本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)動(dòng)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳的快速銀染法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)牡蠣(crassostreagigas)是我國(guó)乃至世界上最重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一。雖然傳統(tǒng)選育工作已經(jīng)積極開展，但我國(guó)長(zhǎng)牡蠣的遺傳基礎(chǔ)仍然為野生型。缺乏良種、單產(chǎn)低等問題嚴(yán)重影響長(zhǎng)牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，亟需培育出產(chǎn)量高、品質(zhì)好的長(zhǎng)牡蠣優(yōu)良品種，保證長(zhǎng)牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇育種和種群多樣性研究成為一種有效的方法，為優(yōu)良品種的快速培育提供了技術(shù)保障。目前，結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，培育出生長(zhǎng)快、品質(zhì)好的新品種對(duì)于實(shí)現(xiàn)牡蠣養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
微衛(wèi)星標(biāo)記是一種共顯性的分子標(biāo)記，具有變異程度高，在基因組中分布廣泛，符合孟德爾遺傳，易于pcr擴(kuò)增等特點(diǎn)，是最常使用的分子標(biāo)記之一，已成功應(yīng)用在水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳育種等領(lǐng)域。微衛(wèi)星標(biāo)記作為分子遺傳學(xué)研究的有利手段，為長(zhǎng)牡蠣遺傳多樣性監(jiān)測(cè)、家系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及qtl定位等研究提供了有力工具。
聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱為page）是以聚丙烯酰胺凝膠作為介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，其結(jié)合銀染法進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)，是分子生物學(xué)和基因工程研究上不可缺少的實(shí)驗(yàn)技術(shù)?；阢y染法的聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測(cè)靈敏度和分辨率都比較高，特別適合于微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。微衛(wèi)星標(biāo)記的傳統(tǒng)分析方法是對(duì)每個(gè)標(biāo)記的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在變性或者非變性的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然后利用銀染的方式對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行顯色，進(jìn)而獲得所需要的目的條帶。銀染的原理是首先用固定劑將核酸分子固定到凝膠上，然后使銀染劑中的銀離子與之牢固結(jié)合，再通過還原劑將銀離子還原，從而發(fā)生銀棕色顯色反應(yīng)。然而，聚丙烯酰胺凝膠銀染的常規(guī)方法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，染色方法的改良可以更加行之有效、簡(jiǎn)便快捷的應(yīng)用于長(zhǎng)牡蠣微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠銀染法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)的缺陷，對(duì)染色方法的改進(jìn)可以節(jié)約時(shí)間并降低成本。
本發(fā)明具體的技術(shù)方案如下：
1、電泳完成后，將凝膠放入染色液中進(jìn)行染色；
2、將凝膠從染色液中取出，用去離子水沖洗干凈；
3、將凝膠放入顯影液中；
4、將顯影完成的凝膠沖洗干凈；
5、烘干讀數(shù)。
本發(fā)明有下述幾方面優(yōu)點(diǎn)：
將傳統(tǒng)方法的固定、三次沖洗、染色、顯影、定影、沖洗等6個(gè)步驟縮減為四個(gè)步驟，相比于傳統(tǒng)方法所需要的1小時(shí)30分鐘縮減為10分鐘之內(nèi)，而且染色液和顯影液均可重復(fù)利用3次。
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
附圖說明：
圖1顯示為長(zhǎng)牡蠣微衛(wèi)星標(biāo)記快速銀染法的顯色效果。
實(shí)施例1：
（1）使用苯酚氯仿法提取長(zhǎng)牡蠣的dna。
（2）用常規(guī)的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)
pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃變性45s，退火45s（不同引物退火溫度不同），72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10s，12℃保存。
（3）取pcr產(chǎn)物加等體積變性劑進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。
（4）聚丙烯酰氨凝膠的銀染
聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)束后，取下凝膠，浸泡在染液（0.2%硝酸銀，0.5%醋酸）中3min；將凝膠放入蒸餾水中沖洗10s；隨后取出凝膠放入顯影液（1%氫氧化鈉，0.4%甲醛）中4min，顯色完成。最后，將凝膠放入蒸餾水中沖洗干凈（2min），晾干讀帶。染液與顯影液均可重復(fù)使用3次。
通過該銀染方法來處理聚丙烯酰胺凝膠，具有條帶顯色良好，條帶清晰，操作時(shí)間短且程序簡(jiǎn)單，染色液及顯影液容易保存等優(yōu)點(diǎn)，是一種及其為理想的染色放大。本發(fā)明的銀染過程可在10min內(nèi)完成，且染色液與顯影液均可使用3次，顯著提高了實(shí)驗(yàn)效率，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。