：用包被緩沖液將羊抗鼠多克隆抗體稀釋至1.0-1.5mg/ml，按0.7-1.4μL/cm的量劃在所述硝酸纖維素膜3上，37℃烘干后干燥皿中保存?zhèn)溆茫?/p>

④、試紙的制備：

單通道試紙制備：

在溫度20-30℃、濕度小于30-40％的干燥室內，取支撐板5，將已包被的硝酸纖維素膜3放置在支撐板5的中部粘貼；

在所述硝酸纖維素膜3的檢測T線31一側搭接結合墊2(搭結合墊2的三分之一)粘貼，在結合墊2另一側搭接粘貼樣本墊1(搭樣本墊1的十分之一)，在硝酸纖維素膜3上的質控C線34一側搭接吸樣墊4(搭吸樣墊4的十分之一)；在最上面貼一層標志膜，即H-HCG快速免疫診斷試紙制備成功，最后用裁剪機將制備的試紙切成3-4mm寬的試紙條。切好的試紙條可單用，也可以再裝入塑料卡或棒(筆)內，形成HCG-H快速診斷試紙卡或棒(筆)；

雙通道試紙制備：

在溫度20-30℃、濕度小于30-40％的干燥室內，取支撐板5，將已包被的所述硝酸纖維素膜3放置在支撐板5的中部粘貼；

在所述硝酸纖維素膜3一側粘貼所述吸樣墊4，且所述吸樣墊4一側與所述硝酸纖維素膜3搭接，另一側邊緣與所述支撐板5平齊，所述硝酸纖維素膜3另一側與所述樣本墊1搭接，使得待測樣本依次通過所述樣本墊1、所述硝酸纖維素膜3、所述吸樣墊4形成第一水平流動通道；

將所述纖維隔離薄膜6兩端分別搭接在所述樣本墊1、所述硝酸纖維素膜3上方，所述結合墊2兩端分別搭接在所述纖維隔離薄膜6、所述硝酸纖維素膜3上方，所述加液墊21兩端分別搭接在纖維隔離薄膜6、所述結合墊2上方，使得檢測過程中緩沖液依次通過所述加液墊21、所述結合墊2、所述硝酸纖維素膜3、所述吸樣墊4形成第二水平流動通道，即H-HCG快速免疫診斷試紙制備成功，最后用裁剪機將制備的試紙剪切成4mm寬的試紙條，切好的試紙條可裝入塑料卡或棒(筆)內，形成HCG-H快速診斷試紙卡或棒(筆)；

上述雙通道具體研究過程為：當樣本中的被檢測物通過第一水平流動通道達所述硝酸纖維素膜3后，與所述檢測T線31上的特異性抗體結合，10秒-5分鐘后，所述吸樣墊4有樣本層析時，所述加液墊21上加緩沖液，所述結合墊2中的標記物(綴合物)通過第二水平流動通道達到所述硝酸纖維素膜3上，與所述檢測T線31上的檢測物—特異性抗體復合物結合后呈肉眼可見的顏色(陽性/陰性)反應。為了方便或更準確觀察所述吸樣墊4有無樣本層析，所述吸樣墊4上可添加著色劑或著色條帶，當所述吸樣墊4有樣本層析時顯色，此時便可在所述加液墊21處加入緩沖液，該方法優(yōu)于和/或優(yōu)先以10秒-5分鐘后再在所述加液墊21處加入緩沖液的方式。

上述所述搭接長度均為2mm；且雙通道試紙條中，運用到所述加液墊21上的緩沖液是根據檢測物不同而選擇的不同標的緩沖液，用于快速診斷出結果。三、試紙測試及結果判斷

1、試紙條測試：

單通道：將試紙條放入待測液(使加樣孔7浸沒在液面下)中停留5s，取出平放在臺面上，15min后讀取結果，30min內有效；

雙通道：將試紙條放入待測液(使加樣孔7浸沒在液面下)中停留5s，取出平放在臺面上，當所述吸樣墊視窗10中的顏色由白色變?yōu)榧t色后，取50μLPBS滴在加液孔8中，5min后讀取結果，30min內有效。

2、結果判斷：

如圖1、圖3：當出現二條紅色條帶，一條位于檢測線T、另一條位于質控C線34，表明已懷孕，或者表明孕婦的胎盤功能良好、發(fā)生流產的幾率極??；當出現一條紅色條帶，僅位于質控C線34，表明沒有懷孕或者表明孕婦的胎盤功能差；當5-10分鐘時在質控C線34無紅色條帶出現，表明不正確的操作過程或者試紙條已變質損壞，需要用新的試紙條正確操作和/或重新測試。

如圖2、圖4，當出現三條紅色條帶，一條位于檢測線T1 32、一條位于檢測線T2 33、另一條位于質控C線34，表明已懷孕，而且孕婦的胎盤功能良好、發(fā)生流產的機會極??；當出現二條紅色條帶，一條位于檢測線T1 32或者T2、另一條位于質控C線34，表明已懷孕，但是孕婦的胎盤功能不好、發(fā)生流產的幾率大，需要進一步檢查和/或治療；當出現一條紅色條帶，僅位于質控C線34，表明沒有懷孕；當5-10分鐘時在質控C線34無紅色條帶出現，表明不正確的操作過程或者試紙條已變質損壞，需要用新的試紙條正確操作和/或重新測試。

實施例二

H—HCG快速免疫診斷層析試紙的敏感性檢測

1、12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG溶液的配制：用含0.5％BSA的PBS溶液將HCG標準品復溶，再配制成12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG溶液。

2、110mIU/ml H-HCG溶液的配制：用含0.5％BSA的PBS溶液將H-HCG標準品復溶，再配制成110mIU/ml溶液。

3、單通道：將同一批號的試紙條分別放入12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG溶液及110mIU/ml H-HCG溶液中停留約5s，取出平放在臺面上等待約15min，觀察結果，檢測結果30min內有效。每個檢測濃度各重復3次，各溶液3次檢測結果均為陽性才可判為次濃度的結果為陽性；

雙通道：將同一批號的試紙條分別放入12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG溶液及110mIU/ml H-HCG溶液中停留約5s(使加樣孔7浸沒在液面下)，取出平放在臺面上，當吸樣墊視窗10中的顏色由白色變?yōu)榧t色后，取50μL PBS溶液加在上層加液孔8中，等待約10min讀取結果，檢測結果30min內有效，每個檢測濃度各重復3次，各溶液3次檢測結果均為陽性才可判為次濃度的結果為陽性。

表1單/雙通道敏感性測試

注：“-”表示不可見，“+++”表示明顯可見,110＝110mIU/ml H-HCG溶液.

從表1可知：單通道和雙通道敏感性測試12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG標準品時HCG線正常，符合國標要求，H-HCG線未出線，說明HCG標準品與H-HCG抗體無交叉反應；測試110mIU/ml H-HCG標準品時HCG和H-HCG線均出線，說明H-HCG標準品與抗α-HCG抗體、抗β-HCG抗體和H-HCG抗體B207/B152均有較好的交叉反應。

實施例三

H—HCG快速免疫診斷層析試紙的特異性檢測

1、溶液配制：0mIU/ml HCG溶液：稱取0.5gBSA于燒杯中，加入70ml PBS緩沖液溶解定容至100ml，0.22μm濾膜過濾后備用。

2、500mIU/ml人促黃體生成素(hLH)溶液：用含0.5％BSA的PBS溶液將hLH標準品復溶，用0mIU/ml HCG溶液將其配制成濃度為500mIU/ml，即為hLH A液；用25mIU/ml HCG溶液將其配制成濃度為500mIU/ml，即為hLH B液；用110mIU/ml H-HCG溶液將其配制成濃度為500mIU/ml，即為hLH C液。

3、1000mIU/ml人卵泡刺激素(hFSH)溶液：用含0.5％BSA的PBS溶液將hFSH標準品復溶，用0mIU/ml HCG溶液將其配制成濃度為1000mIU/ml，即為hFSH A液；用25mIU/ml HCG溶液將其配制成濃度為1000mIU/ml，即為hFSH B液；用110mIU/ml H-HCG溶液將其配制成濃度為1000mIU/ml，即為hFSH C液。

4、1000μIU/ml人促甲狀腺素(hTSH)溶液：用含0.5％BSA的PBS溶液將hLH標準品復溶，用0mIU/ml HCG溶液將其配制成濃度為1000μIU/ml，即為hTSH A液；用25mIU/ml HCG溶液將其配制成濃度為1000μIU/ml，即為hTSH B液；用110mIU/ml H-HCG溶液將其配制成濃度為1000μIU/ml，即為hTSH C液。

5、陰性特異性：

單通道：將同一批號的試紙條分別放入濃度為500mIU/ml hLH A液、1000mIU/ml hFSH A液、1000μIU/ml hTSH A液溶液中停留約5s，取出平放在臺面上等待約15min，觀察結果，檢測結果30min內有效，各濃度各重復3次，各溶液的3次檢測結果均為陰性則判斷該溶液的特異性為陰性；

雙通道：將同一批號的試紙條分別放入濃度為500mIU/ml hLH A液、1000mIU/ml hFSH A液、1000μIU/ml hTSH A液溶液中停留約5s(使加樣孔7浸沒在液面下)，取出平放在臺面上，當吸樣墊視窗10中的顏色由白色變?yōu)榧t色時取50μL PBS溶液加在上層加液孔8中，等待約10min讀取結果，檢測結果30min內有效，各濃度各重復3次，各溶液的3次檢測結果均為陰性則判斷該溶液的特異性為陰性。

表2單/雙通道陰性特異性測試結果

注：“-”表示不可見，“+++”表示明顯可見

從表2可知：單通道和雙通道試紙條的陰性特異性測試HCG線和H-HCG線均為陰性，兩條T線均無假陽性出現，該項指標符合國標要求。

6、陽性特異性：

單通道：將同一批號的試紙條分別放入濃度為500mIU/ml Hlh B液和C液、1000mIU/ml hFSH B液和C液、1000μIU/ml hTSH B液和C液溶液中停留約5s，取出平放在臺面上等待約15min，觀察結果，檢測結果30min內有效。各濃度各重復3次，各溶液的3次檢測結果均為陰性則判斷該溶液的特異性為陰性；

雙通道：將同一批號的試紙條分別放入濃度為500mIU/ml hLH B液和C液、1000mIU/ml hFSH B液和C液、1000μIU/ml hTSH B液和C液溶液中停留約5s(使加樣孔7浸沒在液面下)，取出平放在臺面上，當吸樣墊視窗10中的顏色由白色變?yōu)榧t色后，取50μL PBS溶液加在上層加液孔8中，等待約10min讀取結果，檢測結果30min內有效，各濃度各重復3次，各溶液的3次檢測結果均為陽性則判斷該溶液的特異性為陽性。

表3單/雙通道陽性特異性測試結果

注：“-”表示不可見，“++”表示可見，“+++”表示明顯可見

從3表可知：單通道和雙通道試紙條的陽性特異性測試HCG線和H-HCG線均為陽性，兩條T線均無假陰性出現，該項指標也符合國標要求。

實施例四：

H—HCG快速免疫診斷層析試紙的穩(wěn)定性檢測

將同一批號的試紙條在37℃放置7d、15d、21d后分別測試試紙條靈敏度、特異性及重復性，靈敏度和特異性測試方法同實施例二和實施例三。

重復性測試方法如下：

1、單通道：每個時間點取20根試紙條放入25mIU/ml HCG標準品或者110mIU/ml的H-HCG溶液中停留約5s，取出平放在臺面上等待約15min，觀察結果，檢測結果30min內有效。

2、雙通道：每個時間點取20根試紙條放入25mIU/ml HCG標準品或者110mIU/ml的H-HCG溶液中停留約5s(使加樣孔7浸沒在液面下)，取出平放在臺面上，當吸樣墊視窗10中的顏色由白色變?yōu)榧t色后，取50μL PBS溶液加在上層加液孔8中，等待約10min讀取結果，檢測結果在30min內有效。

表4 37℃、21天破壞后試紙條單、雙通道最低檢測限測試結果

注：“-”表示不可見，“++”表示可見，“+++”表示明顯可見,110＝110mIU/ml H-HCG溶液.

表5 37℃、21天破壞后試紙條陰性特異性測試結果

注：“-”表示不可見，“+++”表示明顯可見

表6 37℃、21天破壞后試紙條陽性性特異性測試結果

注：“-”表示不可見，“++”表示可見，“+++”表示明顯可見

表7 37℃破壞后試紙條重復性測試結果

注：“-”表示不可見，“++”表示可見，“+++”表示明顯可見

從表4-7可知：單通道和雙通道試紙條經過37℃破壞后測試敏感性、特異性和重復性，結果均無假陽性和假陰性，符合國標要求，說明試紙條穩(wěn)定性良好。

實施例五:

H—HCG快速免疫診斷層析試紙的臨床實驗

對收集的臨床尿液、血液，使用本申請試紙條，按照使用方法進行檢測，以醫(yī)院臨床檢查結果進行對照，醫(yī)院血檢結果顯示50份樣本中有5份樣本的血HCG值小于1.2mIU/ml，診斷為未懷孕，為陰性樣本，其它45份樣本的血HCG值大于5mIU/ml，診斷為懷孕，為陽性樣本，經過其它臨床輔助檢查，在45份陽性樣本中診斷出5份胎停育樣本；將該50份樣本的尿液、血液分別用本試紙條檢測，試紙條檢出的5份陰性樣本與醫(yī)院臨床結果一致未出現假陽性，試紙條檢出的其它45份樣本均為陽性與醫(yī)院臨床結果一致未出現假陰性，HCG線符合率100％，另外在45份陽性樣本中本試紙條檢測出的5份胎停育樣本與醫(yī)院臨床診斷結果也一致，H-HCG線對胎停育檢測符合率也為100％，說明本申請的試紙條可以同時檢測正常懷孕和胎停育的異常妊娠或流產的初步診斷。本試紙條臨床測試見表8：

表8試紙條臨床測試結果

注：“-”表示不可見，“+++”表示明顯可見，++表示可見，+微弱可見

文中，H-HCG表示高糖基化人絨毛膜促性腺激素。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。