本發(fā)明涉及一種抗環(huán)瓜氨酸肽的測(cè)定試劑及其制備方法，屬于生化手段測(cè)試
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病。其特征是手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對(duì)稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥，經(jīng)常伴有關(guān)節(jié)外器官受累及血清類風(fēng)濕因子陽(yáng)性，可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失。RA的發(fā)病可能與遺傳、感染、性激素等有關(guān)。RA關(guān)節(jié)炎的病理主要有滑膜襯里細(xì)胞增生、間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以及微血管的新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等。目前該病影響到全世界1-2％的人口，女性的發(fā)病率為男性的2～3倍，可發(fā)生于任何年齡，高發(fā)年齡為40～60歲。RA的癥狀表現(xiàn)如下：(1)晨僵：早晨起床時(shí)關(guān)節(jié)活動(dòng)不靈活的主觀感覺，它是關(guān)節(jié)炎癥的一種非特異表現(xiàn)，其持續(xù)時(shí)間與炎癥的嚴(yán)重程度成正比。(2)關(guān)節(jié)受累的表現(xiàn)：①多關(guān)節(jié)受累：呈對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎(?！?個(gè)關(guān)節(jié))。易受累的關(guān)節(jié)有手、足、腕、踝及顳頜關(guān)節(jié)等。②關(guān)節(jié)畸形：手的畸形有梭形腫脹、尺側(cè)偏斜、天鵝頸樣畸形、鈕扣花樣畸形等。足的畸形有跖骨頭向下半脫位引起的仰趾畸形、外翻畸形、跖趾關(guān)節(jié)半脫位、彎曲呈錘狀趾及足外翻畸形。③其他：可有正中神經(jīng)/脛后神經(jīng)受壓引起的腕管/跗管綜合征，膝關(guān)節(jié)腔積液擠入關(guān)節(jié)后側(cè)形成腘窩囊腫(Baker囊腫)，頸椎受累(第2、3頸椎多見)可有頸部疼痛、頸部無力及難以保持其正常位置，寰樞關(guān)節(jié)半脫位，相應(yīng)有脊髓受壓及椎基底動(dòng)脈供血不足的表現(xiàn)。(3)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)：①一般表現(xiàn)：可有發(fā)熱、類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、類風(fēng)濕血管炎(主要累及小動(dòng)脈的壞死性小動(dòng)脈炎)及淋巴結(jié)腫大。②心臟受累：可有心包炎、心包積液、心外膜、心肌及瓣膜的結(jié)節(jié)、心肌炎、冠狀動(dòng)脈炎、主動(dòng)脈炎、傳導(dǎo)障礙，慢性心內(nèi)膜炎及心瓣膜纖維化等表現(xiàn)。③呼吸系統(tǒng)受累：可有胸膜炎、胸腔積液、肺動(dòng)脈炎、間質(zhì)性肺疾病、結(jié)節(jié)性肺病等。④腎臟表現(xiàn)：主要有原發(fā)性腎小球及腎小管間質(zhì)性腎炎、腎臟淀粉樣變和繼發(fā)于藥物治療(金制劑、青霉胺及NSAIDs)的腎損害。⑤神經(jīng)系統(tǒng)：除周圍神經(jīng)受壓的癥狀外，還可誘發(fā)神經(jīng)疾病、脊髓病、外周神經(jīng)病、繼發(fā)于血管炎的缺血性神經(jīng)病、肌肥大及藥物引起的神經(jīng)系統(tǒng)病變。⑥貧血：是RA最常見的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，屬于慢性疾病性貧血，常為輕至中度。⑦消化系統(tǒng)：可因RA血管炎、并發(fā)癥或藥物治療所致。⑧眼：幼年患者可有葡萄膜炎，成人可有鞏膜炎，可能由血管炎所致。還可有干燥性結(jié)膜角膜炎、鞏膜軟化、鞏膜軟化穿孔、角膜溶解。(4)Felty綜合征：1％的RA患者可有脾大、中性粒細(xì)胞減少(及血小板減少、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)減少)，常有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)病變、高滴度的RF及ANA陽(yáng)性，屬于一種嚴(yán)重型RA。(5)老年發(fā)病的RA：常>65歲起病，性別差異小，多呈急性發(fā)病，發(fā)展較快(部分以O(shè)A為最初表現(xiàn)，幾年后出現(xiàn)典型的RA表現(xiàn))。以手足水腫、腕管和跗管綜合征及多肌痛為突出表現(xiàn)，晨僵明顯。患者常因心血管、感染及腎功能受損等合并癥而死亡。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的診斷目前主要依賴于臨床癥狀來判斷，僅有的血清學(xué)檢測(cè)是判斷血清中是否含有類風(fēng)濕因子的存在?？弓h(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP)是環(huán)狀聚絲蛋白的多肽片段，是以IgG型為主的抗體，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)具有很好的敏感性和特異性，且抗CCP抗體陽(yáng)性的RA病人骨破壞較抗CCP抗體陰性者嚴(yán)重。及早診斷RA及給予緩解病情的藥物治療，對(duì)控制病情非常重要。1998年，國(guó)外，首次報(bào)道的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cycliccirullinatedpeptideantibodies,抗CCP抗體)的檢測(cè)，對(duì)RA具有較高的敏感性和特異性，是RA新的血清標(biāo)志物?？捎糜赗A的早期診斷，療效檢測(cè)及預(yù)后評(píng)估。目前國(guó)內(nèi)測(cè)定抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)的主要方法是ELISA法，雖然該方法已經(jīng)比較成熟，但是缺點(diǎn)也顯而易見：定量準(zhǔn)確性差，操作時(shí)間長(zhǎng)，自動(dòng)化程度低，一般只用于定性檢測(cè)。基于此，做出本申請(qǐng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)在測(cè)試過程中存在的上述缺陷，本發(fā)明首先提供一種快速靈敏、準(zhǔn)確性好、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便，適用于臨床全自動(dòng)或半自動(dòng)生化分析的抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)測(cè)定試劑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：一種抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)測(cè)定試劑，包括R1試劑、R2試劑和抗環(huán)瓜氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品，所述的R1試劑主要成分是Phosphate/NaCL緩沖液；所述的R2試劑主要成分是環(huán)瓜氨酸抗原與膠乳顆粒/PBS；所述的抗環(huán)瓜氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品的主要成分是抗環(huán)瓜氨酸肽、磷酸鹽緩沖液、牛血清蛋白(BSA)和疊氮鈉。具有上述特征抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)測(cè)定試劑的制備方法：(1)R1試劑配制：將Phosphate/NaCL緩沖液加入到容器中；開啟攪拌，攪拌速度為300-500轉(zhuǎn)/分，攪拌均勻。(2)R2試劑配制：將環(huán)瓜氨酸抗原與膠乳顆粒/PBS加入純化水中，開啟攪拌，攪拌速度均為300-500轉(zhuǎn)/分；加入疊氮鈉，繼續(xù)攪拌十分鐘，直至疊氮鈉完全溶解；加純化水定容。(3)抗環(huán)瓜氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品：在容器中加入磷酸鹽緩沖液，開啟攪拌，攪拌速度均為300-500轉(zhuǎn)/分；加入抗環(huán)瓜氨酸肽，攪拌十分鐘，直至完全溶解；加入牛血清蛋白，攪拌十分鐘，直至完全溶解；加入疊氮鈉，攪拌十分鐘，直至完全溶解，定容。本發(fā)明的工作原理如下：采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量檢測(cè)人血清中抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體。將環(huán)瓜氨酸肽結(jié)合BSA吸附于膠乳顆粒上，通過孵育使稀釋的人血清或血漿中特異性抗體與抗原結(jié)合，經(jīng)孵育后，產(chǎn)生的吸亮度變化量與檢測(cè)樣本中的特異性抗體濃度成正比。具體實(shí)施方式本實(shí)施例一種抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)測(cè)定試劑，包括R1試劑、R2試劑和抗環(huán)瓜氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品，所述的R1試劑主要成分是Phosphate/NaCL緩沖液；所述的R2試劑主要成分是環(huán)瓜氨酸抗原與膠乳顆粒/PBS；所述的抗環(huán)瓜氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品的主要成分是抗環(huán)瓜氨酸肽、磷酸鹽緩沖液、牛血清蛋白(BSA)和疊氮鈉?？弓h(huán)瓜氨酸肽(CCP)測(cè)定試劑的制備方法：(1)R1試劑配制：①將3LPhosphate/NaCL緩沖液加入到適當(dāng)容器中；②開啟電動(dòng)攪拌器，攪拌速度為450轉(zhuǎn)/分，攪拌十分鐘。(2)R2試劑配制：①將10mL環(huán)瓜氨酸抗原與膠乳顆粒/PBS加入到約0.8L純化水中，開啟電動(dòng)攪拌器，攪拌十分鐘；②將2g疊氮鈉加入上述溶液中，繼續(xù)攪拌十分鐘，直至完全溶解；③加純化水定容至1L。(3)抗環(huán)瓜氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品：①在適當(dāng)容器中加入約150ml的磷酸鹽緩沖液；②開啟電動(dòng)攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分；③在上述溶液中加入0.02001g抗環(huán)瓜氨酸肽，攪拌十分鐘，直至完全溶解；④在上述溶液中加入0.0091g牛血清蛋白，攪拌十分鐘，直至完全溶解；⑤在上述溶液中加入0.0842g疊氮鈉，攪拌十分鐘，直至完全溶解；⑥定容至200ml。(4)試劑檢驗(yàn)①儀器配置:儀器使用日立7100全自動(dòng)生化分析儀。測(cè)定參數(shù)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書在儀器中設(shè)定，基本測(cè)定參數(shù)如下：方法：終點(diǎn)法；反應(yīng)方向：遞增；波長(zhǎng)：546nm(主)、800nm(副)；溫度：37℃。比色杯光徑：1cm；R1試劑：150μl,R2試劑：50μl，樣品：5μl。第一測(cè)光點(diǎn)：在R1試劑加入后5分鐘讀??；第二測(cè)光點(diǎn)：在R2試劑加入后5分鐘讀取。②試劑外觀檢查：目測(cè)檢查。③裝量檢查：用通用量具測(cè)量。④試劑空白測(cè)定:用蒸餾水或去離子水作為空白樣品測(cè)試試劑盒，在測(cè)試主波長(zhǎng)下，記錄測(cè)試啟動(dòng)時(shí)吸光度(A1試劑)和約5分鐘后的吸光度(A2試劑)，A2即為工作試劑的空白吸光度。⑤線性范圍測(cè)定:取接近線性范圍上限的高值樣本用生理鹽水倍比稀釋配制成不同濃度梯度的樣本系列。以H值與稀釋比例計(jì)算出預(yù)期值。稀釋方法參照表1所示(根據(jù)高值的大小可相應(yīng)調(diào)整稀釋梯度)。表1樣本稀釋表實(shí)施例12345生理鹽水(ml)00.50.50.50.5高值標(biāo)本H(ml)10.50.50.50.5稀釋比例原倍1/21/41/81/16表中：實(shí)施例1樣本的濃度為已知定值CH，實(shí)施例2-5樣本濃度按公式：樣本濃度＝CH×稀釋比例，計(jì)算作為預(yù)期值，將稀釋好的樣本系列充分混勻，在校正后的測(cè)定系統(tǒng)上按從低值到高值順序平行測(cè)定2次，均值作為對(duì)應(yīng)實(shí)施例樣本實(shí)測(cè)值(如2次測(cè)定結(jié)果有明顯偏差應(yīng)剔除重測(cè))。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：以預(yù)期值為橫坐標(biāo)，樣本實(shí)測(cè)值為縱坐標(biāo)作圖及直線回歸分析，確定線性區(qū)間計(jì)算出直線方程y＝a+bx及相關(guān)系數(shù)，當(dāng)相關(guān)系數(shù)r≥0.990時(shí)為線性良好。數(shù)據(jù)分析處理采用MicrosoftExcel軟件。相關(guān)公式如下：b=nΣXiYi-ΣXi·ΣYinΣXi2-(ΣXi)2...(1)]]>|a|=|ΣYi-bΣXi|n...(2)]]>r=nΣXiYi-ΣXi·ΣYi[n·ΣXi-(ΣXi)][nΣYi-(ΣYi)]...(3)]]>式中，C：濃度；V：容積；b：回歸線的斜率；∣a∣：回歸線截距的絕對(duì)值；r：相關(guān)系數(shù)；Xi：各管預(yù)期值；Yi：各管測(cè)定值；i：1、2、3.……、n；n：測(cè)定樣本數(shù)。⑥精密度測(cè)定:a.重復(fù)性測(cè)定:用臨床標(biāo)本或質(zhì)控血清測(cè)試試劑盒，重復(fù)測(cè)試10次，計(jì)算測(cè)量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(s)。按如下公式計(jì)算變異系數(shù)(CV)。與變異系數(shù)CV(％)X‾=ΣX1/n...(4)]]>CV=Σ(X‾-Xi)(X‾)2(n-1)...(5)]]>式中：——待測(cè)血清樣本的均值；Xi——測(cè)定血清樣本的測(cè)定結(jié)果；n——測(cè)定次數(shù)CV——變異系數(shù)b.批間差測(cè)定取三個(gè)批號(hào)送檢試劑，每個(gè)批號(hào)取3瓶，分別測(cè)定1份臨床樣本或質(zhì)控血清，可選用羅氏質(zhì)控品，分別計(jì)算9份試劑測(cè)定均值和每個(gè)批號(hào)3份試劑的測(cè)定均值并用MicrosoftExcel軟件統(tǒng)計(jì)三個(gè)批號(hào)試劑測(cè)定的變異系數(shù)。相關(guān)公式如下:式中：——中的最大值；——中的最小值；——總均值。⑦準(zhǔn)確性測(cè)定:取校準(zhǔn)品(有證參考物質(zhì)，CRM)對(duì)試劑盒進(jìn)行測(cè)試，重復(fù)檢測(cè)3次，取測(cè)試結(jié)果均值(M)，按公式(7)計(jì)算相對(duì)偏差(B)。相對(duì)偏差(B)＝(M-T)/T×100％…………………………………………(7)式中：T——有證參考物質(zhì)(CRM)標(biāo)示值；M——樣品測(cè)定結(jié)果均值；⑧分析靈敏度:用已知濃度或活性的樣品測(cè)試試劑盒，記錄在試劑盒規(guī)定參數(shù)下產(chǎn)生的吸光度改變，換算為n單位的吸光度差值(ΔA)。(5)試劑測(cè)定結(jié)果如下：線性范圍：在線性范圍(5-100U/ml)內(nèi)，線性回歸的相關(guān)系數(shù)r≥0.990。濃度≤45U/ml時(shí)，絕對(duì)偏差不超過±5U/ml；當(dāng)濃度＞45U/ml時(shí)，相對(duì)偏差在±10％范圍內(nèi)。準(zhǔn)確度：比對(duì)試驗(yàn)：相關(guān)系數(shù)r≥0.990。相對(duì)偏差≤15％。測(cè)量精密度：變異系數(shù)CV≤10％,相對(duì)偏差R≤10％?？瞻孜舛龋嚎瞻孜舛?A)≦0.20(在溫度37℃；波長(zhǎng)546nm；比色皿光徑1.0cm)。分析靈敏度：試劑盒測(cè)試20U/ml被測(cè)物時(shí)，吸光度差值(ΔA)≥0.006ABS。以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)所提供技術(shù)方案所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明創(chuàng)造具體實(shí)施只局限于上述這些說明，對(duì)于本發(fā)明創(chuàng)造所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3