一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物、制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物、制備方法及其作為基因載體的應(yīng)用。系通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合以及后續(xù)脫保護(hù)反應(yīng)合成了側(cè)基為氨基的甲基丙烯酰胺陽離子功能聚合物，隨后，將含保護(hù)基的精氨酸以及乳糖酸砌塊聯(lián)接到聚甲基丙烯酰胺分子上，最后脫除保護(hù)基后即得到目標(biāo)聚合物，其制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和。細(xì)胞評價結(jié)果表明，本發(fā)明中制備的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物具有高生物相容性、低細(xì)胞毒性、高基因轉(zhuǎn)染效率、良好的血清穩(wěn)定性，是一類有效的新型糖基修飾聚合物非病毒基因載體，可作為高效的基因轉(zhuǎn)染試劑得到應(yīng)用。
【專利說明】一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物、制備方法及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物功能材料領(lǐng)域。具體涉及到側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的 聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物、制備方法及其作為生物功能載體材料的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 研制高效、低毒的新型陽離子聚合物載體材料已經(jīng)成為了目前生物功能材料及轉(zhuǎn) 染試劑相關(guān)領(lǐng)域研究的主要方向之一。近來發(fā)現(xiàn)，許多陽離子聚合物作為基因載體的轉(zhuǎn) 染效率相對較低是因其在細(xì)胞內(nèi)輸送過程中需要跨越一些膜性細(xì)胞器（如細(xì)胞膜和核膜 等），而跨膜能力較低，因而增強(qiáng)陽離子聚合物基因載體的跨膜能力將是提高其基因轉(zhuǎn)染效 率的可能方法之一。目前在天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一些富含精氨酸殘基的多肽，如Tat肽、核定位 (NLS)肽、肽核酸、糖基化多肽，以及合成的寡聚精氨酸多肽等具有較強(qiáng)的跨膜能力，相關(guān)研 究表明精氨酸殘基的存在對其穿膜能力起著至關(guān)重要的作用。因此，設(shè)計合成將天然精氨 酸片段化學(xué)偶聯(lián)至陽離子聚合物基因載體材料中進(jìn)行改性，將可能提高其與基因的相互作 用及載體/基因復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞能力，進(jìn)而實現(xiàn)提高基因轉(zhuǎn)染效率的目的。在本發(fā)明的 前期工作中，已經(jīng)開發(fā)了一系列側(cè)基精氨酸修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物作為基因 載體（Biomaterials2013, 34, 7923 ;中國專利申請?zhí)?01310325795. 9)，發(fā)現(xiàn)天然精氨酸結(jié) 構(gòu)的修飾及修飾率對提高載體的轉(zhuǎn)染效率具有重要影響，然而，該體系在細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染 效率方面還有待進(jìn)一步改善。
[0003] 另一方面，糖類化合物是一類重要的生物活性物質(zhì)，其具有良好的生物相容性和 可降解性，不僅是生物體能量的來源，同時在生物體構(gòu)建、物質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多的生 理過程中發(fā)揮著極其重要的作用。目前，糖類化合物已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，一些自 然界中廣泛存在的多糖，如幾丁質(zhì)（chitin)、殼聚糖（chitosan)、纖維素（cellulose)、淀 粉（starch)、糊精（dextran)等被大量應(yīng)用于制備生物材料。此外，一些特定結(jié)構(gòu)的小分 子糖類化合物具有細(xì)胞膜識別、介導(dǎo)細(xì)胞黏附以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能，被作為 修飾基團(tuán)引入生物材料中進(jìn)行功能化改性，從而達(dá)到提高材料的生物相容性及實現(xiàn)特定生 物功能的目的。近年來研究發(fā)現(xiàn)將一些小分子的糖類物質(zhì)（如山梨醇、甘露糖、葡萄糖酸、 乳糖酸等）作為結(jié)構(gòu)砌塊，與線性或枝化結(jié)構(gòu)的PEI分子偶聯(lián)后作為基因載體輸送DNA或 siRNA，能夠進(jìn)一步提高載體的生物相容性，其原因可能是由于引入的多羥基糖分子砌塊導(dǎo) 致載體表面陽離子電荷密度降低，從而降低了對細(xì)胞膜的破壞能力所致。而且經(jīng)上述糖類 物質(zhì)修飾后的載體可獲得大大優(yōu)于未經(jīng)修飾載體的基因轉(zhuǎn)染效率，這可能與引入的多羥基 糖分子砌塊具有較高滲透性導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)吞效率提高相關(guān)。因此，合理的設(shè)計糖類分子砌 塊引入到相關(guān)的陽尚子聚合物基因載體材料中，實現(xiàn)商效基因表達(dá)從而提商其轉(zhuǎn)染效率， 同時又能降低載體細(xì)胞毒性，將是解決轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞毒性的有效方法，也是研發(fā)高性能 基因輸送生物材料的可行性方向。
[0004] 進(jìn)一步的，通過發(fā)展反應(yīng)條件溫和、可控的聚合反應(yīng)及化學(xué)修飾技術(shù)得到分子量 可控、分子量分布窄、結(jié)構(gòu)明確的糖基修飾聚合物，有利于研究載體結(jié)構(gòu)與其性能之間的關(guān) 系，也可為進(jìn)一步從結(jié)構(gòu)上優(yōu)化載體材料提供參考。因此，在上述的相關(guān)基礎(chǔ)上，本發(fā)明擬 設(shè)計開發(fā)一類具有規(guī)整可控分子骨架的陽離子聚合物，其結(jié)構(gòu)中同時包含可提高載體/DNA 復(fù)合物的非特異性胞吞能力的精氨酸陽離子片段，以及具有良好生物相容性并可提高表面 滲透壓的乳糖酸片段，進(jìn)一步將其發(fā)展成為一系列新型的高效、低毒的基因載體。在此基礎(chǔ) 上，發(fā)展溫和、高效、易操作的化學(xué)偶聯(lián)和修飾方法，為發(fā)展安全、高效的基因治療提供性能 優(yōu)良的新型生物材料。這也是本發(fā)明所致力的目標(biāo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙 烯酰胺陽離子聚合物。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙 烯酰胺陽離子聚合物的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之三是提供一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯 酰胺陽離子聚合物作為基因載體材料的用途。
[0008] 本發(fā)明所提供的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離 子聚合物，可由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式（I)表示：
[0009]

【權(quán)利要求】
1. 一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物，可由以下 化學(xué)結(jié)構(gòu)式（I)表不：
上式（I)中，η表示甲基丙烯酰胺聚合物主鏈的聚合度，其取值范圍為5?400,優(yōu)選 5?200 ;Χ表示側(cè)基天然精氨酸修飾的聚甲基丙烯酰胺共聚單元的聚合度，其取值范圍為 5?400,優(yōu)選5?200 ;y表示側(cè)基乳糖酸修飾的聚甲基丙烯酰胺共聚單元的聚合度，其取 值范圍為5?200,優(yōu)選5?100 表示陰離子反離子，具體包括氯離子、三氟甲磺酸根離 子或三氟乙酸根離子TFA'
2. 如權(quán)利要求1所述的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽 離子聚合物，其特征是所述的η為5?200 ;所述的X為5?200 ;所述的y為5?100。
3. 如權(quán)利要求1所述的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽 離子聚合物的制備方法，其特征是通過下列步驟進(jìn)行： 第一步：將端氨基Boc保護(hù)的己二胺基甲基丙烯酰胺功能單體 偶氮二異丁腈AIBN自由基聚合引發(fā)劑、RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑十二烷基三硫代碳酸-(4-氰基戊 酸）酯依次按摩爾比5?200:3:1溶于有機(jī)溶劑中，于25?120°C下反應(yīng)4?48h ;然后濃 縮反應(yīng)溶液，將濃縮液在冰乙醚中沉淀除去未反應(yīng)殘留單體，所得沉淀經(jīng)過濾干燥，得到側(cè) 基為Boc保護(hù)的己氨基的甲基丙烯酰胺聚合物，其數(shù)均分子量為1500?11萬，隨后上述 聚合物加過量酸脫除Boc保護(hù)基，在0?50°C下反應(yīng)1?3h，最終制備得到側(cè)基為己氨基 的甲基丙烯酰胺陽離子功能聚合物，其結(jié)構(gòu)式如下（II )所示：
上式（II )中，A'n同權(quán)利要求1或2; 第二步：在有機(jī)溶劑中和〇?50°C溫度下，叔丁氧羰基-Νω-(2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氫 苯并呋喃-5-磺酰基）-L-精氨酸Boc-Arg(Pbf)-0Η、乳糖酸、苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四 甲基脲六氟磷酸酯HBTU、二異丙基乙基胺DIPEA按設(shè)定的摩爾比（1.0:0. 1?0.3:0.8? 2. 5:1. 0?3. 0)反應(yīng)10?60min ;然后加入第一步中的產(chǎn)物側(cè)基為己氨基的甲基丙烯酰胺 陽離子功能聚合物，在〇?50°C下反應(yīng)12?120h，其后加入有機(jī)或無機(jī)酸在0?50°C下持 續(xù)反應(yīng)1?3h脫除精氨酸的保護(hù)基團(tuán)，得到如結(jié)構(gòu)式（I)所示產(chǎn)物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的合成制備，其特征是所述的有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯、四氫呋喃、1，4_二氧 六環(huán)、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、乙醚、乙腈、丙 酮、苯、甲苯或它們的混合溶劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物制備方法，其特征是所述步驟中使用的有機(jī)或無機(jī)酸是鹽酸、三氟甲磺酸或 三氟乙酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的制備方法，其特征是所述步驟一中的反應(yīng)溫度為15?50°C ;合成步驟二中 所述的反應(yīng)溫度為〇?30°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的制備方法，其特征是所述步驟一中的側(cè)基為Boc保護(hù)的己氨基的甲基丙 烯酰胺聚合物，其數(shù)均分子量為1500?5萬。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的制備方法，其特征是所述步驟一中的數(shù)均分子量是利用 1Η核磁共振1H NMR 譜圖中聚合物末端RAFT試劑的殘基上質(zhì)子的特征峰積分與聚合物側(cè)鏈上的特定基團(tuán)上質(zhì) 子的特征峰積分的比值計算出或者通過凝膠滲透色譜GPC來表征。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的制備方法，其特征是所述步驟二中的產(chǎn)物經(jīng)過減壓旋蒸除去溶劑，將粗產(chǎn) 物溶于水后過濾并在純水中透析12?72h，進(jìn)一步冷凍干燥的純化處理；純化后所得共聚 物的摩爾組成通過測定其1H核磁共振1HNMR譜圖，利用精氨酸和乳糖酸片段上的特定質(zhì)子 的特征峰積分與側(cè)基己氨基上特定質(zhì)子的特征峰積分的比值計算得到。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類側(cè)基天然精氨酸和乳糖酸協(xié)同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物作為血清穩(wěn)定性的生物功能載體材料的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/63GK104086685SQ201410272640
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】曹阿民, 李慧, 盛瑞隆, 羅挺, 孫景景 申請人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所