噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法，首先將噬菌體展示多肽與分析物共同競爭捕獲抗體的結合位點，然后環(huán)介導等溫擴增結合在捕獲抗體上的噬菌體，最后對免疫環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物進行分析及結果判定。本發(fā)明提供的方法利用噬菌體展示多肽，將免疫競爭和環(huán)介導等溫擴增結合，實現(xiàn)對不含有核酸的小分子化合物的環(huán)介導等溫擴增檢測。本發(fā)明靈敏度高、實用性強，不需要昂貴的精密儀器。
【專利說明】噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法，利 用噬菌體展示多肽，將免疫競爭和環(huán)介導等溫擴增結合，實現(xiàn)對不含有核酸的小分子化合 物的環(huán)介導等溫擴增檢測。

【背景技術】
[0002] 有機磷農(nóng)藥（Organophosphorus pesticide,簡稱0P)是一類廣泛用于防治病蟲害 的農(nóng)藥。由于其具有高毒性，所以在使用過程中也會使一些非靶標生物受到毒害。同時，隨 著人們對食品和環(huán)境安全的關注，建立一種高通量、靈敏的檢測方法對有機磷農(nóng)藥殘留的 防控有著重要的意義。
[0003] 環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是 2000 年由 日本科學家Notomi, T.首次在Nucleic Acids Research雜志上報道的一種新穎的恒溫核 酸擴增方法。環(huán)介導等溫擴增技術的特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異引物，利 用一條鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（63°C左右）保溫30-60分鐘，即可完成核酸擴增反 應。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，只需要恒溫 環(huán)境。不僅大大降低了檢測的費用，而且給檢測帶來極大方便。由于農(nóng)藥是不含核酸序列 的小分子化合物，所以該方法在農(nóng)藥等小分子化合物中的應用被忽略。
[0004] 噬菌體展示技術是1985年由Smith，G. P.首次在Science雜志上報道，已經(jīng)作為 一種強大的工具運用在不同的研究中，包括篩選抗體和酶的配體；篩選小分子的受體；抗 體工程等。其原理是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結 構基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽 或蛋白與外殼蛋白融合表達在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間 結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合。當噬菌體展示的多肽為隨機序列時為噬菌 體展示多肽庫，利用抗體對噬菌體展示多肽庫進行親和淘選，可篩選出能夠和抗體結合的 噬菌體展不多肽。由于篩選出的多肽連接在噬菌體外殼蛋白上，并且噬菌體自身含有核酸， 所以篩選出的多肽不需要與核酸模板連接，可直接被LAMP檢測。利用噬菌體展示多肽的特 點，建立有機磷農(nóng)藥免疫LAMP檢測方法。該發(fā)明為食品安全檢測、農(nóng)產(chǎn)品等的出入境檢測、 環(huán)境監(jiān)測部門的監(jiān)測提供有效的技術手段和檢測方法。對我國農(nóng)產(chǎn)品的可持續(xù)發(fā)展和食品 安全問題具有重要的現(xiàn)實意義和重要的社會、經(jīng)濟價值。目前國內(nèi)外尚未見有關免疫LAMP 方法在農(nóng)藥等其他小分子化合物上的應用報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種新穎、快速、靈敏和實用的噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴 增檢測法，利用噬菌體展示多肽，將免疫競爭和環(huán)介導等溫擴增結合，以實現(xiàn)對不含有核酸 的小分子化合物的環(huán)介導等溫擴增檢測。
[0006] 本發(fā)明提供的噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法，包括：
[0007] 第一步：噬菌體展示多肽與分析物共同競爭捕獲抗體的結合位點，
[0008] 包被：用PBS緩沖液將抗體稀釋為10 μ g/mL后加入酶標板，每孔100 μ L，37°C孵 育2小時；洗板：用洗滌液PBST(0. 05 %吐溫20,0. Olmol/L，pH7. 4)洗滌5次，吸水紙拍 干；封閉：每孔加入3001^1%854,371：孵育1小時；洗板 ：用洗滌液？851'(0.05%吐溫20， 0. Olmol/L，pH7. 4)洗滌5次，吸水紙拍干；加入分析物和噬菌體：每孔加入50 μ L分析物， 再加入50 μ L的噬菌體，37°C孵育1小時；洗板：用洗滌液PBST (0. 05 %吐溫20，0. 0lmo 1/L， pH7. 4)洗滌5次，吸水紙拍干；洗脫：每孔加入100 μ L 0. 2M pH2. 2甘氨酸鹽酸緩沖液37°C 洗脫15分鐘，洗脫后收集洗脫液并用1ΜρΗ9. 1 Tris-HCl進行中和。
[0009] 第二步：環(huán)介導等溫擴增結合在捕獲抗體上的噬菌體，
[0010] 以FIP、BIP為內(nèi)引物，以F3、B3為外引物對洗脫的噬菌體進行恒溫擴增。其反應 體系為：〇· 64M betaine，ImM dNTPs，2. 5μ L lOXBst Buffer，8U Bst DNA 聚合酶，150μΜ 羥 基萘酚藍（hydroxynaphthol blue，HNB)，2μ L中和后的噬菌體洗脫液，外引物各0· 2μΜ，內(nèi) 引物各1. 2μΜ，(ΜΗ20補齊至25μ L。將上述所有試劑混勻置于PCR管中，63°C 60min，80°C 10min終止反應。 toon] 第三步：免疫環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物分析及結果判定，
[0012] 分析方法1 :瓊脂糖凝膠電泳：取3 μ L擴增產(chǎn)物，加入1 μ L上樣緩沖液（購自 TAKARA公司），混勻，在2% (W/V)瓊脂糖凝膠中101V下電泳1小時，用溴化乙錠（ΕΒ)染色 15min后，在凝膠成像系統(tǒng)上成像；
[0013] 分析方法2 :在日光下用肉眼觀察結果。
[0014] 結果判定：在分析方法1中，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察是否有梯形條帶，若 有條帶為陰性，若無條帶為陽性。在分析方法2中，若擴增產(chǎn)物的顏色變?yōu)樘焖{色則為陰 性，若保持深藍色不變?yōu)殛栃浴?br> [0015] 本發(fā)明技術方案實現(xiàn)的有益效果：
[0016] 1.經(jīng)濟實用：反應是在恒溫的條件下進行，所以不需要昂貴的儀器，只需要能夠 提供恒溫的設備，比如水浴鍋。
[0017] 2.檢測簡單：直接肉眼觀察反應產(chǎn)物的顏色變化來定性判斷樣品中是否含有待 測物。
[0018] 3.靈敏度高：應用于有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷的檢測，本方法的檢測限為2ng/mL， 比試紙條的靈敏度高。
[0019] 4 :新穎度高：目前國內(nèi)外尚未見有關噬菌體免疫LAMP方法在農(nóng)藥等其他小分子 化合物上的應用報道。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明技術方案的原理示意圖；
[0021] 圖中"1"表示酶標板；"2"表示捕獲抗體；"3"表示分析物；"4"表示噬菌體展示 多肽；"5"表示噬菌體DNA ;"6"表示噬菌體；"7"表示競爭反應過程；"8"表示LAMP擴增產(chǎn) 物；"9"表示LAMP反應前：深藍色；"10"表示LAMP反應后：天藍色；"11"表示LAMP反應；
[0022] 圖2為本發(fā)明對甲基對硫磷標準品檢測在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察結果；
[0023] 圖中：泳道"M"表示2000bpDNA Marker ;泳道"1"表示陰性對照；泳道"2"至"8" 分別表示濃度為8、4、2、1、0. 5、0. 25、0ng/mL甲基對硫磷；泳道"9"表示陽性對照；
[0024] 圖3為本發(fā)明對甲基對硫磷標準品檢測在日光下用肉眼觀察結果；
[0025] 圖中："1"表示陰性對照；2至8分別表示濃度為8、4、2、1、0. 5、0. 25、0ng/mL甲基 對硫磷；"9"表示陽性對照。

【具體實施方式】
[0026] 以下結合附圖詳細描述本發(fā)明的技術方案。本發(fā)明實施例僅用以說明本發(fā)明的技 術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員 應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精 神和范圍,其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。
[0027] 利用能夠與抗有機磷類農(nóng)藥抗體C8/D3識別的噬菌體展示多肽C11-2進行有機磷 農(nóng)藥噬菌體免疫環(huán)等溫擴增檢測，展示在M13噬菌體外殼蛋白上的多肽序列為SEQ ID No. 1 所示序列，其中兩個半胱氨酸殘基之間形成一對分子內(nèi)二硫鍵。
[0028] 使用LAMP引物設計程序PrimerExplorer V4針對噬菌體ssDNA的特異性區(qū)域SEQ ID No. 2所示的序列設計了如下一套引物，包含了 B3 :SEQ ID No. 3所示的序列、F3 :SEQ ID No. 4 所示的序列、BIP(BIc-B2) :SEQ ID No. 5 所示的序列和 FIP(FIc-F2) :SEQ ID No. 6 所示 的序列。
[0029] B3 :5, -ACAAACTACAACGCCTGTA-3'
[0030] F3 :5, -CGCAATTCCTTTAGTGGTAC-3，
[0031] BIP3 :5, -ACTAACGTCTGGAAAGACGACAATTCCACAGACAGCCCTC-3，
[0032] FIP3 :5, -AACAGTTTCGGCCGAACCTCACTCTGCTTGTTCTCCGCCTTG-3，
[0033] 本實施例的同步反應方法中所涉及的各個過程和材料如圖1所示。圖中"1"表示 酶標板；"2"表示捕獲抗體；"3"表示分析物；"4"表示噬菌體展示多肽；"5"表示噬菌體 DNA ;"6"表示噬菌體；"7"表示競爭反應過程；"8"表示LAMP擴增產(chǎn)物；"9"表示LAMP反 應前：深藍色；"10"表示LAMP反應后：天藍色；"11"表示LAMP反應。
[0034] 實施例1 :噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法對有機磷農(nóng)藥標準品的檢測
[0035] 1.有機磷農(nóng)藥標準溶液的配制
[0036] 用甲醇配制表1所列有機磷農(nóng)藥標準品母液（10mg/mL)，用含有20%甲醇的PBS 將母液稀釋成10 μ g/mL至0. 25ng/mL系列濃度用于免疫LAMP檢測。
[0037] 2.噬菌體展示多肽與分析物共同競爭捕獲抗體的結合位點，
[0038] 包被：用PBS緩沖液將抗有機磷類農(nóng)藥抗體C8/D3 (由本實驗制備、貯藏）稀釋為 10 μ g/mL后加入酶標板，每孔100 μ L，37°C孵育2小時；洗板：用洗滌液PBST(0. 05 %吐溫 20,0. 01mol/L，pH7. 4)洗滌5次，吸水紙拍干；封閉：每孔加入300μ LI% BSA，37°C孵育1 小時；洗板：用洗滌液？831'(0.05%吐溫20,0.01111〇1/1，？!17.4)洗滌5次，吸水紙拍干 ；力口 入標準品和噬菌體：分別將50 μ L標準品加入酶標板中，再加入50 μ L的噬菌體，37°C孵育 1小時；洗板：用洗滌液？831'(0.05%吐溫20,0.01111 〇1/1，？!17.4)洗滌5次，吸水紙拍干；洗 脫：每孔加入100 μ L0. 2M pH2. 2甘氨酸鹽酸緩沖液37°C洗脫15分鐘，洗脫后收集洗脫液并 用 1ΜρΗ9· ITris-HCl 進行中和。
[0039] 3.環(huán)介導等溫擴增結合在捕獲抗體上的噬菌體，
[0040] 以FIP、BIP為內(nèi)引物，以F3、B3為外引物對洗脫的噬菌體進行恒溫擴增。其反應 體系為：〇· 64M betaine，ImM dNTPs，2. 5 μ L10 XBst Buffer，8U Bst DNA聚合酶，150 μ Μ羥基 萘酚藍（hydroxynaphthol blue，HNB)，2yL中和后的噬菌體洗脫液，外引物各0·2μΜ，內(nèi) 引物各1. 2μΜ，(ΜΗ20補齊至25μ L。將上述所有試劑混勻置于PCR管中，63°C 60min，80°C lOmin終止反應。
[0041] 4.免疫環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物分析及結果判定，
[0042] 分析方法1 :瓊脂糖凝膠電泳：取3 μ L擴增產(chǎn)物，加入1 μ L上樣緩沖液（購自 TAKARA公司），混勻，在2% (W/V)瓊脂糖凝膠中101V下電泳1小時，用溴化乙錠（ΕΒ)染色 15min后，在凝膠成像系統(tǒng)上成像；
[0043] 分析方法2 :在日光下用肉眼觀察結果。
[0044] 結果判定：在分析方法1中，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察是否有梯形條帶，若 有條帶為陰性，若無條帶為陽性，甲基對硫磷的檢測結果如圖2所示；在分析方法2中，若擴 增產(chǎn)物的顏色變?yōu)樘焖{色則為陰性，若保持深藍色不變?yōu)殛栃?，甲基對硫磷的檢測結果如 圖3所示，使擴增產(chǎn)物保持深藍色或者在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察無梯形條帶的最低 濃度為2ng/mL。
[0045] 本發(fā)明提供的噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法，使擴增產(chǎn)物保持深藍色或者在 凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察無梯形條帶的最低濃度定義為本檢測方法對該分析物的最 低檢測限（L0D)，對23種有機磷農(nóng)藥的檢測結果如表1所示。
[0046] 本發(fā)明提供的噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法，選擇性通過交叉反應率（CR) 進行評價，其計算公式為CR = L0D (甲基對硫磷）/L0D (其他化合物）X 100,選擇性范圍為 甲基對硫磷、對硫磷、殺螟硫磷、殺螟腈、EPN、甲基對氧磷、對氧磷、殺螟氧磷和異氯硫磷，23 種有機磷農(nóng)藥的交叉反應率如表1所示。
[0047] 表1噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法對有機磷農(nóng)藥標準品的檢測結果
[0048]

【權利要求】
1. 一種噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法，其特征包括： 第一步：噬菌體展示多肽與分析物共同競爭捕獲抗體的結合位點， 包被：用PBS緩沖液將抗體稀釋為10 μ g/mL后加入酶標板，每孔100 μ L，37°C孵育2小 時；洗板：用洗滌液PBST (0. 05%吐溫20,0. Olmol/L，pH7. 4)洗滌5次，吸水紙拍干；封閉： 每孔加入300yLl% BSA，37°C孵育1小時；洗板：用洗滌液PBST(0.05%吐溫20,0.01mol/ L，pH7. 4)洗滌5次，吸水紙拍干；加入分析物和噬菌體：每孔加入50 μ L分析物，再加入 50以1^的噬菌體，371：孵育1小時；洗板：用洗滌液？851'(0.05%吐溫20,0.01111〇1/1，？!17.4) 洗滌5次，吸水紙拍干；洗脫：每孔加入100 μ L0. 2Μ ρΗ2. 2甘氨酸鹽酸緩沖液37°C洗脫15 分鐘，洗脫后收集洗脫液并用1ΜρΗ9. ITris-HCl進行中和。 第二步：環(huán)介導等溫擴增結合在捕獲抗體上的噬菌體， 以FIP、BIP為內(nèi)引物，以F3、B3為外引物對洗脫的噬菌體進行恒溫擴增。其反應體系 為：0· 64M betaine，ImM dNTPs，2. 5μ L lOXBst Buffer，8U Bst DNA 聚合酶，150μΜ 羥基萘 酚藍（hydroxynaphthol blue，HNB)，2μ L中和后的噬菌體洗脫液，外引物各0· 2μΜ，內(nèi)引物 各1. 2 μ M，ddH20補齊至25 μ L。將上述所有試劑混勻置于PCR管中，63°C 60min，80°C 10min 終止反應。 第三步：免疫環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物分析及結果判定， 分析方法1 :瓊脂糖凝膠電泳：取3 μ L擴增產(chǎn)物，加入1 μ L上樣緩沖液（購自TAKARA 公司），混勻，在2% (W/V)瓊脂糖凝膠中101V下電泳1小時，用溴化乙錠（ΕΒ)染色15min 后，在凝I父成像系統(tǒng)上成像； 分析方法2 :在日光下用肉眼觀察結果。 結果判定：在分析方法1中，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察是否有梯形條帶，若有條 帶為陰性，若無條帶為陽性。在分析方法2中，若擴增產(chǎn)物的顏色變?yōu)樘焖{色則為陰性，若 保持深藍色不變?yōu)殛栃浴?br> 2. 根據(jù)權利要求1所述的噬菌體免疫環(huán)介導等溫擴增檢測法，其特征在于利用噬菌體 展示多肽，將免疫競爭和環(huán)介導等溫擴增結合，實現(xiàn)對不含有核酸的小分子化合物的環(huán)介 導等溫擴增檢測。
3. 根據(jù)權利要求1和2所述的噬菌體展示多肽為展示在M13噬菌體外殼蛋白上的小分 子模擬表為多肽。
4. 權利要求1所述的環(huán)介導等溫擴增引物是根據(jù)M13噬菌體ssDNA特異性序列設計。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046702SQ201410272493
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月17日 優(yōu)先權日:2014年6月17日
【發(fā)明者】華修德, 王鳴華, 劉鳳權, 施海燕 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學