本發(fā)明涉及一種免疫化學(xué)發(fā)光法(ICMA)快速檢測尿甾體激素的方法，屬于分析化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甾體激素主要包括腎上腺皮質(zhì)激素和性激素(包括雄性激素及蛋白同化激素、孕激素和雌激素等)，對維持生命、機(jī)體發(fā)展、性功能調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)和生育控制等方面發(fā)揮著極其重要作用。多年來，雌三醇(E3)、氫化可的松(HC)、17β-雌二醇(17β-E2)、睪酮(T)和孕酮(P)等血甾體激素已成為人類許多疾病如內(nèi)分泌疾病等診治的臨床常用監(jiān)測指標(biāo)，但由于體內(nèi)血甾體激素分泌波動(dòng)較大，故其單次血樣僅代表人體內(nèi)瞬間甾體激素水平，且血樣采集的有創(chuàng)性等缺點(diǎn)往往是影響臨床診治患者或流行病學(xué)調(diào)研人群依從性的主要原因之一。尿液收集具有無創(chuàng)便捷的優(yōu)點(diǎn)，尿甾體激素能夠反映體內(nèi)一段時(shí)間內(nèi)其血中的平均水平，以尿樣采集替代血樣采集可明顯提高臨床患者和流行病學(xué)研究人群的依從性，近年來，隨著色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和標(biāo)記免疫測定技術(shù)的飛速發(fā)展，其檢測效能極大提高，尿甾體激素檢測臨床和流行病學(xué)研究以及樣本酶解與免疫化學(xué)發(fā)光法檢測設(shè)備一體化的研發(fā)應(yīng)用前景誘人。
目前第三代標(biāo)記免疫測定技術(shù)如免疫化學(xué)發(fā)光法等已經(jīng)普遍地應(yīng)用于臨床人血甾體激素的檢測，但其在尿甾體激素的應(yīng)用尚處于研究階段。1969年Abraham等首次報(bào)道了采用放射性免疫分析法測定血漿中的雌激素，該方法具有靈敏性、特異性和精確性的特點(diǎn)，在隨后的10年采用放射性免疫分析法測定了許多天然和合成類固醇，但該法具有繁瑣耗時(shí)、需要樣本量大、易出現(xiàn)抗體交叉反應(yīng)及同位素污染等缺點(diǎn)。于是放射性免疫分析法逐漸被非放射性配體的方法替代，如化學(xué)發(fā)光法、酶催化法和熒光法等，這些方法不需要放射性免疫分析法所需的有機(jī)溶液萃取分離步驟，允許在自動(dòng)化平臺上直接進(jìn)行免疫分析，能迅速測定甾體激素等，具有方便、簡單、迅速、價(jià)格相對低廉及需要樣本量較少等優(yōu)點(diǎn)，給人血和尿甾體激素的檢測帶來了新的機(jī)遇。
近年來，ICMA檢測尿總17β-E2、總E3等甾體激素已引起學(xué)者關(guān)注。Peper JS等用ICMA檢測41例青春期女孩晨尿總17β-E2水平(檢測范圍150～9000pmol/L)，結(jié)果顯示大腦灰質(zhì)體積與尿17β-E2呈負(fù)相關(guān)。鄭國金等建立了管式磁性微粒子ICMA檢測尿總E3的方法，結(jié)果顯示其線性范圍為1～100μg/L，檢出限為0.25μg/L，提示此法具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。盡管尿甾體激素可反映其體內(nèi)某時(shí)段平均水平，且尿樣采集具有無創(chuàng)便捷等優(yōu)點(diǎn)，但由于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少、所研究的甾體激素種類單一、檢測繁瑣或設(shè)備限制等，其在臨床性發(fā)育異常等疾病診治中應(yīng)用受限。針對上述情況，本發(fā)明提出了酶解法結(jié)合ICMA檢測尿5種臨床常用甾體激素的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種酶解法結(jié)合ICMA快速檢測尿E3、HC、17β-E2、T和P 5種甾體激素的方法，使其應(yīng)用于人體尿液甾體激素，為了解機(jī)體的生理過程、疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及個(gè)性化治療方案提供有效信息和依據(jù)。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可滿足人尿5種甾體激素同時(shí)檢測的要求。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種免疫化學(xué)發(fā)光法快速檢測尿甾體激素的方法，采用β-葡萄糖醛酸酶酶解法結(jié)合ICMA同時(shí)檢測尿E3、HC、17β-E2、T和P 5種甾體激素，定量限為0.017～4ng/mL，即5種甾體激素質(zhì)控校正品的最低濃度是0.017～4ng/mL并將其作為定量限，步驟為：
第一步：收集尿液，離心除雜質(zhì)后保存；
第二步：取第一步得到的尿液0.5mL于5mL的玻璃刻度管中，加入1.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖液和1800～2200U的β-葡萄糖醛酸酶水溶液混勻后，蓋上瓶蓋密封，50～60℃水浴3h；
第三步：采用ICMA檢測尿5種甾體激素。
上述第一步中的離心條件為：10,000rpm/min離心5min，尿液的保存溫度為-20℃。
采用上述的檢測方法后，尿5種總甾體激素的批內(nèi)差為3.2～9.6％，批間差為3.5～12.4％，回收率為93.7％～117.9％，稀釋度和尿各甾體激素相關(guān)系數(shù)均>0.99，尿液反復(fù)凍融3次后相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％。
采用本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)或者有益效果：
(1)本發(fā)明操作簡單，快速，靈敏，可滿足人尿5種甾體激素同時(shí)檢測的要求，且所用試劑廉價(jià)易得，成本低；
(2)本發(fā)明驗(yàn)證了尿液基質(zhì)對甾體激素檢測的影響較小；
(3)本發(fā)明稀釋倍數(shù)在2～32倍，檢測范圍廣且準(zhǔn)確。
(4)本發(fā)明有助于研發(fā)樣本酶解與ICMA檢測一體化設(shè)備。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，但在本發(fā)明保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
利用本發(fā)明檢測女性尿液5種甾體激素。
取女性新鮮過夜晨尿500μL，10,000rpm/min離心5min，取上清液于-20℃存貯。準(zhǔn)確量取尿樣0.5mL于5mL的玻璃刻度管中，加入1.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)和1800～2200U的β-葡萄糖醛酸酶水溶液混勻后，置于50～60℃水浴中酶解3h。將刻度管冷卻至室溫后，稀釋至儀器檢測范圍內(nèi)進(jìn)行ICMA檢測。測定尿樣前分別用E3、HC、17β-E2、T和P校準(zhǔn)品質(zhì)控，使用ICMA儀自帶的軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。標(biāo)準(zhǔn)溶液基質(zhì)S0作為零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。
實(shí)施例2
利用本發(fā)明檢測男性尿液5種甾體激素。
取男性新鮮過夜晨尿500μL，10,000rpm/min離心5min，取上清液于-20℃存貯。準(zhǔn)確量取尿樣0.5mL于5mL的玻璃刻度管中，加入1.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)和1800～2200U的β-葡萄糖醛酸酶水溶液混勻后，置于50～60℃水浴中酶解3h。將刻度管冷卻至室溫后，稀釋至儀器檢測范圍內(nèi)進(jìn)行ICMA檢測。測定尿樣前分別用E3、HC、17β-E2、T和P校準(zhǔn)品質(zhì)控，使用ICMA儀自帶的軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。標(biāo)準(zhǔn)溶液基質(zhì)S0作為零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。
實(shí)施例3
利用本發(fā)明檢測尿總甾體激素的加標(biāo)回收率評價(jià)。
在本法確定的實(shí)驗(yàn)條件下，將5種甾體激素經(jīng)過預(yù)處理步驟后，檢測酶解后總甾體激素濃度；不同尿樣加入不同濃度的某一甾體激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液檢測某一濃度甾體激素的回收率，即不同尿樣中分別加入低、中、高不同濃度的甾體激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用ICMA檢測加標(biāo)樣的濃度，并與已知量的標(biāo)準(zhǔn)品相比較，重復(fù)試驗(yàn)6次，計(jì)算得到尿樣平均加標(biāo)回收率見表2。E3、HC、17β-E2、T和P平均回收率范圍在93.7％～117.9％之間，表明本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性高。
表2 ICMA檢測尿總甾體激素的平均回收率(n＝6)
實(shí)施例4
利用本發(fā)明檢測尿總甾體激素的稀釋實(shí)驗(yàn)。
稀釋實(shí)驗(yàn)是用于考察標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品之間是否具有同質(zhì)，檢驗(yàn)方法測定的結(jié)果可靠性。用標(biāo)準(zhǔn)溶液基質(zhì)S0逐級倍比稀釋E3、HC、17β-E2、T和P高值的酶解后尿樣，得到稀釋度分別為1/2、1/4、1/8、1/16和1/32的尿樣后，用ICMA分別檢測5種甾體激素的濃度。以稀釋度作為x軸，尿樣中各甾體激素測定值為y軸，得到各擬合直線方程和相關(guān)系數(shù)如表3所示，結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)均>0.99，即稀釋度的線性關(guān)系良好。
表3 ICMA檢測尿總甾體激素的稀釋度
實(shí)施例5
利用本發(fā)明檢測尿總甾體激素的穩(wěn)定性評價(jià)
分別取低、中、高三種不同濃度的尿樣，采用本發(fā)明的ICMA前處理后，反復(fù)凍融3次檢測，計(jì)算5種總甾體激素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10％以下，結(jié)果表明尿結(jié)合態(tài)甾體激素酶解穩(wěn)定性良好。
實(shí)施例6
ICMA與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對比檢測尿總甾體激素。
ICMA與UPLC-MS/MS檢測尿總甾體激素的均值和標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果見表4。ICMA檢測尿5種總甾體激素的濃度較UPLC-MS/MS高0.96～1.15倍，兩種方法分別檢測男、女性尿檢結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于成年男女性腺不同，女性P、E3和17β-E2平均濃度較男性高，而男性T較女性均值高。部分男性的17β-E2、E3和P及女性T因低于檢測限而未被檢測出。
表4 ICMA與UPLC-MS/MS對比檢測尿總甾體激素的結(jié)果
以ICMA檢測尿總甾體激素的結(jié)果為橫坐標(biāo)，UPLC-MS/MS的檢測結(jié)果為縱坐標(biāo)，做線性回歸方程曲線，得出的斜率均小于1，表示ICMA檢測值總體稍偏高于UPLC-MS/MS，HC、T和P的斜率分別為0.9598、0.9525和0.9790，反映兩者總體結(jié)果近似，而E3和17β-E2的斜率為0.8702和0.7727，ICMA對尿雌激素檢測值稍偏高。除HC為正態(tài)分布，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)為0.930，余均不符合正態(tài)分布，計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)，E3、17β-E2、T和P的相關(guān)系數(shù)分別為0.939、0.905、0.971和0.957。兩種方法對比檢測的ICC(95％可信區(qū)間)分別為0.931(0.8577；0.9668)，0.941(0.8945；0.9679)，0.893(0.8027；0.9446)，0.964(0.9268；0.9825)和0.947(0.9002；0.9720)，表示ICMA和UPLC-MS/MS檢測尿甾體激素的一致性很高。表5為ICMA與UPLC-MS/MS檢測尿甾體激素線性回歸方程斜率、截距和線性、組內(nèi)相關(guān)系數(shù)。
表5 ICMA與UPLC-MS/MS檢測尿甾體激素線性方程斜率、截距和線性、組內(nèi)相關(guān)系數(shù)
本對比實(shí)驗(yàn)顯示ICMA與UPLC-MS/MS檢測尿5種總甾體激素具有高度一致性。ICMA和UPLC-MS/MS檢測尿5種甾體激素結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但就絕對值而言，ICMA檢測的尿5種總甾體激素的濃度似乎高于UPLC-MS/MS檢測的結(jié)果，尤其是尿E3和17β-E2，提示可能ICMA檢測尿5種甾體激素時(shí)存在一定程度的免疫交叉反應(yīng)等非特異反應(yīng)可能；從兩種檢測方法檢測的尿5種甾體激素的結(jié)果一致性來看，兩種檢測方法檢測尿5種甾體激素的相關(guān)系數(shù)為0.905～0.971，ICC為0.893～0.964，提示ICMA與UPLC-MS/MS金標(biāo)準(zhǔn)一樣，均可準(zhǔn)確檢測尿5種總甾體激素，提示ICMA檢測過程中出現(xiàn)的這種非特異反應(yīng)等不影響結(jié)果的分析。