生物工程菌株及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了生物工程菌株及其制備方法和用途，所述生物工程菌株衍生自假單胞菌株M18G，相對(duì)于所述假單胞菌株M18G，所述生物工程菌株的基因組缺失吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5’-非編碼區(qū)。本發(fā)明的生物工程菌株合成吩嗪-1-羧酸的效率高，發(fā)酵效價(jià)穩(wěn)定，且不需要異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的誘導(dǎo)，生產(chǎn)成本低，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】生物工程菌株及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物源農(nóng)藥生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種改進(jìn)的用于生產(chǎn)新型微生 物源殺菌劑的工程菌株的制備及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及生物工程菌株、制備生物工程 菌株的方法、生物工程菌株在制備吩嗪-1羧酸中的用途以及制備吩嗪-1-羧酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物農(nóng)藥促生拮抗菌M18,屬于一種產(chǎn)熒光的假單胞菌，對(duì)植物病害具有高效、安 全、廣譜的殺菌作用，易于在環(huán)境中解體，與環(huán)境相容性好。該促生拮抗菌M18已于2000年6 月27日在中國(guó)專利局指定的保藏單位：北京，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO. 0462。生物農(nóng)藥促生拮抗菌M18的制備和應(yīng)用，已經(jīng)獲得國(guó) 家發(fā)明專利，專利號(hào)為00119857. 2。但是，生物農(nóng)藥促生拮抗菌M18是一種活菌菌劑，其作 用機(jī)理主要是通過M18活菌合成抗植物病害的活性成分實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)作物植物病源菌的抑制 作用，其合成的活性成分含量容易受到菌體本身的代謝調(diào)控機(jī)制和環(huán)境條件的影響。因而， 對(duì)植物病害的防治效果具有不穩(wěn)定性的缺陷，難以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)行大規(guī)模的推廣應(yīng)用。
[0003] 已經(jīng)查明，屬于假單胞菌的促生拮抗菌M18菌株，其防治植物病害的主要活性成 分為之一為吩嗪-1-羧酸，從促生拮抗菌M18的發(fā)酵液中提取吩嗪-1-羧酸，利用活性成分 而不是活菌對(duì)農(nóng)作物病害的防治同樣具有高效、安全、廣譜、與環(huán)境相容性好等特征；同時(shí)， 能克服利用促生拮抗菌M18防治病害效果不穩(wěn)定的缺陷。但是，利用促生拮抗菌M18發(fā)酵 合成吩嗪-1-羧酸的效價(jià)很低，僅為每升200毫克左右，如何提高發(fā)酵效價(jià)，降低使用成本， 成為開發(fā)本產(chǎn)品的瓶頸所在。近年來，發(fā)明人運(yùn)用基因工程手段，對(duì)促生拮抗菌M18基因組 中的雙組分調(diào)控基因gacA開展了定向失活突變，獲得了 M18衍生菌株M18G，大大提高了吩 嗪-1-羧酸的產(chǎn)量，使其發(fā)酵效價(jià)達(dá)到每升1500-1700毫克左右。該研究成果的技術(shù)方法 已經(jīng)于2004年在《微生物學(xué)報(bào)》44卷第761?765頁公開，論文題目為《假單胞菌gacA插 入突變對(duì)藤黃綠菌素和吩嗪-1-羧酸合成代謝的差異性調(diào)控》。發(fā)明人利用M18衍生菌株 M18G攜帶重組質(zhì)粒pME6032Phz，構(gòu)建的基因工程菌株M18G/pME6032Phz，發(fā)明高效生產(chǎn)吩 嗪-1-羧酸的方法，大大提高了吩嗪-1-羧酸的發(fā)酵效價(jià)，使吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量達(dá)到每升 5700?6600毫克的水平，獲得了國(guó)家發(fā)明專利（申請(qǐng)?zhí)枮镃N200910198664. 2)。但是，利 用該技術(shù)生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸需要異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷的誘導(dǎo)，價(jià)格很高，提高 了成本，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)，由于攜帶的重組質(zhì)粒易于在發(fā)酵過程中丟失，會(huì)引起生 產(chǎn)的不穩(wěn)定性。
[0004] 因而，目前的用于生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的生物工程菌株仍有待改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種改進(jìn)的用于生產(chǎn)微生物 源殺菌劑吩嗪-1-羧酸的高效生物工程菌株及其應(yīng)用技術(shù)。
[0006] 因而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生物工程菌株，所述生物工程菌 株衍生自假單胞菌株M18G。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，相對(duì)于所述假單胞菌株M18G，所述生物 工程菌株的基因組缺失吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5' -非編碼區(qū)。
[0007] 需要說明的是，本發(fā)明所述的生物工程菌株，即一種改進(jìn)的用于生產(chǎn)微生物源殺 菌劑吩嗪-1-羧酸的高效生物工程菌株M18GU，其是通過運(yùn)用無縫拼接技術(shù)制備的。其 中，本發(fā)明所采用的表達(dá)方式"無縫拼接技術(shù)"是指一種DNA片段缺失技術(shù)。通常缺失DNA 片段的技術(shù)，都需要在缺失處插入一個(gè)編碼抗生素抗性的標(biāo)記基因作為篩選指標(biāo)，表明該 DNA區(qū)域已經(jīng)缺失，以區(qū)別野生型的未缺失DNA片段的菌株，本發(fā)明構(gòu)建的生物工程菌株 M18⑶，是通過缺失基因組中吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5'-非編碼區(qū)實(shí)現(xiàn)的。從理論上 講，在非編碼區(qū)插入了諸如標(biāo)記基因的其他序列后，將對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生難以預(yù)測(cè)的影響，因 而，不允許插入諸如標(biāo)記基因的其他序列。本發(fā)明采用的DNA片段缺失技術(shù)為一種無縫拼 接法，即通過DNA序列之間的兩次同源重組，所引起的抗藥性改變和蔗糖致死性的改變篩 選出突變菌株，在DNA片段缺失處不需要攜帶通常的選擇標(biāo)記，直接將缺失區(qū)兩端的DNA連 接，定向缺失M18衍生菌株M18G的基因組中吩嗪-1-羧酸合成基因簇（phzl)上游的5'-非 編碼區(qū)，構(gòu)建成基因突變菌株（M18GU)。由此，去除對(duì)吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzl表達(dá)的 抑制作用，從而，M18GU菌株合成吩嗪-1-羧酸的效率大大提高。
[0008] 其中，本發(fā)明所述的"M18"菌株為保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO. 0462的一種生物農(nóng)藥促生拮抗菌。假單胞菌株"M18G"為 M18(CGMCC NO. 0462)的衍生菌株，其制備方法已為公知，例如可參考發(fā)表于2004年的《微 生物學(xué)報(bào)》44卷第761?765頁的《假單胞菌gacA插入突變對(duì)藤黃綠菌素和吩嗪-1-羧酸 合成代謝的差異性調(diào)控》。相比M18, M18G的吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量獲得了很大的提升，而本 發(fā)明在此基礎(chǔ)上對(duì)假單胞菌株M18G進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，phzl基因簇上游5' -非編碼區(qū)可以為完整的或是部分的 5' -非編碼區(qū)，所述的5' -非編碼區(qū)在轉(zhuǎn)錄后形成的信使mRNA中，可形成一種二級(jí)結(jié)構(gòu)阻 止翻譯的正常進(jìn)行，從而抑制了吩嗪-1-羧酸的合成。優(yōu)選地，Phzl基因簇上游5' -非編 碼區(qū)含有翻譯起始密碼子上游第335位堿基始至其上游第31堿基至的多核苷酸片段。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述Phzl基因簇為銅綠假單胞菌的phzl。優(yōu)選的，所述的phzl基因 簇5' -端非編碼區(qū)來源于銅綠假單胞菌株？401、？47、1^3858、？47、？即&3^18。更優(yōu)選，所 述phzl基因簇上游5'-端非編碼區(qū)來源于假單胞菌株M18,其堿基序列如SEQ ID NO :1所 示：

【權(quán)利要求】
1. 一種生物工程菌株，所述生物工程菌株衍生自假單胞菌株M18G，其特征在于，相對(duì) 于所述假單胞菌株M18G，所述生物工程菌株的基因組缺失吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游 5' -非編碼區(qū)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物工程菌株，其特征在于，相對(duì)于所述假單胞菌株M18G，所 述生物工程菌株的基因組缺失SEQ ID NO :1所示的核酸序列。
3. -種制備生物工程菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 以假單胞菌株M18G基因組DNA為模板，分別利用第一引物和第二引物進(jìn)行第一 PCR 擴(kuò)增獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物，利用第三引物和第四引物進(jìn)行第二PCR擴(kuò)增獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物， 其中，所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物具有SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列，所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列； 2) 利用重疊基因擴(kuò)增技術(shù)，將所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物和所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接處理， 以便獲得連接產(chǎn)物，所述連接產(chǎn)物具有SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列； 3) 將所述連接產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和PstI酶切后，插入質(zhì)粒pK18mobsacB中，形成重組質(zhì)粒 PK18DU1 ； 4) 將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli S17-1，以便獲得重組大腸桿菌菌株； 5) 將所述重組大腸桿菌菌株與所述假單胞菌株M18G進(jìn)行雙親雜交，以便獲得生物工 程菌株M18⑶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一引物和第二引物分別具有SEQ ID NO :2-3所示的核苷酸序列，所述第三引物和第四引物分別具有SEQ ID NO :4-5所示核 苷酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，將所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物和所述第二擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行連接處理，進(jìn)一步包括： 將所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物和所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物混合，并利用DNA聚合酶LA Taq進(jìn)行第三 PCR擴(kuò)增，以便獲得第三擴(kuò)增產(chǎn)物； 利用第一引物和第四引物進(jìn)行第四PCR擴(kuò)增，以便獲得第四擴(kuò)增產(chǎn)物； 將所述第四擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，以便獲得所述連接產(chǎn)物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述第三PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C 3min; 95°C 30s，5(TC lmin，72°C lmin，10 個(gè)循環(huán)；72°C lmin， 所述第四PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3min ;95°C 30s，50°C lmin，72°C lmin，25個(gè)循 環(huán)；72°C lmin。
7. 權(quán)利要求1或2所述的生物工程菌株在制備吩嗪-1羧酸中的用途。
8. -種制備吩嗪-1-羧酸的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將權(quán)利要求1或2所述的生物工程菌株進(jìn)行活化，其中，所述生物工程菌株是通過權(quán)利 要求3-6任一項(xiàng)所述的方法制備獲得的；以及 將活化的生物工程菌株進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)，以便獲得含吩嗪-1-羧酸的發(fā)酵液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述活化進(jìn)一步包括： 將所述生物工程菌株接種于甘油培養(yǎng)基平板，在26-30°C下，活化生長(zhǎng)20-24小時(shí)；以 及 在所述甘油培養(yǎng)基平板上劃菌塊，于26-30°C下活化10-12小時(shí)， 其中，所述甘油培養(yǎng)基中各組分的重量百分比為：蛋白胨1. 8-2. 2%，甘油1. 3-1. 7%、 硫酸鎂 〇· 05-0. 10%、磷酸二氫鉀 0· 01-0. 05%、瓊脂 L 2-L 5%、余量為水，ρΗ6· 8-7. 2。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述種子擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)一步包括： 將所述活化的生物工程菌株，轉(zhuǎn)接到含有25毫升甘油培養(yǎng)液、體積為250毫升的三角 瓶中，在26-28°C的搖床中振蕩培養(yǎng)11小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為160-180轉(zhuǎn)/分；以及 然后，轉(zhuǎn)接到含有65毫升的產(chǎn)素培養(yǎng)液、體積為500毫升的三角瓶中，進(jìn)行放大發(fā)酵培 養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為72小時(shí)， 其中，所述甘油培養(yǎng)液中各組分的重量百分比為：蛋白胨1. 8-2. 2%、甘油1. 3-1. 7%、 硫酸鎂 〇· 05-0. 10%、磷酸二氫鉀 0· 01-0. 05%、余量為水，ρΗ6· 8-7. 2， 所述產(chǎn)素培養(yǎng)液中各組分的重量百分比為：黃豆粉6. 5-8. 0%、玉米漿1. 0-2. 0%、甘 油 L 0-2. 0%、葡萄糖 0· 5-L 5%、硝酸鉀 0· 8-L 8%、余量為水，ρΗ7· 5-8. 0。
【文檔編號(hào)】C12P17/12GK104293692SQ201410333085
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】許煜泉, 劉海明, 周泉, 周萬平 申請(qǐng)人:武漢漢申生物科技有限責(zé)任公司