專利名稱：一種簡易的蛋白回收裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種從電泳后聚丙烯酰銨凝膠中回收蛋白質(zhì)的電洗脫裝置，它的這一功能是通過一套有機(jī)玻璃元件的組合來實現(xiàn)的。
背景技術(shù)：
現(xiàn)階段電洗脫法常用來從聚丙烯酰銨凝膠中回收蛋白質(zhì)，其中最常見的類型為透析袋電洗脫法，該方法的具體步驟為將含有所需蛋白的凝膠區(qū)帶切下，裝入透析袋內(nèi)并加入緩沖液浸泡，再將透析袋浸入緩沖液中進(jìn)行電泳，由此帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)就會向正極方向遷移，離開凝膠進(jìn)入透析袋內(nèi)的緩沖液中，電泳后蛋白質(zhì)就留在透析袋內(nèi)緩沖液中。電洗脫后通一個反向電流(一般持續(xù)幾十秒)，使吸附在透析袋上的樣品進(jìn)入緩沖液，這樣就可以達(dá)到回收凝膠中所需特定大分子的目的。透析袋電洗脫法雖然設(shè)備簡單，但操作比較麻煩且容易失敗，同時存在洗脫后樣品體積較大的弊端，后續(xù)的樣品濃縮給試驗帶來不少麻煩。
目前市場上有各種專門的蛋白電洗脫裝置微量電洗脫儀是一種快速回收電泳后凝膠中蛋白質(zhì)的工具，其配備的離心超濾管能將回收后樣品進(jìn)行濃縮，該儀器操作較方便，不足之處在于每次處理量非常少，僅適合于微量樣品的分離純化。全凝膠洗脫電泳儀具有能夠同時收集凝膠上的多條分子帶的功能，避免了一般繁瑣的切膠洗膠過程而直接將蛋白質(zhì)分子從凝膠中轉(zhuǎn)移到溶液中，比較適合于多個微量組分的分離純化?！癡”字形內(nèi)槽電洗脫回收裝置的原理是利用電洗脫過程中“V”字形內(nèi)槽鹽濃度遠(yuǎn)高于外槽鹽濃度的特點(diǎn)，使樣品在電泳過程中聚集于高低離子濃度界面，從而達(dá)到回收并濃縮所需樣品的目的。它具有洗脫后樣品體積小且不需透析膜的優(yōu)點(diǎn)，但洗脫過程中高鹽緩沖液與低鹽緩沖液是相通的，這給具體操作帶來很大難度，難以達(dá)到理想效果。
以上各種蛋白質(zhì)回收裝置雖然各有所長，但一個共同的缺點(diǎn)是處理的樣品量都非常有限，達(dá)不到大量制備要求；且價格昂貴，以MILLIPORE(密理博)公司的微量電洗脫儀為例，市場價高達(dá)一千美金，其配套的超濾管價格不菲且只能一次性使用，因此使用成本非常高。
實用新型內(nèi)容本實用新型的目的是針對現(xiàn)有各種蛋白回收方法存在的樣品處理量少、回收后需進(jìn)行濃縮且價格昂貴等不足，提供一套簡易的蛋白回收裝置，該裝置可以同時回收多達(dá)6個電泳區(qū)帶蛋白質(zhì)樣品，每次最大處理量達(dá)30ml凝膠。應(yīng)用本裝置可以從SDS-PAGE膠中回收蛋白質(zhì)，用于免疫動物制備抗體或用于基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜分析(MALDI-MS)。
本實用新型的蛋白回收裝置由電洗脫回收槽和6個規(guī)格一致的馬鞍型收集器兩部分組成附圖1中，電洗脫回收槽由緩沖液槽(1)和位于中央的冷卻水箱(2)組成，兩者整合在一起，均由透明有機(jī)玻璃制成。緩沖液槽(1)規(guī)格為250mm×150mm×100mm，處于中央的冷卻水箱(2)規(guī)格為250mm×50mm×40mm，其兩端分別有進(jìn)水口(6)和出水口(7)，使用時與循環(huán)冷卻水器以橡皮管相連接。緩沖液槽(1)兩端分別裝有正電極(3)和負(fù)電極(4)，嵌于緩沖液槽底部的電極絲(5)采用耐電解腐蝕、耐高溫、純度≥99.95％的貴重金屬鉑制造，該電極絲(5)具有良好的導(dǎo)電性能且便于清洗，距離回收槽邊緣15mm。緩沖液槽(1)底嵌有反光鏡(8)。
附圖2中，馬鞍型收集器由透明有機(jī)玻璃制成。由橢圓形上槽(9)及連接的管A(11)和管B(12)組成，橢圓形上槽(9)長80mm，寬15mm，深15mm，兩圓管間距離為55mm，高35mm，其中管A(11)末端與螺母(13)相連，其內(nèi)有兩個橡膠密封圈(14)，橡膠密封圈之間用于放置圓形透析膜(16)。管B(12)末端與膜帽(15)相連，該膜帽(15)用于收集樣品，體積為800ul，膜帽(15)底部同樣有兩個橡膠密封圈(14)，密封圈(14)之間用于放置圓形透析膜(16)。本裝置配備了3.5kD，6-8kD，12-14kD規(guī)格的圓形透析膜(16)，可以根據(jù)需要選擇不同孔徑的膜。
洗脫前將預(yù)先處理好的透析袋(17)緊包于管B(12)末端，用棉線扎緊，將45℃左右、1.0％的瓊脂糖凝膠注滿管B(12)，待膠凝固后取掉透析袋(17)，再套上盛滿洗脫緩沖液的膜帽(15)，洗脫時大分子被收集于膜帽(15)內(nèi)緩沖液中，可以方便地回收以作進(jìn)一步分析和測試用。
本實用新型同時配備了80目、15mm×17mm鋼篩(10)多片，電洗脫時取兩片鋼篩(10)在橢圓形上槽(9)、靠近管B(12)端圍成盛放凝膠塊的小池，這樣能有效縮短洗脫時間并提高蛋白回收率。
本實用新型具有構(gòu)造簡單、操作方便、洗脫時間短、每次處理樣品量大、回收后樣品不必再進(jìn)行濃縮等諸多優(yōu)點(diǎn)，適于微量及大量制備蛋白質(zhì)，其蛋白回收率可達(dá)90％以上。通過移動收集器上槽內(nèi)兩片鋼篩(10)間的距離能調(diào)整本裝置對樣品的處理量，并且可以同時選用多個收集器，達(dá)到在基本相同的試驗條件處理多個樣品的目的。


附圖1為本實用新型的電洗脫回收槽結(jié)構(gòu)示意圖附圖2為本實用新型的馬鞍型收集器示意圖附圖中1緩沖液槽，2冷卻水箱，3正電極，4負(fù)電極，5電極絲，6進(jìn)水口，7出水口，8反光鏡，9橢圓形上槽，10鋼篩，11管A，12管B，13螺母，14橡膠密封圈，15膜帽，16圓形透析膜，17透析袋具體實施例實施例一從SDS-PAGE膠中回收蛋白質(zhì)，用于免疫動物制備抗體。
1、取配套的圓形透析膜(16)及透析袋(17)按常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理，處理方法為在2％的NaHCO3和1m mol/l的EDTA(pH8.0)中煮沸10分鐘，雙蒸水徹底清洗。
2、對收集器各部分進(jìn)行徹底清洗，在螺母(13)及膜帽(15)的兩橡膠密封圈(14)之間放上處理好的圓形透析膜(16)，再旋上螺母(13)，用蒸餾水檢查兩端是否漏水。
3、將處理好的透析袋(17)緊包于管B(12)末端，用棉線扎緊，用45℃左右、1.0％的瓊脂糖凝膠注滿管B(12)，待膠凝固后取掉透析袋(17)，再套上盛滿緩沖液的膜帽(15)，使膜帽(15)內(nèi)緩沖液與管末端瓊脂糖凝膠接觸，注意膜帽內(nèi)不能由氣泡，否則影響洗脫效果。
4、將含有待分離蛋白質(zhì)的凝膠條帶切成碎塊，取兩片配套的80目鋼篩(10)在收集器橢圓形上槽(9)靠近管B(12)端圍成一小槽，兩片鋼篩(10)間距離據(jù)樣品量而定，凝膠碎塊置于小槽后將收集器橫跨于冷卻水箱(2)上，其中管A(11)置于負(fù)極，管B(12)置于正極，在橢圓形收集器上槽(9)內(nèi)加滿電洗脫緩沖液。
5、在緩沖液槽(1)內(nèi)倒入適當(dāng)量的電泳緩沖液，利用回收槽底端反光鏡(8)成像的功能，用自制彎頭巴斯德吸管將收集器兩端圓形透析膜(16)底部氣泡吸掉，選用100-200伏進(jìn)行電洗脫。
6、洗脫時間根據(jù)膠的濃度和蛋白質(zhì)的分子量大小來決定，最后反向接通電源30-60秒使蛋白質(zhì)離開圓形透析膜(16)。
7、洗脫結(jié)束后取下膜帽(15)，用加樣槍反復(fù)吸打5次后吸出含有待回收蛋白質(zhì)的緩沖液至1ml eppendorf離心管，12000RPM高速離心1分鐘以除去可能殘留的瓊脂糖凝膠碎塊，得到的含目的蛋白的溶液可根據(jù)需要直接免疫動物，也可按照常規(guī)的方法濃縮后使用。
8、每次電洗脫后兩圓管端應(yīng)更換圓形透析膜(16)，鋼篩(10)使用后應(yīng)及時清洗。
實施例二純化回收SDS-PAGE凝膠蛋白條帶，應(yīng)用于基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜分析(MALDI-MS)
將SDS-PAGE和本裝置以及MALDI-TOFMS結(jié)合起來在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中相當(dāng)常見，因為這提供了一種快速精確的研究蛋白質(zhì)的方法，而且即便是難以分析的蛋白如疏水膜蛋白或者是高分子量蛋白也可以用這個方法進(jìn)行分離。選用MS緩沖液可以徹底清除SDS，得到高產(chǎn)而不含SDS的蛋白樣品。蛋白純化過程和前面基本相似，得到含有目的蛋白的溶液后需要進(jìn)行以下步驟處理1.加入1/10體積的MS Buffer混勻，室溫靜置15分鐘2.加入1/5體積的50％TCA，4℃度靜置1小時3.4℃14000rpm離心30分鐘，去上清4.加入500ul冰冷的丙酮混合，-20℃處理30分鐘(過夜有助于提高得率)后4℃高速離心30分鐘5.用相應(yīng)的緩沖液重懸沉淀并進(jìn)行后繼的稀釋步驟。
權(quán)利要求1.一種簡易的蛋白回收裝置，其特征是由電洗脫回收槽和六個馬鞍形收集器組成，馬鞍形收集器由橢圓形上槽(9)及兩端連接的管A(11)和管B(12)組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡易蛋白回收裝置，其特征在于收集器的管A(11)末端與螺母(13)相連，螺母(13)內(nèi)兩個橡膠密封圈(14)之間用于放置圓形透析膜(16)；管B(12)用于電洗脫時灌注瓊脂糖凝膠，其末端與膜帽(15)相連，該膜帽(15)用于收集樣品，體積為800ul，膜帽(15)內(nèi)兩個橡膠密封圈(14)之間用于放置圓形透析膜(16)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡易蛋白回收裝置，其特征在于其配備了15×17mm、80目鋼篩(10)多片。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡易蛋白回收裝置，其特征在于其配備了3.5kD，6-8kD，12-14kD三種規(guī)格的圓形透析膜(16)，可以根據(jù)需要選擇不同孔徑的膜。
專利摘要一種簡易的蛋白回收裝置，用于從電泳后聚丙烯酰銨凝膠中回收蛋白質(zhì)，由回收槽和6個規(guī)格一致的馬鞍形收集器組成。其中回收槽中央為冷卻水箱，與回收槽整合在一起，兩端有進(jìn)出水口。馬鞍形收集器由橢圓形上槽及兩端連接的兩個圓管組成，其中管B末端與膜帽相連，膜帽用于收集樣品。該裝置還配備了80目鋼篩多片，用于在收集器上槽靠近管B端圍成盛放凝膠塊的小池，這樣能有效縮短洗脫時間并提高蛋白回收率。該裝置結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，蛋白回收率高達(dá)90％以上，適于推廣應(yīng)用。
文檔編號C07K14/00GK2908495SQ200520052370
公開日2007年6月6日 申請日期2005年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日
發(fā)明者周松華, 汪世平, 李文凱, 彭先楚 申請人:周松華, 汪世平