利用ssr分子標記鑒定杏品種的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用SSR分子標記鑒定杏品種的方法，本發(fā)明首先利用生物學特征差別較大的5個杏品種進行了大量引物的篩選，從190對SSR引物中篩選出38對多態(tài)性好、主帶清晰的引物進行樣品的聚丙烯酰胺凝膠分析，最后又從6％聚丙烯酰氨凝膠電泳膠圖中選出特異帶清晰、非特異帶少、多態(tài)性高的10個SSR標記的圖譜進行讀帶分析。通過對讀帶數(shù)據(jù)的分析，最終篩選出鑒別效率最高的一個引物組合，由3對引物組成(PSSR1、PSSR2和PSSR3，引物序列如Seq?ID?No.1-6所示)，可將124個杏品種一一區(qū)別開來。本發(fā)明的利用SSR分子標記鑒定杏品種的方法具有快速、準確、低成本、操作簡單、節(jié)約人力、物力及土地資源等優(yōu)點，具有十分廣闊的應用前景。
【專利說明】利用SSR分子標記鑒定杏品種的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及一種利用SSR分子標記鑒定杏品種 的方法。

【背景技術】
[0002] 杏原產(chǎn)于中國，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國已有2000余個品種和類型，近幾年又育成和 引進許多新品種。由于品種對不同產(chǎn)區(qū)的適應性和市場對品種多樣性的需求，不同產(chǎn)地也 就形成了不同的主栽品種。杏品種間在植物學形態(tài)上差異較小，有許多品種必須靠果實性 狀才能進行鑒別，而杏樹定植后3?4年才能結果，這大大限制了生產(chǎn)上對優(yōu)良品種的準確 有效地選擇，進而影響優(yōu)良品種的增產(chǎn)潛力。
[0003] 分子標記技術的發(fā)展，為品種的早期鑒定提供了可能。SSR(Simple Sequence R印eats)分子標記具有數(shù)量豐、分布于整個基因組、等位變異高、共顯性、檢測簡單、結果穩(wěn) 定可靠等優(yōu)點。目前，杏（Prunus armeniaca L.)植物材料中也開發(fā)了一些SSR引物，并已 應用于遺傳多樣性、品種進化分析和遺傳圖譜的構建等方面，但利用SSR標記構建杏品種 指紋圖譜和品種鑒定的研究還未見報道。
[0004] 選擇合適的SSR引物是該項工作得以順利開展的前提和關鍵之一。從理論上講， 任一 SSR標記都可進行杏種質鑒定，但在實際操作中，有一些SSR引物不夠穩(wěn)定，容易出現(xiàn) 雜帶或擴增效果差。因此，開發(fā)合適的用于杏品種鑒定的SSR分子標記成為亟待解決的問 題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用SSR分子標記鑒定杏品種的方法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先利用生物學特征差別較大的5個杏品種進行了 大量引物的篩選，從已發(fā)表的在桃、杏、櫻桃等核果類果樹材料上開發(fā)出的190對SSR引物 中篩選出38對多態(tài)性好、主帶清晰的引物對樣品進行PCR擴增，再對擴增產(chǎn)物進行聚丙烯 酰胺凝膠分析，最后又從6%聚丙烯酰氨凝膠電泳膠圖中選出特異帶清晰、非特異帶少、多 態(tài)性高的10個SSR標記的圖譜進行讀帶分析。通過對讀帶數(shù)據(jù)的分析，最終篩選出鑒別 效率最高的一個引物組合，由3對引物組成（PSSR1、PSSR2和PSSR3,引物序列如Seq ID No. 1-6所示），可將124個杏品種--區(qū)別開來。
[0007] 杏品種SSR分子標記PSSR1，用于PCR擴增分子標記PSSR1的引物對為：
[0008] 上游引物 PSSR1F :5' -CAGAGTGCCCTCAGAGATTTG-3' 和
[0009] 下游引物 PSSR1R :5' -TCCGTCGTCTTCACTGATTT-3'。
[0010] 杏品種SSR分子標記PSSR2,用于PCR擴增分子標記PSSR2的引物對為：
[0011] 上游引物 PSSR2F : 5' -CATGAACAGGGTCAAAAGCA-3' 和
[0012] 下游引物 PSSR2R :5' -TATATCCTTACGCGGCCTCA-3'。
[0013] 杏品種SSR分子標記PSSR3,用于PCR擴增分子標記PSSR3的引物對為：
[0014] 上游引物 PSSR3F :5' -CTGCTCTCACTCAACTCAATGC-3' 和
[0015] 下游引物 PSSR3R :5, -CTCCCCTACCCCTCTGTATCTC-3'。
[0016] 本發(fā)明還提供所述分子標記在杏品種鑒定、植物材料遺傳多樣性分析、指紋圖譜 構建及分子標記輔助育種中的應用。
[0017] 本發(fā)明還提供一種利用SSR分子標記鑒定杏品種的方法，包括以下步驟：
[0018] 1)提取待測植物的基因組DNA ;
[0019] 2)以待測植物的基因組DNA為模板，分別利用權利要求1所述的用于PCR擴增分 子標記PSSR1的引物對、權利要求2所述的用于PCR擴增分子標記PSSR2的引物對以及權 利要求3所述的用于PCR擴增分子標記PSSR3的引物對進行PCR擴增；
[0020] 3)檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0021] 其中沖〇?反應體系按2(^1^計為：1(^111〇1/1上、下游引物各0.4 4 1^5"4 1^丁&9 DNA 聚合酶 0· 2 μ L，10mmol/L dNTPsO. 4 μ L，25mmol/L Mg2+1. 6 μ L，40ng/ μ L 模板 3 μ L， 10 X PCR反應緩沖液2 μ L，用ddH20補足至20 μ L。
[0022] PCR擴增程序為：94°C預變性3min ;94°C變性45s，55?58°C退火30s，72°C延伸 45s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸8min，保存于15°C。
[0023] 本發(fā)明還提供用于鑒定杏品種的引物組合，所述引物組合包括上述用于PCR擴增 分子標記PSSR1的引物對、用于PCR擴增分子標記PSSR2的引物對以及用于PCR擴增分子 標記PSSR3的引物對。
[0024] 本發(fā)明進一步提供含有上述引物組合的用于鑒定杏品種的試劑盒。所述試劑盒還 包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液及標準陽性模板等中的至少一種。
[0025] 本發(fā)明利用上述擴增SSR分子標記的引物組合，首次建立了我國主栽優(yōu)良杏品種 的指紋圖譜庫，可用來對杏優(yōu)良品種在種子或幼苗期進行早期鑒定，保證品種的真實性和 純度，從而較好地維護生產(chǎn)者和育種者的利益，并為我國杏種質資源和新品種的有效保護 提供技術支撐。即可以利用該引物組合對未知杏品種進行鑒定；也可以對單靠表觀性狀無 法準確鑒定的杏品種進行鑒定。本發(fā)明的利用SSR分子標記鑒定杏品種的方法具有快速、 準確、低成本、操作簡單、節(jié)約人力、物力及土地資源等優(yōu)點，具有十分廣闊的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為利用本發(fā)明的3對SSR引物對130個杏品種基因組擴增結果的聚丙烯酰胺 凝膠電泳圖；其中，A為用于PCR擴增分子標記PSSR1的引物對，B為用于PCR擴增分子標 記PSSR2的引物對，C為用于PCR擴增分子標記PSSR3的引物對。

【具體實施方式】
[0027] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0028] 實施例1杏品種SSR分子標記PSSR1、PSSR2和PSSR3的獲得
[0029] 首先利用生物學特征差別較大的5個杏品種（大優(yōu)佳、龍王帽、東寧2號、青密沙、 紅荷包）進行了大量引物的篩選，從已發(fā)表的在桃、杏、櫻桃等核果類果樹材料上開發(fā)出的 190對SSR引物中篩選出38對多態(tài)性好、主帶清晰的引物對樣品進行PCR擴增，再對擴增產(chǎn) 物進行聚丙烯酰胺凝膠分析，最后從6%聚丙烯酰氨凝膠電泳膠圖中選出特異帶清晰、非特 異帶少、多態(tài)性高的10個SSR標記的圖譜進行讀帶分析。通過對讀帶數(shù)據(jù)的分析，最終篩 選出鑒別效率最高的引物組合，由3對引物組成（PSSRUPSSR2和PSSR3)，可將124個杏品 種一一區(qū)別開來。用于PCR擴增分子標記PSSR1的引物對為：
[0030] 上游引物 PSSR1F :5' -CAGAGTGCCCTCAGAGATTTG-3' 和
[0031] 下游引物 PSSR1R :5' -TCCGTCGTCTTCACTGATTT-3'。
[0032] 用于PCR擴增分子標記PSSR2的引物對為：
[0033] 上游引物 PSSR2F : 5' -CATGAACAGGGTCAAAAGCA-3' 和
[0034] 下游引物 PSSR2R :5, -TATATCCTTACGCGGCCTCA-3,。
[0035] 用于PCR擴增分子標記PSSR3的引物對為：
[0036] 上游引物 PSSR3F :5' -CTGCTCTCACTCAACTCAATGC-3' 和
[0037] 下游引物 PSSR3R :5' -CTCCCCTACCCCTCTGTATCTC-3'。
[0038] 實施例2利用分子標記PSSR1、PSSR2和PSSR3進行杏品種鑒定
[0039] 1材料與方法
[0040] 1. 1供試材料：供試杏品種共130份，均為生產(chǎn)中常見的優(yōu)良品種，葉片材料取自 北京市農(nóng)林科學院林業(yè)果樹研究所杏資源圃。
[0041] 1. 2DNA的提?。翰捎酶牧糃TAB法提取葉片基因組DNA。
[0042] 1.3PCR 擴增：
[0043] PCR 反應體系（20μ L) :10ymol/L 上、下游引物各 0· 4μ L，5U/y L Taq DNA 聚合 酶 0· 2 μ L，10mmol/L dNTPsO. 4 μ L，25mmol/L Mg2+1. 6 μ L，40ng/ μ L 模板 3 μ L，10 X PCR 反 應緩沖液2 μ L，用ddH20補足至20 μ L。
[0044] PCR擴增程序為：94°C預變性3min ;94°C變性45s，55?58°C退火30s，72°C延伸 45s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸8min，保存于15°C。
[0045] PCR 儀為 MyCycler? PTC-200 (Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)。
[0046] 1. 4電泳檢測
[0047] PCR反應產(chǎn)物在6%變性聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，50w恒功率電泳90min，常規(guī)銀 染技術進行顯色反應。為了減小讀帶的人為誤差，以提高試驗的準確性，電泳時嚴格控制電 泳時間和電壓。
[0048] 1. 5數(shù)據(jù)賦值及數(shù)據(jù)庫建立
[0049] 根據(jù)每個杏DNA樣品的電泳條帶結果進行賦值，對肉眼可辨且清晰的電泳條帶進 行統(tǒng)計，同一位置有帶賦值為1，無帶賦值為0。將SSR圖譜轉換為由1和0組成的字符串， 即構成數(shù)字指紋。
[0050] 將3對SSR引物產(chǎn)生的33個多態(tài)位點（每對引物有11個等位基因）依次排序 (表1)，建立品種計算機化的DNA指紋，以區(qū)分供試的每個杏品種（表2)。
[0051] 表1 3對SSR引物擴增的33個多態(tài)性位點
[0052]

【權利要求】
1. 杏品種SSR分子標記PSSR1，其特征在于，用于PCR擴增分子標記PSSR1的引物對 為： 上游引物 PSSR1F :5' -CAGAGTGCCCTCAGAGATTTG-3' 和 下游引物 PSSR1R :5' -TCCGTCGTCTTCACTGATTT-3'。
2. 杏品種SSR分子標記PSSR2,其特征在于，用于PCR擴增分子標記PSSR2的引物對 為： 上游引物 PSSR2F :5' -CATGAACAGGGTCAAAAGCA-3' 和 下游引物 PSSR2R :5' -TATATCCTTACGCGGCCTCA-3'。
3. 杏品種SSR分子標記PSSR3,其特征在于，用于PCR擴增分子標記PSSR3的引物對 為： 上游引物 PSSR3F :5' -CTGCTCTCACTCAACTCAATGC-3' 和 下游引物 PSSR3R :5' -CTCCCCTACCCCTCTGTATCTC-3'。
4. 權利要求1-3任一項所述分子標記在杏品種鑒定、植物材料遺傳多樣性分析、指紋 圖譜構建及分子標記輔助育種中的應用。
5. -種利用SSR分子標記鑒定杏品種的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測植物的基因組DNA ; 2) 以待測植物的基因組DNA為模板，分別利用權利要求1所述的用于PCR擴增分子標 記PSSR1的引物對、權利要求2所述的用于PCR擴增分子標記PSSR2的引物對以及權利要 求3所述的用于PCR擴增分子標記PSSR3的引物對進行PCR擴增； 3) 檢測PCR擴增產(chǎn)物。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR反應體系按20 μ L計為： 1(^111〇1/1上、下游引物各0.4 4 1^，5"4 1^丁&9 0嫩聚合酶0.2 4 1^，10111111〇1/1(1見1380.4 4 1^， 25臟〇1/1]\%2+1.64 1^，40叩/^1^模板34 1^，10\?0?反應緩沖液24 1^，用（1(1!120補足至 20 μ L〇
7. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR擴增程序為：94°C預變性 3min ;94°C變性45s，55?58°C退火30s，72°C延伸45s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸8min， 保存于15°C。
8. 用于鑒定杏品種的引物組合，其特征在于，所述引物組合包括權利要求1所述的用 于PCR擴增分子標記PSSR1的引物對、權利要求2所述的用于PCR擴增分子標記PSSR2的 引物對以及權利要求3所述的用于PCR擴增分子標記PSSR3的引物對。
9. 含有權利要求8所述引物組合的用于鑒定杏品種的試劑盒。
10. 根據(jù)權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液及標準陽性模板中的至少一種。
【文檔編號】C12N15/11GK104099414SQ201410272735
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權日:2014年6月18日
【發(fā)明者】王玉柱, 張俊環(huán), 姜鳳超, 孫浩元, 楊麗 申請人:北京市農(nóng)林科學院林業(yè)果樹研究所