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一種測定生物樣品中糖復合物含量的新方法與流程

文檔序號:11860597閱讀:853來源:國知局
一種測定生物樣品中糖復合物含量的新方法與流程

本發(fā)明涉及糖復合物(多糖、糖蛋白、糖脂)在生物樣品中簡單、靈敏、準確、無放射性污染、適用范圍廣泛的檢測和示蹤方法。屬于藥物分析技術領域。



背景技術:

糖復合物是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸以外的又一類重要的生物大分子,具有多種多樣的生物學功能,它幾乎沒有小分子化合物具有的異化生物代謝毒性,使用比較安全,和其他藥物的相互作用比較少。由于其上述特點和對許多目前缺少治療藥物的疾病具有良好的前景,已成為生命科學研究和新藥開發(fā)中極受重視的一類化合物。但是,由于其結(jié)構(gòu)十分復雜,分離純化困難,缺少簡單、靈敏的檢測方法,其生物利用度和藥代動力學的研究十分困難,嚴重制約了其研究和開發(fā)。

生物利用度和藥代動力學是借助動力學原理對藥物的吸收、分布、代謝和排除(ADME)過程進行研究。它是集中藥理學、藥物化學、分析化學、數(shù)學等學科于一體的邊緣學科。它承擔著闡明藥物作用機制和科學內(nèi)涵;設計及優(yōu)選給藥方案;促進新藥開發(fā)劑型優(yōu)選和質(zhì)量控制;在藥物的研發(fā)、應用中具有重要的作用和位置。

糖復合物的生物利用度和藥代動力學的研究相對困難,主要原因是缺少理想的在生物樣品中的檢測方法。目前糖復合物生物樣品中的檢測方法主要有:色譜法、放射性同位素標記法、熒光測定法和生物測定法。由于糖類結(jié)構(gòu)及其在體內(nèi)代謝的特點,其樣品和代謝產(chǎn)物是一組結(jié)構(gòu)和分子量近似的化合物。色譜法、生物法、熒光標記法對糖類化合物的藥代動力學研究,或因為檢測方法靈敏度不高、干擾強或因生物樣品處理困難、對測定結(jié)果影響嚴重等原因,使其應用受到嚴重限制。同位素標記法應用的較多,該方法的靈敏度高、適用范圍廣,應用較多。但是該方法對實驗條件要求苛刻和成本高、易造成放射性污染。尋找和建立簡單、方便的示蹤和測定方法,是在糖復合物藥代動力學,包括生物利用度研究中的關鍵技術,也是糖復合物研究中亟待解決的關鍵科學問題之一。

糖蛋白因其含有胺基或酪氨酸可同碘發(fā)生取代反應,對于不含有胺基的糖復合物,可通過制備它的熒光素衍生物后,再進行碘代反應,生成穩(wěn)定的、對糖類結(jié)構(gòu)影響較小的碘代化合物。在同位素標記法進行糖的藥代動力學研究中,以碘的放射性同位素對糖復合物進行標記是經(jīng)典和適用的方法。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS),是近年發(fā)展起來的新的分析測試技術。它不僅可以取代傳統(tǒng)的無機分析技術如電感耦合等離子體光譜技術、石墨爐原子吸收等,進行定性、定量分析及同位素比值的準確測量等,還可檢測上述方法難以檢測的元素,如鹵族元素;同時它還可以與其他技術如HPLC、HPCE、GC聯(lián)用進行元素的形態(tài)、分布特性等的分析,具有靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定的特點。將碘代多糖與ICP-MS檢測技術相結(jié)合,集成創(chuàng)新,有望建立一種新的簡單、方便、可靠、適用范圍廣的糖復合物示蹤和測定方法。

本發(fā)明完成前未發(fā)現(xiàn)有關碘代糖復合物與ICP-MS相結(jié)合測定生物樣品中糖復合物含量的報道,本發(fā)明具有廣泛的應用前景。



技術實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的之一是制備碘代糖復合物.根據(jù)糖復合物化學性質(zhì)的不同,進行不同的取代反應.

一、對于含有絡氨酸糖復合物,直接通過化學反應,以共價鍵與碘連接,生成碘代糖復合物。該反應可通過氯胺T催化,直接進行碘的取代反應,生成碘代多糖.

二、對多糖、糖脂類不含有可同碘直接發(fā)生取代反應的成分,首先制備其與熒光素的衍生物,再將碘與熒光素反應,制備碘-熒光素-多糖復合物。

本發(fā)明的目的之二是以電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)測定碘代糖復合物的含量。

ICP-MS是近年發(fā)展起來的新的分析測試技術。它不僅可以取代傳統(tǒng)的無機分析技術如電感耦合等離子體光譜技術、石墨爐原子吸收等,進行定性、定量分析及同位素比值的準確測量等,還可檢測上述方法難以檢測的元素,如鹵族元素;同時它還可以與其他技術如HPLC、HPCE、GC聯(lián)用進行元素的形態(tài)、分布特性等的分析,具有靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定的特點。

本發(fā)明是根據(jù)測定的碘含量,計算各樣品中糖復合物的含量。將碘代多糖與ICP-MS檢測技術相結(jié)合,建立新的生物樣品中測定多糖含量的方法,為集成創(chuàng)新,該方法是簡單、方便、可靠、適用范圍廣的糖復合物的示蹤和測定方法,具有實質(zhì)的突出特點和顯著的技術進步。

具體操作為:

1、一種測定生物樣品中多糖含量的新方法,所述的方法為:

(1)糖蛋白中含有游離胺基,在催化劑的催化下,游離胺基中的氫可被碘取代,生成碘代多糖,具體操作方法為:取糖蛋白樣品0.2g,以水5ml溶解,以氯胺T為催化劑,加入濃度為0.5mol/L的碘化鉀碘1ml,進行碘代反應,反應產(chǎn)物經(jīng)凝膠柱層析純化,收集糖蛋白類化合物部分,冷凍干燥得到碘代糖蛋白;

(2)對于不含有游離氨基的多糖、糖脂,可首先制備它們與熒光素的衍生物,再與碘進行取代反應,具體操作方法為:取樣品1g,溶解二甲基亞砜在10ml中,加吡啶10滴,加入熒光素0.1g,再加入二月桂酸二丁基錫20mg,95℃混合加熱2小時,加入無水乙醇50mL,放置,傾去上清,以乙醇反復清洗,洗去多余的染料,離心,得熒光素-多糖復合物,該復合物按照步驟(1)中所述進行碘代反應,制得碘代多糖或碘代糖脂;

(3)由步驟(1)或者(2)所制備的糖復合物的碘代產(chǎn)物,進行動物或細胞實驗,收集需測定的樣品,經(jīng)消化后,以ICP-MS測定樣品中碘的含量,根據(jù)樣品中碘的標記量,換算成各樣品中糖復合物的含量。

下面以銀耳糖蛋白為例對本發(fā)明測定方法的具體內(nèi)容進行詳細說明。由于無市售樣品可用,我們需自制銀耳糖蛋白,作為研究的樣品。

糖復合物包含糖蛋白、多糖和糖脂。糖蛋白均含有一定量的絡氨酸,可同碘直接發(fā)生取代反應;多糖和糖脂由于不含有可同碘直接發(fā)生反應的基團,需制成可同碘發(fā)生取代反應的衍生物后,與碘反應生成碘代衍生物。生成的碘代糖復合物,測定碘含量后,進行動物或細胞實驗,制備需要的生物樣品;經(jīng)消解后,以ICP-MS測定其中碘的含量,根據(jù)樣品中碘含量,計算樣品中糖復合物的含量。

一.碘代糖蛋白-的制備

1.銀耳糖蛋白的制備 我們以前的研究表明,采用適當?shù)姆椒?,可由銀耳制備銀耳糖蛋白,解決無合適商品試劑的問題。因此糖蛋白以銀耳多糖復合物為代表.制備方法為:取銀耳孢糖一公斤,加入5倍量純水,加溫至70℃,攪拌2小時,離心(3000rpm,10min.),收集上清液,減壓蒸發(fā)至700ml,攪拌下加無水乙醇4000ml,靜置過夜后離心,收集沉淀部分,冷凍干燥。粗制銀耳糖蛋白經(jīng)Sephadex G-100中壓凝膠柱層析,收集分子量1萬的部分,濃縮,凍干,得到銀耳糖蛋白。

2.銀耳糖蛋白樣品的分析 干燥后的樣品中總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)分別以苯酚-硫酸法、間羥二酚法、Lowery法測定,甘露糖、葡萄糖醛酸和牛血清白蛋白為標準品,結(jié)果表明其中總糖的含量為80.2%,糖醛酸含量為6.5%,蛋白質(zhì)含量為7.8%;分子量分布以HPGPC法測定,以系列右旋糖酐為分子量對照品,OHPAK-SB804HQ色譜柱,RID-10A檢測器,流動相為0.7%的硫酸鈉溶液,結(jié)果通過GPC軟件計算,銀耳多糖復合物的峰位分子量為10.23KDa;組成糖分析采用PMP衍生化法,根據(jù)各標準單糖和樣品衍生物的保留時間和峰面積,確定樣品中組成糖的種類和比例,結(jié)果表明,該多糖復合物中糖的部分由木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸以及葡萄糖組成;蛋白部分由精氨酸、絡氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等9種氨基酸組成。分析結(jié)果表明,制得的銀耳糖蛋白符合要求。

3.銀耳糖蛋白樣品的碘代 樣品500mg以5ml純水溶解,加入NaI溶液(0.5mol/L)3ml,充分混勻,加入氯胺T溶液(0.1g/ml)3ml,充分混勻后震蕩反應1min,加入偏重亞硫酸鈉3ml(0.1g/ml),混勻后加入碘化鉀5ml(0.1g/ml),充分混勻,離心(5000r/min,10min)后取上清,冷凍干燥,得碘代銀耳糖蛋白。

4.碘代銀耳糖蛋白的純化 碘代銀耳糖蛋白的分離純化在中壓凝膠色譜儀上進行。碘代銀耳糖蛋白200mg,以純水溶解后上樣到Sephadex G-50凝膠色譜柱(40cm x5cm),以水洗脫,收集洗脫液(10ml/管),根據(jù)該色譜柱的內(nèi)外水體積確定開始和結(jié)束收集時間。以苯酚-硫酸法測定各管中的糖含量,以糖含量為縱坐標,管數(shù)為橫坐標作圖,根據(jù)洗脫圖(見圖1),收集10-25管,濃縮、冷凍干燥,得到純化碘代銀耳糖蛋白。

5.碘代銀耳糖蛋白的分析

通過碘取代反應制得的碘代銀耳糖蛋白進行了光譜分析。紫外光譜表明,碘代前后其最大吸收均在234nm,未發(fā)生改變。紅外光譜表明,碘代前后發(fā)生了明顯改變,碘代后最大吸收為:3363、3267、1631、1527、1396、1303、1087、902、810、624、536cm-1,而碘代前,銀耳糖蛋白的最大吸收為:3309、2931、1462、1381、1319、1261、1084、1022、729、624cm-1,產(chǎn)生了明顯的鹵代烷烴峰(536cm-1),表明碘通過化學鍵連接到糖中。碘代銀耳糖蛋白通過ICP-MS測定其碘代率為0.55%,進一步表明,碘代反應成功。

6.碘代糖蛋白穩(wěn)定性研究

碘標記后的糖復合物在進行動物、細胞實驗時是否穩(wěn)定,以下述實驗進行了研究:

取碘代銀耳糖蛋白10mg,溶解在10ml細胞培養(yǎng)液()中,置于37C0恒溫振蕩,分別在1,2,3小時吸取2ml,通過Sephadex G-50進行凝膠柱層析(30cm X 1cm),水洗脫液以自動收集器收集(1ml/管),以ICP-MS隔管測定其中的碘含量,結(jié)果表明,碘代銀耳糖蛋白和經(jīng)培養(yǎng)1,2,3小時的碘代銀耳糖蛋白的層析曲線基本相同,在小分子量的流分(Ve)附近未檢測到游離的碘,表明碘代銀耳糖蛋白中的碘未發(fā)生裂解,碘代產(chǎn)物穩(wěn)定。

二.樣品的處理將碘代糖復合物樣品或凍干后的生物樣品粉碎,在頂空進樣瓶(10ML)內(nèi)準確稱取適量,加入4ml超純水潤濕后依次加入3ml TMAH和0.1ml H2O2,混勻,旋緊頂蓋,80℃下超聲破碎30min,定容至25ml。以0.45um濾膜過濾,濾液進行ICP-MS測定。

三.樣品的測定測定在電感耦合等離子體-質(zhì)譜(ICP-MS)(Agilent JL-713-IP001-YQ030)上進行.

ICP-MS設定的條件如下表:

表1 ICP-MS儀器的參考工作條件

四.測定結(jié)果

1方法檢出限和線性范圍

1%TMAH溶液作為溶劑,配制1mg/ml的NaI標準溶液,分別稀釋至5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml碘標準工作溶液。測得工作曲線(見圖2)的標準方程為y=0.0075×+0.0232,R=0.9996,線性范圍較寬。

2方法精密度

準確稱取0.05g碘代銀耳糖蛋白,樣品處理過程同前,重復測定10次,進行精密度實驗,實驗結(jié)果見下表(表2),從結(jié)果中可知,樣品測定的相對標準偏差(RSD)值為3.89%。

表2碘代銀耳糖蛋白精密度測定結(jié)果(n=10)

3方法重現(xiàn)性

準確稱取0.05g碘代銀耳糖蛋白,共6份,每份處理過程同,進行方法重現(xiàn)性實驗,實驗結(jié)果見表3,從結(jié)果中可知,樣品測定的相對標準偏差為4.5%。

表3碘代銀耳糖蛋白重現(xiàn)性測定結(jié)果

4方法穩(wěn)定性

50mg碘代銀耳糖蛋白樣品,消解后每隔兩小時測定一次,結(jié)果如表4。表明在8小時內(nèi)樣品穩(wěn)定。

表4碘代銀耳糖蛋白重現(xiàn)性測定結(jié)果

5.加標回收率

本方法以碘代銀耳糖蛋白為試樣進行回收率實驗,準確稱取碘代銀耳糖蛋白,以純水溶解,制成50mg/3.5ml溶液共6份,每份添加1mg/ml碘化鈉標準溶液0.5ml,處理過程同7,將濾液稀1000倍.實驗結(jié)果見表5,根據(jù)實驗結(jié)果計算,加標回收率在92%-101%之間,RSD值為5.16%。

表5碘代銀耳糖蛋白加標回收率測定結(jié)果

五.銀耳糖蛋白在生物樣品中的含量及分布

5.1生物樣品的制備方法

SD大鼠在適應環(huán)境3天后進行實驗。采血前禁食12h,自由飲水。本試驗以碘代銀耳糖蛋白為樣品,分為實驗組和空白對照組,每組3只大鼠,實驗組給予給碘代銀耳糖蛋白,空白組給予生理鹽水,給藥劑量為0.2g/只,給藥容量為12m L/只,灌胃給藥,取血方式為眼球取血和腹主動脈取血;1h取血點為大鼠左眼,2h取血點為大鼠右眼,3h取血點為大鼠腹主動脈,每只大鼠共3次取血,將血液0.5ml除最后稀釋10倍外,其他處理過程同前.取給藥3h后大鼠心、肝、脾、肺、腎分別真空冷凍干燥,稱重,研磨均勻,稱取樣品100mg,除最后濾液不必稀釋外,其他處理過程同前。

5.2實驗結(jié)果

5.2.1不同時間點大鼠血液中銀耳糖蛋白含量測定結(jié)果

一般情況下,大鼠的血容量占體重的7.4%,大鼠平均體重190g,故大鼠體內(nèi)全血量以12.6ml計算出一只大鼠全血中銀耳糖蛋白含量。由結(jié)果可見(表6),隨著給藥后時間的增加,吸收入血量也在增加,3小時后,將近5%的銀耳糖蛋白存在血液中。

表6不同時間點大鼠全血中銀耳多糖含量

5.2.2碘代銀耳糖蛋白給藥3小時后,在大鼠主要臟器中含量結(jié)果見表7;

表7大鼠內(nèi)臟中含有碘代銀耳糖蛋白的量

由測定結(jié)果可見,該方法靈敏度高,結(jié)果穩(wěn)定。

本發(fā)明將碘代多糖與ICP-MS檢測技術相結(jié)合,建立新的生物樣品中測定多糖含量的方法,為集成創(chuàng)新,具有實質(zhì)的突出特點和顯著的技術進步。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實施方案對本發(fā)明進一步說明。

圖1是碘代銀耳糖蛋白的分離純化洗脫圖;

圖2是方法檢出限和線性范圍曲線圖。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。但下述的實施例僅僅是本發(fā)明的簡易例子,并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護范圍,本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。

具體實施方式

為更好地說明本發(fā)明,便于理解本發(fā)明的技術方案,本發(fā)明的典型但非限制性的實施例如下。

實施例1銀耳糖蛋白的測定

其方法與結(jié)果與前述發(fā)明內(nèi)容中相同,在此不再贅述。

實施例2碘代多糖、糖脂的測定

天然產(chǎn)物中許多糖的復合物不含有絡氨酸,不能與碘直接發(fā)生取代反應。需要將它們首先與可同碘發(fā)生取代發(fā)生的基團連接,再進行碘的取代反應。

一、熒光素(FITC)標記多糖

熒光素可在堿性條件下與多糖中的發(fā)生取代反應,生成熒光素-多糖復合物。該復合物在生理條件下穩(wěn)定,是熒光標記多糖常用的方法。

1、多糖樣品

我們選擇杏鮑菇多糖(PEPI)作為樣品。PEPI為實驗室自制的均

一多糖,不含有蛋白。

2、熒光素標記PEPI

樣品(1g)溶解在10ml二甲基亞砜中,加10滴吡啶,加入FITC0.1g,再加入二月桂酸二丁基錫20mg,95℃混合加熱2h。加入無水乙醇50ML.放置,傾去上清,以乙醇反復清洗,洗去多余的染料,離心,得FITC-PEPI復合物。

3、碘代熒光素-PEPI和樣品的純化

熒光素-PEPI的碘取代反應方法同糖蛋白的碘代方法,在此不再贅述。

碘代多糖的純化方法同碘代銀耳糖蛋白的純化方法。測定方法同銀耳糖蛋白,在此不再贅述。

樣品的處理及樣品的測定均同銀耳多糖蛋白的方法,在此不再贅述。

二、杏鮑菇多糖在生物樣品中的含量及分布

1、生物樣品的制備方法

實驗分組和給藥劑量均同銀耳糖蛋白。

2、實驗結(jié)果

2.1不同時間點大鼠血液中杏鮑菇多糖含量測定結(jié)果

一般情況下,大鼠的血容量占體重的7.4%,大鼠平均體重190g,故大鼠體內(nèi)全血量以12.6ml計算出一只大鼠全血中銀耳糖蛋白含量。由結(jié)果可見(表8),1h時,杏鮑菇多糖在血液中的濃度達到高峰,隨著給藥后時間的增加,吸收入血量減少。

表8不同時間點大鼠全血中杏鮑菇多糖含量

2.2杏鮑菇多糖給藥3小時后,在大鼠主要臟器中含量結(jié)果見表9。

表9大鼠內(nèi)臟中含有碘代杏鮑菇多糖的量

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