專利名稱：薯蕷皂素含量的elisa檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測植物體內薯蕷皂素含量的方法，具體地說，涉及一種用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)定量檢測植物體內薯蕷皂素含量的方法。
背景技術：
薯蕷皂素是合成甾體激素類藥物的最重要原料。由于常規(guī)方法檢測植物體內薯蕷皂素含量步驟繁瑣耗時，因而改進植物體內薯蕷皂素含量的測定方法成為迫切需要解決的問題。
就目前所知，檢測植物(通常是薯蕷屬植物)體內薯蕷皂素含量的常規(guī)方法有①重量法稱取切碎曬干(或在80℃烘干，另測水分)的待測樣品兩份，每份30g，分別加入2N鹽酸300ml，水浴加熱水解3.5小時，吸濾，水洗至中性，殘渣在80℃烘干，然后裝入紙筒，在脂肪抽提器中用石油醚(60-90℃)抽提完全(將最后的提取液6-8滴，在表面皿上揮干無結晶時，表示已提完)，提取液蒸濃放冷，濾集結晶，用石油醚洗兩次，結晶在80℃烘干后稱重，洗液與濾液合并后蒸濃又得少許結晶，同上烘干稱重，換算成含量百分率。
②比色法精密稱取切碎烘干的待測樣品兩份，每份0.1-0.3g放于小紙包內，分別裝入脂肪抽提器內，用苯脫脂，揮去苯后，將樣品移入錐形瓶，加2N硫酸20ml，在120℃左右加熱水解3.5小時，放冷，加水稀釋，過濾，先用1％碳酸鈉液熱洗至微堿性，再用蒸餾水洗至中性，在80℃烘干后，裝入脂肪抽提器用石油醚(60-90℃)抽提完全，將提取液轉入容量瓶(50ml)中，在30℃定容后，分別吸取0.5ml提取液蒸干，加6ml高氯酸(G.R.)顯色，一刻鐘后進行比色(分光光度計480nm進行比色)。根據(jù)標準曲線，換算成含量百分率。
③高效液相色譜法精密稱取切碎烘干的待測樣品兩份，每份0.1-0.3g放于小紙包內，分別裝入脂肪抽提器內，用苯脫脂，揮去苯后，將樣品移入錐形瓶，加2N硫酸20ml，在120℃左右加熱水解3.5小時，放冷，加水稀釋，過濾，先用1％碳酸鈉液熱洗至微堿性，再用蒸餾水洗至中性，在80℃烘干后，裝入脂肪抽提器用石油醚(60-90℃)抽提完全，將提取液轉入容量瓶(50ml)中，在30℃定容。取適量用0.45μm有機膜濾過，供進樣。進樣量20μl。C8柱(5μm，4.6mm×250mm)乙腈-水(80∶20)為流動相流速1ml/min，檢測波長205nm，樣品中薯蕷皂素與其他成分達到分離。計算峰面積積分值，根據(jù)標準曲線換算成含量百分率。
其中重量法和比色法所需設備簡單，缺點是費時，難以進行大量樣品的同時檢測，且誤差較大；高效液相色譜法測定結果精確，但同樣耗時，且所需設備昂貴(市售液相色譜儀需幾十萬至數(shù)百萬元)，操作復雜，需專門培訓的操作人員，不是一般企業(yè)或個人所能及的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服上述常規(guī)方法所存在著的缺點和不足，提供一種薯蕷皂素含量的ELISA檢測方法。具體地說是要解決以下技術問題①加工企業(yè)原料收購及加工過程中樣品的薯蕷皂素含量快速檢測問題；②相關研究過程中批量樣品，特別是微量樣品的快速檢測問題；③現(xiàn)有方法的樣品制備程序煩瑣、對設備要求高的問題。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的用蛋白偶聯(lián)的薯蕷皂素作為抗原獲得抗薯蕷皂素及相關皂甙的抗體，將其用作固相抗原競爭酶聯(lián)免疫法檢測植物體中薯蕷皂素的含量。
有關術語和縮略語BSA-牛血清白蛋白；OVA-卵清蛋白；DCC-N，N-二環(huán)己基碳二亞胺；NHS-N-羥基丁二酰亞胺；DMF-二甲基甲酰胺；OD值-吸光值；酶標板-市售40孔或96孔酶標板；磷酸鹽緩沖液-0.01mol/L PH7.8磷酸緩沖液，含0.9％氯化鈉；
底物-Na2HPO41.84g，檸檬酸0.51g在蒸餾水100ml中溶解后加鄰苯二胺40mg，避光保存，使用前加入30％H2O20.15ml。
薯蕷皂素酶聯(lián)免疫檢測方法建立過程及檢測過程如下①薯蕷皂素和琥珀酸酐在吡啶中反應使其羧基化薯蕷皂素和琥珀酸酐溶解于吡啶，密閉室溫反應3天以上，減壓蒸干，所得物質溶于氯仿，水洗3次以上，揮干氯仿。
②用DCC法將羧基化的薯蕷皂素與蛋白A偶聯(lián)為抗原將①所得的琥珀酸酐化的薯蕷皂素、DCC(N，N-二環(huán)己基碳二亞胺)、NHS(N-羥基丁二酰亞胺)按1∶1∶3的摩爾比溶于DMF(二甲基甲酰胺)中室溫反應1天，過濾，所得溶液逐滴加入BSA(牛血清白蛋白)溶液(4mg/ML)中，室溫磁力攪拌5小時，所得液體透析(0.1％無水乙酸鈉)3天，用作免疫原。
③用EDC法將羧基化的薯蕷皂素與蛋白B偶聯(lián)為包被物稱取20mgEDC(水溶性碳二亞胺)溶解于4ml水中，取3ml逐滴加入7ml 2mg/ml的OVA(卵清蛋白)溶液，磁力攪拌，然后逐滴加入琥珀酸酐化皂素/DMF溶液0.4ml，磁力攪拌，10min后加入剩下1ml EDC溶液到正在攪拌的溶液中，室溫攪拌過夜。透析(0.1％無水乙酸鈉)3天。
④用抗原免疫動物，獲得抗薯蕷皂素及相關皂甙的抗血清將②所得的偶聯(lián)物作為免疫原，免疫雄性新西蘭大白兔，一個月后加強免疫一次，兩周后放血，得抗血清。
⑤鹽析純化抗體，檢測抗體效價將③所得的包被物包被酶標板；④所得抗血清用飽和硫酸銨鹽析純化抗體，所得抗體蛋白用磷酸鹽緩沖液稀釋成梯度濃度，滴加到包被物包被的酶標板上，再依次加入酶標羊抗兔及其底物顯色。測OD值選擇合適的稀釋濃度作為抗血清效價。
⑥用酶聯(lián)免疫法檢測植物體或相關樣品內的薯蕷皂素含量樣品制備待測樣品用甲醇浸提，活性炭去色；標準曲線的制作包被物包被→加入梯度濃度薯蕷皂素標準品→⑤所得的抗體→酶標羊抗兔→底物顯色→測OD值并繪制標準曲線；樣品檢測包被物包被→加入待測樣品→⑤所得的抗體→酶標羊抗兔→底物顯色→測OD值，由標準曲線換算出待測樣品的皂素含量。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果①所需儀器設備簡單便宜，只需要酶聯(lián)免疫檢測儀(市價幾千元)便可實現(xiàn)對大批量樣品的連續(xù)快速檢測，因此投入少，檢測成本低。
②檢測時間短，特別是對于多個樣品大批量同時檢測時，單個樣品平均所需時間短，方便科研與生產的實際使用。
③檢測過程簡化，所需的樣品量少，檢測的靈敏度高。
可以滿足有關研究單位、加工企業(yè)、質檢部門大量檢測相關植物體內薯蕷皂素含量的需要。
具體實施例方式
樣品制備
稱取適量粉碎待測樣品(0.01g-1g，視樣品情況而定)，加入甲醇超聲浸提(如無超聲波設備，靜置過夜即可)3次，每次3-5ml，合并浸提液，定容，活性炭脫色。
含量檢測包被物包被酶標板(37℃過夜)，磷酸鹽緩沖液洗滌→加入梯度濃度薯蕷皂素標準品→加兔抗薯蕷皂素及相關皂甙抗體(37℃孵育1h)，磷酸鹽緩沖液洗滌→加酶標羊抗兔(37℃孵育1h)，磷酸鹽緩沖液洗滌→加底物在黑暗室溫顯色約15min→在酶標儀上測OD值，并繪制標準曲線。
取待測樣品，適當稀釋，用上述方法檢測OD值，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)，以及OD值由標準曲線換算出待測樣品的皂素含量。
每份樣品檢測三次取平均值(占3個孔)，實際操作中標準品和待測樣品在同一塊酶標板上完成。每塊96孔板可繪制標準曲線并同時檢測20份以上的樣品。
測定所需的包被好的酶標板、各種抗體、標準品、底物、緩沖液試劑等，可由專利申請者以試劑盒的方式成套提供，使用者按照上述步驟操作，每塊96孔酶標板約4小時即可檢測至少二十個樣品的薯蕷皂素含量。如果待測樣品數(shù)更多，可以使用多塊酶標板，交叉檢測，這樣單個樣品檢測所需的時間更短。
權利要求
1.薯蕷皂素含量的ELISA檢測方法，其特征在于用蛋白偶聯(lián)的薯蕷皂素作為抗原獲得抗薯蕷皂素及相關皂甙的抗體，將其用作固相抗原競爭酶聯(lián)免疫法檢測植物體或相關樣品中薯蕷皂素的含量，其主要步驟如下①薯蕷皂素和琥珀酸酐在吡啶中反應使其羧基化；②用DCC法將羧基化的薯蕷皂素與蛋白A偶聯(lián)為抗原；③用EDC法將羧基化的薯蕷皂素與蛋白B偶聯(lián)為包被物；④用抗原免疫動物，獲得抗薯蕷皂素及相關皂甙的抗血清；⑤鹽析純化抗體，檢測抗體效價；⑥用酶聯(lián)免疫法檢測植物體或相關樣品內的薯蕷皂素含量。
2.按權利要求1所述的薯蕷皂素含量的ELISA檢測方法，其特征在于蛋白A為牛血清白蛋白。
3.按權利要求1所述的薯蕷皂素含量的ELISA檢測方法，其特征在于蛋白B為卵清蛋白。
4.按權利要求1所述的薯蕷皂素含量的ELISA檢測方法，其特征在于免疫動物為雄性新西蘭大白兔。
5.按權利要求1所述的薯蕷皂素含量的ELISA檢測方法，其特征在于酶聯(lián)免疫檢測方法為固相抗原競爭酶聯(lián)免疫檢測法。
全文摘要
本發(fā)明公開了薯蕷皂素含量的ELISA檢測方法；涉及一種檢測植物體或相關樣品內薯蕷皂素含量的方法。本發(fā)明是用蛋白偶聯(lián)的薯蕷皂素作為抗原，獲得抗薯蕷皂素及相關皂甙的抗體，將其用作固相抗原競爭酶聯(lián)免疫法檢測植物體或相關樣品中薯蕷皂素的含量。本發(fā)明所需儀器設備簡單便宜，投入少，檢測成本低、時間短、過程簡化，樣品量少，靈敏度高，可以滿足有關研究單位、貿易、加工企業(yè)、質檢部門批量檢測相關植物體內薯蕷皂素含量的需要。
文檔編號G01N33/543GK1421701SQ0214787
公開日2003年6月4日 申請日期2002年12月19日 優(yōu)先權日2002年12月19日
發(fā)明者李家儒, 何驥, 胡江麗 申請人:武漢大學