一種小分子抗體親和肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小分子抗體親和肽及其應(yīng)用,其氨基酸序列如SEQIDNo.1-112中的任一項所示,其與人免疫球蛋白IgG的Fc片段結(jié)合,而不與人血清白蛋白HAS結(jié)合。采用本發(fā)明的小分子抗體親和肽作為親和配體,可以實現(xiàn)高效、安全、經(jīng)濟的IgG分離純化。
【專利說明】一種小分子抗體親和肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域,具體地,本發(fā)明涉及一種小分子抗體親和肽及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫球蛋白IgG,即抗體是一種特殊的蛋白質(zhì)分子,被作為體外診斷的試劑、治療 疾病的藥物、免疫親和層析的配基等,在生命科學(xué)研究、生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的 應(yīng)用。
[0003] 目前,IgG的分離純化多采用抗體的天然親和配體Protein A/G,由于Protein A/ G存在與抗體Fe片段專一性識別的能力,使用Protein A/G親和色譜純化抗體,獲得的產(chǎn)品 的純度較高。但是由于Protein A/G也屬于具有活性的生物物質(zhì),因此Protein A/G分離 也存在一些問題:
[0004] 1)價格昂貴:因為蛋白A配基需要通過基因工程的方法生產(chǎn)純化,因此生產(chǎn)成本 高,其價格達到$10000/升親和介質(zhì);
[0005] 2)缺乏有效的清洗方法,由于蛋白A在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定,因此不能使用一般的 氫氧化鈉原位清洗法;
[0006] 3)由于配基也屬于蛋白質(zhì),易被存在原料液中的蛋白酶水解,從而降低分離效 果;
[0007] 4)與一般的化學(xué)配基相比,蛋白A色譜的使用生命周期較短;
[0008] 5)配基易脫落,脫落的蛋白A會引起人的免疫反應(yīng)且在臨床上已經(jīng)證實對人體有 毒害;
[0009] 6)洗脫pH較低(pH2_3),易引起一些抗體失活或者出現(xiàn)聚集,常常需要邊收集產(chǎn) 品,邊中和,增加操作的復(fù)雜度。
[0010] 對于抗體的分離純化,也有很多研究者嘗試使用小分子化合物作為配體,也取得 的了一定的效果,但是目前的小分子化合物配體也存在一些問題:
[0011] 1)生理毒性:目前的小分子化合物配體多含有雜環(huán),具有一定毒性。例如,4-巰 基-乙基吡啶(MEP),其對小鼠50%致死量為178mg/kg。
[0012] 2)親和性差:目前的小分子化合物配體親和力通常較Protein A/G低。
[0013] 3)選擇性差:目前的小分子化合物配體在結(jié)合IgG的同時也會與主要分離雜質(zhì) HAS結(jié)合。
[0014] 所以,目前IgG的分離純化缺乏一種高效安全經(jīng)濟的親和配體。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0015] 本發(fā)明的目的在于,提供了一種小分子抗體親和肽作為親和配體,實現(xiàn)高效安全 經(jīng)濟的IgG分離純化。
[0016] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述小分子抗體親和肽的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的小分子抗體親和肽,其氨基酸序列如SEQ ID No. 1-112中的任一項所示。
[0018] 進一步地,根據(jù)本發(fā)明的小分子抗體親和肽,其結(jié)構(gòu)特征,自N端至C端如下:
[0019] NH2-R1-R2-R3-R4-R 5-COOH,
[0020] 其中,R1為谷氨酰胺(Gln)或谷氨酸(Glu)或門冬酰胺(Asn)或門冬氨酸(Asp), R2為蘇氨酸(Thr)或纈氨酸(Val ),R3為纈氨酸(Val)或亮氨酸(Leu)或無,R4纈氨酸(Val) 或亮氨酸(Leu)或無,R 5為組氨酸(His)或賴氨酸(Lys)。也可以理解為R1為酸性氨基酸及 其衍生物,R 2為含羥基氨基酸和亮氨酸(Leu),R3、R4為纈氨酸(Val)或亮氨酸(Leu)或無, R5為堿性氨基酸。
[0021] 本發(fā)明的小分子抗體親和肽,所述小分子抗體親和肽與人免疫球蛋白IgG的Fc片 段結(jié)合。
[0022] 進一步的,本發(fā)明通過將所述的小分子抗體親和肽偶聯(lián)于載體,用于分離純化免 疫球蛋白IgG。
[0023] 本發(fā)明提供一種小分子抗體親和肽的應(yīng)用,通過將所述的小分子抗體親和肽偶聯(lián) 于不同的載體可以實現(xiàn)不同條件下免疫球蛋白IgG的分離或純化,例如將該小分子抗體親 和肽偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠,可以制備親和層析柱純化免疫球蛋白IgG ;而將該小分子抗體親 和肽偶聯(lián)于透析器的中空纖維膜,則可應(yīng)用于自身免疫性疾病的血液凈化治療,選擇性的 清除致病IgG。
[0024] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有以下優(yōu)點和有益效果:
[0025] 1)高效:該小分子抗體親和肽的結(jié)合力與人免疫球蛋白天然配體Protein A/G相 當,同時不與人血清白蛋白結(jié)合。
[0026] 2)安全:該小分子抗體親和肽分子量小(小于6肽),無免疫原性,其殘基序列取自 20種必需氨基酸,安全無毒。
[0027] 3)經(jīng)濟:該小分子抗體親和肽由固相合成而得,成本較低且便于質(zhì)量管控。
[0028] 因而采用該小分子抗體親和肽作為親和配體,可以實現(xiàn)高效、安全、經(jīng)濟的IgG分 離純化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明中小分子抗體親和肽1與免疫球蛋白IgG的SPR動力學(xué)測定曲線;
[0030] 圖2為天然配體(Pro G)與免疫球蛋白IgG的SPR動力學(xué)測定曲線。
【具體實施方式】
[0031] 實施例1多肽合成
[0032] 1)活化樹脂:稱取 IOOOmg FMOC Cys-wang Resin,加入 10 ?15mL DMF 浸泡 30min (浸沒全部樹脂),使其充分溶脹。
[0033] 2)脫保護:壓濾除去浸泡樹脂的DMF,加入含20%哌啶的DMF溶液10mL,氮氣吹沸 反應(yīng)15min,然后壓濾除去含20%哌啶的DMF溶液,脫除保護氨基的FMOC基團,用IOmL異丙 醇洗滌樹脂三次,IOmL DMF洗三次,而后用茚三酮法檢測樹脂應(yīng)成黑色或紫色。
[0034] 3)縮合反應(yīng):連接第一個氨基酸R5,稱取FMOC-氨基酸(His或Lys)的用量是 L4mmol/g樹脂,910mg 0-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU),加入 IOmL DMF和0.45g 1-羥基苯并三唑(HOBt)混和均勻后,加入0.52mL DIEA配成反應(yīng)液,室 溫下氮氣吹沸反應(yīng)2h,反應(yīng)完畢后,用異丙醇洗滌樹脂三次,然后用DMF洗滌樹脂三次,檢 測氨基。
[0035] 4)重復(fù)步驟2)?3):按多肽的順序自C端向N端延伸多肽。重復(fù)脫保護、洗滌、 縮合的過程依次將R 4、R3、R2、R1連接完畢,完成多肽的連接。
[0036] 其中,R1為谷胺酰胺(Gln)或谷氨酸(Glu)或門冬酰胺(Asn)或門冬氨酸(Asp), R2為蘇氨酸(Thr)或纈氨酸(Val ),R3為纈氨酸(Val)或亮氨酸(Leu)或無,R4纈氨酸(Val) 或亮氨酸(Leu)或無,R 5為組氨酸(His)或賴氨酸(Lys)。也可以理解為R1為酸性氨基酸及 其衍生物,R 2為含羥基氨基酸和亮氨酸(Leu),R3、R4為纈氨酸(Val)或亮氨酸(Leu)或無, R5為堿性氨基酸。
[0037] 5)多肽切割:用氮氣將多肽-樹脂復(fù)合物吹干,按TFA/phenol/H20/thioanisole/ EDT/TIS (80/5/5/5/3/2)的比例配成混和切割試劑,將多肽-樹脂復(fù)合物置于圓底燒瓶 中,加入切割液磁力攪拌2小時,用200目砂芯過濾器除去樹脂,濾液直接抽入冷凍乙醚中, 3000r/min離心使粗肽沉淀,凍干至恒重即得粗肽,干燥稱重。
[0038] 6)粗肽用HPLC純化至95%以上,質(zhì)譜鑒定。
[0039] 實施例2 IgG親和特性測定
[0040] 1)配制 10mmol/L Hepes 緩沖液,ρΗ7· 4, NaCl 含量 150mmol/L。
[0041] 2)以1)中配制液體為流動相,運行Biac〇reT200分析儀。
[0042] 3 )插入檢測芯片CM5,設(shè)定流速30 μ L/min。
[0043] 4)依次注入EDC和NHS各100 μ L,活化芯片。
[0044] 5)將IgG溶解于醋酸鈉緩沖液,ρΗ4· 5, IgGlOO μ g/mL。
[0045] 6)注入5)中IgG溶液100 μ L,固定IgG于芯片表面。
[0046] 7)分別將小分子抗體未和肽1 (氨基酸序列如SEQ ID No. 11所不),小分子抗體 親和肽2 (氨基酸序列如SEQ ID No. 34所示)和天然配體(ProG與ProA),溶解于1)中配 制液體,含量100 U g/mL。
[0047] 8)依次注入不同濃度的多肽和天然配體(濃度由高到低依次為500 μ m,250 μ m, 125 μ m,62. 5 μ m和31. 25 μ m),記錄其與IgG的吸附曲線。求得其相關(guān)參數(shù),具體結(jié)果見圖 1、圖2及表1 (小分子抗體親和肽2的免疫球蛋白IgG的SPR動力學(xué)測定曲線圖的繪制同 小分子抗體親和肽1,本實施例不再累述給出)。
[0048] 表1為本發(fā)明中小分子抗體親和肽、Protein A/G與免疫球蛋白IgG結(jié)合常數(shù)比
[0049] 較表
[0050]
【權(quán)利要求】
1. 一種小分子抗體親和肽,其特征在于,所述親和肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1-112 中的任一項所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子抗體親和肽,其特征在于,所述親和肽與人免疫球蛋 白IgG的Fc片段結(jié)合,不與人血清白蛋白HAS結(jié)合。
3. 權(quán)利要求1所述小分子抗體親和肽的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子抗體親和肽的應(yīng)用,其特征在于,所述的應(yīng)用為在分 離、純化或清除人免疫球蛋白IgG中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61M1/18GK104211769SQ201310300336
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月30日
【發(fā)明者】徐霞, 韋宇平 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所