本發(fā)明屬于化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
去甲基金霉素，別名地美環(huán)素、去甲基氯四環(huán)素、DMCT。本品抗菌譜與金霉素相似，其特點(diǎn)是作用比四環(huán)素、土霉素強(qiáng)，比金霉素穩(wěn)定。臨床用于肺炎、尿路感染、淋病、細(xì)菌性痢疾、布氏桿菌病及小兒猩紅熱等。去甲基金霉素抗菌活性較四環(huán)素強(qiáng)，吸收較好。是廣譜抗生素，起抑菌作用。其抗菌譜包括許多革蘭陽(yáng)性和陰性菌、立克次體、支原體、衣原體、放線(xiàn)菌等?，F(xiàn)主要用于立克次體病、布氏桿菌病、淋巴肉芽腫、支原體肺炎、螺旋體病、衣原體病，也可用于敏感的革蘭陽(yáng)性球菌或革蘭陰性桿菌所引起的輕癥感染。去甲基金霉素的結(jié)構(gòu)如下：目前去甲基金霉素發(fā)酵液的檢測(cè)方法使用的是分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，加入一定的三氯化鐵顯色劑后進(jìn)行測(cè)定，在檢測(cè)過(guò)程中處理麻煩，并且顯色時(shí)間長(zhǎng)，三氯化鐵本身性質(zhì)不穩(wěn)定。因此開(kāi)發(fā)一種能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)的方法一直是有待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種方法簡(jiǎn)便、快速，易于操作，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好的去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)的檢測(cè)方法。一種去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)的檢測(cè)方法，其特征在于采用高效液相色譜法對(duì)去甲基金霉素發(fā)酵液供試品進(jìn)行檢測(cè)，然后采用外標(biāo)法計(jì)算其效價(jià)。所述高效液相色譜法的色譜儀條件為：色譜柱：C18柱；檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器；流動(dòng)相：乙腈：0.5%磷酸溶液＝20-30：80-70；流速：0.80-1.20ml/min；進(jìn)樣量：10-20ul；檢測(cè)波長(zhǎng)：250-260nm。所述C18柱的規(guī)格為：長(zhǎng)度250mm或150mm，內(nèi)徑4.6mm，填料粒徑5um。所述去甲基金霉素發(fā)酵液先用0.15mol/L鹽酸溶液溶解后再配制成供試品。所述用鹽酸溶液溶解后的甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)在10-200u/ml。本發(fā)明采用高效液相色譜法對(duì)去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，其方法簡(jiǎn)便、快速，易于操作，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，當(dāng)甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)在10-200u/ml之間時(shí)，均有較好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.9991。附圖說(shuō)明圖1為去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)對(duì)照品的HPLC檢測(cè)圖譜；圖2為去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)的HPLC檢測(cè)圖譜；圖3為去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)的線(xiàn)性關(guān)系圖與回歸方程。具體實(shí)施方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方法對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1去甲基金霉素發(fā)酵液分析樣品的制備：標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：稱(chēng)取去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)對(duì)照品10mg，精密稱(chēng)定，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻。用注射器取溶液經(jīng)0.45um的有機(jī)濾頭過(guò)濾，得對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：稱(chēng)取去甲基金霉素發(fā)酵液1.0g，精密稱(chēng)定，置于100ml容量瓶中，加0.15mol/L的鹽酸溶液適量，溶解后定容至刻度，搖勻，放置10min后，過(guò)濾，初濾液棄去。用1ml注射器取溶液經(jīng)0.45um的有機(jī)濾頭過(guò)濾，得供試品溶液；標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各制得5份。色譜分析條件：島津LC-20A液相色譜儀，WatersC18色譜柱（250*4.6,5um）；流動(dòng)相：乙腈：0.5%磷酸溶液＝（20:80），流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：20ul；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。柱溫箱35℃。按上述色譜條件，對(duì)所有標(biāo)準(zhǔn)品和供試品分別進(jìn)樣，如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)品溶液5個(gè)樣品分別進(jìn)樣所得峰面積為2834815，RSD為0.12%；供試品溶液的5個(gè)樣品所得峰面積平均值為3898300，RSD為0.07%。根據(jù)公式：去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)：a=A樣*C標(biāo)/A標(biāo)M樣*nA樣:發(fā)酵液樣品的峰面積；A標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；C標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)（u/ml）；M樣:發(fā)酵液的質(zhì)量（g）；n:發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)。采用外標(biāo)法將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品平均代入即可得供試品去甲基金霉素的效價(jià)為11806u/g。本發(fā)明實(shí)施例1所述檢測(cè)方法的方法學(xué)考察：（1）精密度實(shí)驗(yàn)稱(chēng)取同一去甲基金霉素發(fā)酵液，進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，峰面積表1：表1去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)重復(fù)試驗(yàn)的面積次數(shù)123456峰面積389830038870603897068389518138865953869293峰面積RSD為0.28%，結(jié)果表明，本方法檢測(cè)去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)精密度高，重現(xiàn)性好。（2）線(xiàn)性關(guān)系考察根據(jù)發(fā)明所述方法，用50ml的容量瓶配制效價(jià)為1000u/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加純化水分別稀釋成效價(jià)濃度分別為10u/ml、20u/ml、50u/ml、100u/ml、150u/ml、200u/ml，按照本方法，對(duì)樣品濃度（X）和峰面積（Y）進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析，線(xiàn)性回歸方程為Y=30416X-78136，線(xiàn)性關(guān)系如圖3所示，R2=0.9991，結(jié)果表明去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)在10-200u/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積和濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。（3）加樣回收實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱(chēng)取已知含量的去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)適量，再分別精密加入一定量的去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)樣品80%，100%，120%，使供試品溶液中的去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)在去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的高、中、低區(qū)域各3份，按照本發(fā)明項(xiàng)下的操作，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.46%，RSD為0.58%，表明該方法加樣回收率好。綜上表明本發(fā)明所述含量檢測(cè)方法穩(wěn)定性好，精密度高，適合去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)的測(cè)定。實(shí)施例2樣品及標(biāo)準(zhǔn)品配制同實(shí)施例1。色譜分析條件：島津LC-20A液相色譜儀，WatersC18色譜柱（150*4.6,5um）；流動(dòng)相：乙腈：0.5%磷酸溶液＝（30:70），流速：0.9ml/min；進(jìn)樣量：20ul；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm。柱溫箱30℃。按上述色譜條件，對(duì)所有標(biāo)準(zhǔn)品和供試品分別進(jìn)樣，如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)品溶液5個(gè)樣品分別進(jìn)樣所得峰面積為2723203，RSD為0.25%；供試品溶液的5個(gè)樣品所得峰面積平均值為4006298，RSD為0.31%。根據(jù)公式：去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)：a=A樣*C標(biāo)/A標(biāo)M樣*n。采用外標(biāo)法將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品平均代入即可得供試品去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)為11109u/g。實(shí)施例3樣品及標(biāo)準(zhǔn)品配制同實(shí)施例1。色譜分析條件：WatersC18色譜柱（150*4.6,5um）；流動(dòng)相：乙腈：0.5%磷酸溶液＝（20:80），流速：0.8ml/min；進(jìn)樣量：20ul；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm。柱溫箱40℃。按上述色譜條件，對(duì)所有標(biāo)準(zhǔn)品和供試品分別進(jìn)樣，如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)品溶液5個(gè)樣品分別進(jìn)樣所得峰面積2972108為，RSD為0.32%；供試品溶液的5個(gè)樣品所得峰面積平均值為3930425，RSD為0.12%。根據(jù)公式：去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)：a=A樣*C標(biāo)/A標(biāo)M樣*n。采用外標(biāo)法將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品平均代入即可得供試品去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)為11711u/g。實(shí)施例4樣品及標(biāo)準(zhǔn)品配制同實(shí)施例1。色譜分析條件：島津LC-20A液相色譜儀，WatersC18色譜柱（250*4.6,5um）；流動(dòng)相：乙腈：0.5%磷酸溶液＝（20:80），流速：1.2ml/min；進(jìn)樣量：10ul；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm。柱溫箱40℃。按上述色譜條件，對(duì)所有標(biāo)準(zhǔn)品和供試品分別進(jìn)樣，如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)品溶液5個(gè)樣品分別進(jìn)樣所得峰面積2681747為，RSD為0.32%；供試品溶液的5個(gè)樣品所得峰面積平均值為4013300，RSD為0.28%。根據(jù)公式：去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)：a=A樣*C標(biāo)/A標(biāo)M樣*n。采用外標(biāo)法將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品平均代入即可得供試品去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)為11091u/g。上述參照具體實(shí)施方式對(duì)該一種去甲基金霉素發(fā)酵液效價(jià)的含量檢測(cè)方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說(shuō)明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例。因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。