本發(fā)明涉及一種用于檢測眼病的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：甲狀腺相關(guān)眼病(thyroidassociatedophthalmopathy,TAO)是內(nèi)分泌科常見疾病之一，也是目前世界上治療最為困難的疾病之一。TAO病程較長，各年齡段均可發(fā)生，以女性多發(fā)。輕者可影響生活、工作質(zhì)量，損傷外貌，重者可導(dǎo)致視力下降，甚至失明，給患者帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)。近年來，由于生活方式的改變，工作壓力的增加，社會環(huán)境狀況的變化，食用加碘鹽的普及，以及不正規(guī)用藥等因素，TAO的發(fā)病率明顯上升，住院率高。目前由于本病原因未明，臨床主要以激素、免疫抑制劑、生長激素類似物、抗甲狀腺藥物、眶內(nèi)放射、眼眶減壓術(shù)等綜合治療為主，但由于種種原因，效果并不盡人意，迄今為止尚無任何一種藥物能有效治療TAO，并獲長期緩解。因此，研究治療甲狀腺相關(guān)眼病的藥物是亟待解決的技術(shù)問題。而檢測所述疾病更是本領(lǐng)域積極研究的方向。近年來的研究表明，細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)與自身免疫甲狀腺病免疫病理過程密切相關(guān)。甲狀腺炎患者的甲狀腺組織內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的sICAM-1和sICAM-1表達(dá)異?；钴S。另外，發(fā)現(xiàn)伴有突眼的患者血清sICAM-1水平異常增高，這是因?yàn)榛颊哐矍蚝蠼M織強(qiáng)烈表達(dá)sICAM-1，所以血清sICAM-1升高的水平多與眶周炎癥浸潤程度密切相關(guān)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在藥物的治療過程中，甲狀腺功能和臨床癥狀的好轉(zhuǎn)與血清sICAM-1水平的下降并不同步，往往甲狀腺功能的恢復(fù)在很大程度上要早于sICAM-1的恢復(fù)。綜上所述，可溶性細(xì)胞間粘附分子-1的濃度變化可能對于判斷GD的自身免疫紊亂水平、停藥與否和是否復(fù)發(fā)等具有重要意義。細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)與甲狀腺相關(guān)眼病有直接關(guān)聯(lián)，因此，檢測細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)情況，可以直接用于鑒定甲狀腺相關(guān)眼病。然而傳統(tǒng)的檢測細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)情況具有操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。核酸適體(Aptamer,又稱適配體,適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生物革El標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systemat1cEvolut1onofL1gandsbyExponent1alenr1chment,SELEX)從人工合成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報(bào)道核酸適體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識別功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識別能力，但與抗體相比具有很多優(yōu)良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿透組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種特異結(jié)合sICAM-1的核酸適體及其試劑盒。本發(fā)明提供的核酸適體，是序列表的序列1-15所示的單鏈DNA。所述核酸適體與sICAM-1蛋白具有較好的親和能力。還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。所述核酸適體可用于制備檢測sICAM-1的試劑盒。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲血液中的sICAM-1，從而用于甲狀腺相關(guān)眼病篩查。利用本發(fā)明的核酸適體，部分代替單克隆抗體捕獲sICAM-1進(jìn)行檢測，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明具有很高的應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、核酸適體的篩選和制備設(shè)計(jì)兩端包含大約20個(gè)核苷酸、中間包括39個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下：5’-ACGACTAACGTGTAACAG(N39)CAGTGCATGATGCTACGAA-3’；N39代表39個(gè)隨機(jī)核苷酸。將單鏈DNA文庫擴(kuò)增為雙鏈DNA,產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75μgRNA文庫經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ugsICAM-1蛋白(通過陳志鴻等，人細(xì)胞間黏附分子-1的真核細(xì)胞表達(dá)與鑒定中公開的方法，表達(dá)得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸銨，l.5mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫，篩選共進(jìn)行10輪。得到了15個(gè)適配子，其序列分別為SEQIDNO:1-15所示。具體序列如下所示：sICAM-1-1：ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:1)sICAM-1-2：ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTACCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:2)sICAM-1-3：ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:3)sICAM-1-4：ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTTCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:4)sICAM-1-5：ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:5)sICAM-1-6：ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:6)sICAM-1-7：ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGATCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:7)sICAM-1-8：ACGACTAACGTGTAACAGTACCCATCCACCTTCTTACTACTGCTCTCTCAATCTACACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:8)sICAM-1-9：ACGACTAACGTGTAACAGACAGATACATTCATATCAAGTTACACATCTCCATGTTAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:9)sICAM-1-10：ACGACTAACGTGTAACAGCAGAACACAAATCTATACAAATCAGCATCACACTCATACCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:10)sICAM-1-11：ACGACTAACGTGTAACAGATACCAATCGCCACCTACACTTACATCTAGACACTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:11)sICAM-1-12：ACGACTAACGTGTAACAGTATCTACACATAGATCCTCCACTTAATAACAATCTGTCACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:12)sICAM-1-13：ACGACTAACGTGTAACAGATACCTCATCAGATATTACATTCGCCAATATTTCTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:13)sICAM-1-14：ACGACTAACGTGTAACAGTCTATAACGCCTAACTACACCACTCCACTCATTATAATACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:14)sICAM-1-15：ACGACTAACGTGTAACAGATCTATTTCACCATTAAGAACCATATCGCATCACCCTTCCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:15)實(shí)施例2sICAM-1蛋白結(jié)合適配子的性能測定將RNA適配子分別取2.0μg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，純化回收去磷酸化的RNA；通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性標(biāo)記的RNA適配子分別與不同濃度(1-200nM)的sICAM-137℃孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測定。計(jì)算各個(gè)適配子與sICAM-1的解離常數(shù)。結(jié)果如下：名稱解離常數(shù)Kd(單位nM)sICAM-1-18.8sICAM-1-28.9sICAM-1-39.0sICAM-1-47.9sICAM-1-58.3sICAM-1-68.2sICAM-1-78.9sICAM-1-89.3sICAM-1-98.7sICAM-1-108.1sICAM-1-118.0sICAM-1-129.4sICAM-1-137.8sICAM-1-148.6sICAM-1-158.9PBS空白對照無結(jié)合能力實(shí)施例3所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍亂弧菌VgrG3C蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A，Lp-PLA2蛋白,與15條適配子進(jìn)行特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與sICAM-1結(jié)合保持較高的特異性。將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)二周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。實(shí)施例4所述適配子疾病的診斷將15個(gè)適配子分別與10個(gè)甲狀腺相關(guān)眼病患者以及正常人的血液混合30min，通過生物素分離，定量分析其中的sICAM-1蛋白的含量，通過分析發(fā)現(xiàn)，10個(gè)甲狀腺相關(guān)眼病患者中sICAM-1蛋白的含量相對于正常人顯著增加。以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表〈110〉李倩〈120〉一種用于檢測眼病的試劑盒及其檢測方法〈160〉14〈210〉1〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-1：ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉2〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-2：ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTACCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉3〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-3：ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉4〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-4：ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTTCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉5〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-5：ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉6〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-6：ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉7〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-7：ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGATCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉8〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-8：ACGACTAACGTGTAACAGTACCCATCCACCTTCTTACTACTGCTCTCTCAATCTACACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉9〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-9：ACGACTAACGTGTAACAGACAGATACATTCATATCAAGTTACACATCTCCATGTTAACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉10〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-10：ACGACTAACGTGTAACAGCAGAACACAAATCTATACAAATCAGCATCACACTCATACCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉11〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-11：ACGACTAACGTGTAACAGATACCAATCGCCACCTACACTTACATCTAGACACTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉12〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-12：ACGACTAACGTGTAACAGTATCTACACATAGATCCTCCACTTAATAACAATCTGTCACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉13〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-13：ACGACTAACGTGTAACAGATACCTCATCAGATATTACATTCGCCAATATTTCTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉14〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-14：ACGACTAACGTGTAACAGTCTATAACGCCTAACTACACCACTCCACTCATTATAATACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉15〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-15：ACGACTAACGTGTAACAGATCTATTTCACCATTAAGAACCATATCGCATCACCCTTCCAGTGCATGATGCTACGAA當(dāng)前第1頁1 2 3